Funktionsanalyse der mitochondrialen Transportproteine UCP2, UCP3, UCPx und SOUP

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Funktion der mitochondrialen Transportproteine UCP2, UCP3 und UCPx als Protonentransporter bzw. Entkopplerproteine untersucht. Für diese Analysen wurde ein Testsystem etabliert, mit dem ein möglicher Einfluss der Entkopplerproteine auf die Atmung von HEK293-Zellen nach transienter Expression nachgewiesen werden konnte. Da UCP1 das bislang einzige funktionell charakterisierte Mitglied der Entkopplerproteinfamilie ist, wurde das Messverfahren zunächst mit UCP1 transfizierten HEK293-Zellen validiert. Die Expression und Inkorporation von UCP1 und UCP3 in die Mitochondrien von HEK293-Zellen wurde mittels Western-Blots bestätigt. Die Sauerstoffverbrauchsmessungen haben gezeigt, dass die UCP1 transfizierte Zellen nach Inhibition der ATP-Synthase durch Oligomycin eine geringere Kopplung der Atmung zeigten, als die Kontrollzellen. Nach Palmitatzugabe erhöhte sich die Atmungsrate der UCP1-Zellen signifikant. Diese fettsäureabhängige Aktivierung bestätigte die Expression von funktionsfähigem UCP1. Bei den Kontrollen erfolgte keine Steigerung der Atmung nach Fettsäurezugabe. Zellen die mit UCP2, UCP3 und UCPx transfizierten wurden, zeigten weder eine erhöhte entkoppelte Atmung in Anwesenheit von Oligomycin, noch eine durch Fettsäuren induzierte Entkopplung der Atmung. Eine mit UCP1 vergleichbare Entkopplerfunktion von UCP2, UCP3 und UCPx konnte damit nicht bestätigt werden. Des Weiteren wurde ein vermuteter regulatorischer bzw. inhibitorischer Einfluss des mitochondrialen Folat-Carriers SOUP auf die UCP vermittelte Entkopplung, nach Koexpression mit UCPx und UCP1 in HEK293-Zellen geprüft. Die Koexpression von SOUP mit UCPx oder UCP1 hatte allerdings keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung der Zellen bzw. auf die UCP1 vermittelte Entkopplung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die mögliche Bedeutung von UCP3 als Regulator des mitochondrialen Fettsäurestoffwechsels in Dsungarischen Zwerghamstern untersucht, die aufgrund einer bislang unbekannten Mutation ein gewebespezifisches UCP3 Defizit im braunen Fettgewebe besitzen. Für die Analyse wurden Wildtyphamster und Mutanten sieben Tage kälteexponiert, 48 h gefastet oder unter Kontrollbedingungen bei 23°C mit ad libitum Futter gehalten. Von Wildtypen und Mutanten wurde die Genexpression von UCP3, sowie von Schlüsselenzymen des Fettsäurestoffwechsels analysiert, um Hinweise auf eine mögliche Störung des Fettsäurestoffwechsels bei den Mutanten zu erhalten. Analysiert wurde die mRNA-Expression der mitochondrialen Thioesterase-I (MTE-I) und der Carnitin-Palmitoyltransferase-I (CPT-I). Im braunen Fettgewebe von Mutanten konnte weder die UCP3 mRNA, noch das UCP3-Protein mittels Northern bzw Western Blots nachgewiesen werden. Im braunen Fettgewebe von Wildtypen waren keine Unterschiede im mRNA-Spiegel zwischen Kontrollen, gefasteten und kaltakklimatisierten Hamstern feststellbar. Der Proteingehalt bei kälteexponierten Wildtyptieren war allerdings 3-fach höher und bei den gefasteten Tieren tendenziell erniedrigt gegenüber den Kontrollen. Die Analyse mRNA-Expression der MTE-I in Wildtyphamstern und Mutanten hat gezeigt, dass offenbar keine gekoppelte Regulation der Expression der MTE-I und UCP3 im braunen Fettgewebe erfolgt, womit offensichtlich keine direkte funktionelle Kopplung zwischen beiden Proteinen besteht. Es konnte jedoch feststellt werden, dass die Regulation von UCP3 und der MTE-I offenbar abhängig vom Fettsäurestoffwechsel im Gewebe erfolgt. Die mRNA-Expression der CPT-I mRNA im braunen Fettgewebe der Wildtypen und Mutanten war vergleichbar. Demzufolge gab es keine Anzeichen für eine veränderte Regulation oder eine Inhibition des Fettsäureimports in die Mitochondrien der Mutanten. Die Fettsäureoxidationskapazität des braunen Fettgewebes von gefasteten, kaltakklimatisierten und Kontroll-Wildtyphamstern und Mutanten wurde in Gewebeproben in vitro anhand der CO2-Produktion mit Oleat als Substrat ermittelt. Zudem wurde die Fettsäureoxidationskapazität von isolierten Braunfettmitochondrien aus kälteexponierten Wildtyphamstern und Mutanten durch Messung des O2-Verbrauchs in Anwesenheit von Palmitoyl-Carnitin als Substrat bestimmt. Diese Messungen haben ergeben, dass die mitochondriale Fettsäureoxidationskapazität des braunen Fettgewebes offensichtlich nicht durch das Fehlen von UCP3 beeinträchtigt wird. Auch die Messung des Fettsäurestoffwechsels in isolierten Mitochondrien von Wildtypen und Mutanten hat keine eindeutigen Hinweise auf eine Störung der mitochondrialen beta-Oxidation durch das UCP3 Defizit ergeben. Zusammenfassend kann man sagen, dass anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Genexpressionsstudien und in vitro Messungen des Fettsäurestoffwechsels, kein direkter funktioneller Zusammenhang oder ein regulativer Einfluss von UCP3 auf den Fettsäurestoffwechsel bestätigt werden kann

Hypothalamic gene expression profiling in mouse strains susceptible or resistant to diet-induced obesity

Fettleibigkeit hat sich zu einem weltweiten Gesundheitsproblem in der Öffentlichkeit entwickelt. Sie wird durch ein komplexes Ungleichgewicht der Regulation von Appetit und Energiestoffwechsel verursacht, die durch verschiedene Faktoren wie genetische Defekte, Nahrungspräferenzen und Lebensstil kontrolliert werden. Die hochfetthaltige westliche Nahrung ist einer Hauptfaktor, die die Entwicklung von Fettleibigkeit in der menschlichen Bevölkerung fördert. Trotzdem werden nicht alle Konsumenten der Hochfettnahrung fettleibig. In dieser Studie wurden zwei unterschiedliche Mausinzuchtlinien – AKR/J und SWR/J – entweder mit einer hoch fetthaltigen Nahrung oder der Standardnahrung gefüttert. Der AKR/J Stamm repräsentiert ein Mausmodel für diät-induzierte Fettleibigkeit (diet-induced obesity = DIO). Mäuse dieses Stammes wurden fett wenn sie mit der hochfetthaltigen Diät gefüttert wurden, wohingegen sie schlank bei Fütterung mit der Standard-Diät blieben. Im Gegensatz dazu waren die Mäuse des SWR/J Stamm resistent gegenüber der DIO, d.h. es war im Vergleich kein wahrnehmbar Anstieg des Körpergewichts oder von Fettleibigkeit in Mäusen, die mit fetthaltiger Nahrung oder Standard-Diät gefüttert wurden. Genexpressions-Arrays wurden benutzt um differentiell exprimierte Gene im Hypothalamus von AKR/J und SWR/J Mäusen bei fetthaltiger Fütterung zu identifizieren. Um die Kandidatengene, ausgesucht aus der Array Datenanalyse to validieren, wurde Northern Blot Analyse, in situ Hybridisierung und real-time RT-PCR durchgeführt. Hämoglobin alpha, adult chain 1 (Hba-alpha1) ist auf dem Chromosom 11 der Maus (Chromosom 16p13.3 des Menschen) lokalisiert. Die funktionelle Bedeutung der Expression von Hba-alpha1 ist unbekannt. Eventuell erleichtert es den Sauerstofftransport im Gehirn in einer ähnlichen Weise wie das Myoglobin im Skelettmuskel. In dieser Arbeit wurde eine höhere ubiquitäre Expression von Hba-alpha1 im Hirn der SWR/J Maus im Vergleich zur AKR/J Maus beobachtet. Dieser Unterschied könnte mit der höheren Stoffwechselrate der SWR/J Mäuse zusammenhängen. So weit konnte keine direkte Beziehung zwischen Hba-alpha1 Expression und Fettleibigkeit hergestellt werden. Im Gegensatz dazu zeigt die Glyoxalase I (Glo 1) ein spezifisches Expressionsmuster mit stärkster Präsenz im Hippocampus. Im Hypothalamus kann die Glo1 Expression im arquatischen Nukleus (ARC), im ventromedialen hypothalamischen Nukleus (VMH) und im paraventricularen hypothalamischen Nukleus (PVN) detektiert werden. Während die Expression von Glo1 ausserhalb des Hypothalamus ähnlich in beiden Mausstämmen ist, ist die mRNA Expression in der hypothalamischen Region viel stärker in AKR/J im Vergleich zur SWR/J Mäusen. Das Glo1 Gen befindet sich auf Chromosom 17 der Maus (Chr. 6 des Menschen) und an der Entgiftung von Stoffwechselnebenprodukten beteiligt. Außerdem wurde Glo1 auf der Fettleibigkeits-Genkarte vom Menschen verzeichnet und vermutet eine Verbindung zwischen einer abweichenden Expression des Glyoxalase-Systems und Krankheiten wie Krebs und Diabetes. Tumor Nekrose Faktor alpha-induziertes Protein 1 (endothelial) (tumor necrosis factor alpha induced protein 1 (TNFAIP1) ist auf Maus-Chromosom 11(45,10 cM) und Mensch-Chromosom 17q22-q23 lokalisiert. Das Protein ist beim Kalium-Eisen-Transport durch Proteinbindung und bei der Einstellung der spannungsabhängigen Kaliumkanal Aktivitäten involviert. TNFAIP1 lokalisiert sich im ARC, im VMH und PVN. Es wurde durch Hochfett-Diäten in den AKR/J aber nicht SWR/J Mäusen hochreguliert, was an den Filterarrays und den Northern Blots, aber nicht mit der real-time RT-PCR und in situ Hybridisierungen gezeigt werden konnte. Obwohl bei der in situ Hybridisierung eine 1,6fache Steigerung der mRNA Expression im ARC und VMH durch die Hochfettdiät beobachtet werden konnte, war diese Steigerung aufgrund individueller Variationen nicht signifikant. Weitere Experimente mit höherer Stichprobenzahl müssten durchgeführt werden um dieses Ergebnis zu bestätigen. Weil es sich um ein neu annotiertes Gen handelt, ist nicht viel über die pathologische Relevanz bekannt. Bisher hat keine Studie eine Verbindung zwischen TNFAIP1 und Fettleibigkeit beschrieben. Es wird angenommen, dass TNFalpha einen Einfluss auf Körpergewichtsregulation hat und wahrscheinlich durch einen lokalen Prozess im Fettgewebe wirkt. Möglicherweise führt eine erhöhte Sekretion von TNFalpha aus Adipozyten in fettleibigen Versuchstieren/-personen zu einer Induktion von TNFAIP1 im Hypothalamus. Weitere Studien sollten durchgeführt werden um die Funktion von TNFAIP1 im Gehirn aufzuklären

Identification and characterization of neuroendocrine pathways involved in the regulation of seasonal body weight cycles

Die vorliegende Dissertation beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung von neuroendokrinen Signalwegen, die in die saisonale Körpergewichtsregulation involviert sind. Die vorliegenden Untersuchungen liefern neue Befunde über die Bedeutung des zentralen hypothalamischen Signalweges, der die Interaktion von Photoperiode und Leptin auf die saisonale Anpassung des Dsungarischen Hamsters vermittelt. Die erste Studie (Kapitel 2) konzentriert sich auf die Verteilung und Charakterisierung von ausgewählten Neuropeptiden (CART, MCH, OXB), die in der Regulation der Energiebalance eine Rolle spielen. Es scheint eine neuroanatomische Grundlage für ein neuronales CART-MCH-OXB System zu geben, das indirekt die Erzeugung der ciradianen Rhythmik beeinflusst. Die zweite Studie (Kapitel 3) beschäftigte sich mit einer möglichen Interaktion zwischen den neuropeptidhaltigen Neuronen (OXB) und dem Hauptsignalweg, dem geniculohypothalamischen Tractus. Dieser Hauptsignalweg gesteht aus NPY-enthaltenen Neuronen im IGL. OXB-ir Fasern innervieren dort die NPY Neuronen. Dies deutet auf die Existenz eines Rückkopplungsmechanismus von Neuropeptiden auf das circadiane Zeitgebersystem hin. In Kaptitel IV wurde der Effekt der saisonalen Anpassung auf die Expression von CART untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie offenbarten eine erhöhte Anzahl von CART ir Zellen innerhalb des rostralen und ventromedialen ARC. Diese Region spielt bei Tierarten wie Ratte und Maus eine wichtige Rolle bei der Vermittlung eines inhibitorischen Effektes von Leptin auf die Nahrungsaufnahme. Deshalb haben wir uns im Kapitel V auf die Identifizierung der hypothalamischen Strukturen konzentriert, die den Effekt von Leptin im Dsungarischen Hamster vermitteln. Diese Studie ergab, dass Leptin die zelluläre Antwort (Induktion von fos) in mehreren hypothalmischen Strukturen induziert. Hierzu gehören auch die Strukturen der rostralen und ventrolateralen Region des ARC (peri-ARC). Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass der ARC als zentrales anatomisches Integrationszentrum für Körperfett und photoperiodische Information, die Energiebilanz im Dsungarischen Hamster reguliert. Der Schlussteil der Arbeit umfasst eine generelle Disksussion der Ergebnisse und einen Ausblick auf zukünftige mögliche Studien

Genetic boosting classification for malware detection

In the last few years virus writers have made use of new obfuscation techniques with the aim of hindering malware in order to difficult their detection by Anti-Virus engines. Strategies to reverse this trend involve executing potentially malicious programs and monitor the actions they perform in runtime, what is known as dynamic analysis. In this paper we present a method able to reach a high accuracy rate without using this kind of analysis. Instead we use a static analysis approach, which discards those samples that cannot be classified with enough certainty and need, certainly, a dynamic analysis. The K-means clustering algorithm has been used to group samples into regions according to their features. Then a boosting process, guided by a genetic algorithm, is executed in each region that are evaluated using a test dataset discarding those regions which do not reach a minimum accuracy threshold

Mycobacterium tuberculosis Complex Lipid Virulence Factors Preserved in the 17,000 Year Old Skeleton of an Extinct Bison, Bison antiquus

Tracing the evolution of ancient diseases depends on the availability and accessibility of suitable biomarkers in archaeological specimens. DNA is potentially information-rich but it depends on a favourable environment for preservation. In the case of the major mycobacterial pathogens, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, robust lipid biomarkers are established as alternatives or complements to DNA analyses. A DNA report, a decade ago, suggested that a 17,000 year old skeleton of extinct Bison antiquus, from Natural Trap Cave, Wyoming, was the oldest known case of tuberculosis. In the current study, key mycobacterial lipid virulence factor biomarkers were detected in the same two samples from this bison. Fluorescence high-performance liquid chromatography (HPLC) indicated the presence of mycolic acids of the mycobacterial type, but they were degraded and could not be precisely correlated with tuberculosis. However, pristine profiles of C29, C30 and C32 mycocerosates and C27 mycolipenates, typical of the Mycobacterium tuberculosis complex, were recorded by negative ion chemical ionization gas chromatography mass spectrometry of pentafluorobenzyl ester derivatives. These findings were supported by the detection of C34 and C36 phthiocerols, which are usually esterified to the mycocerosates. The existence of Pleistocene tuberculosis in the Americas is confirmed and there are many even older animal bones with well-characterised tuberculous lesions similar to those on the analysed sample. In the absence of any evidence of tuberculosis in human skeletons older than 9,000 years BP, the hypothesis that this disease evolved as a zoonosis, before transfer to humans, is given detailed consideration and discussion

Plasma Perturbations and Cosmic Microwave Background Anisotropy in the Linearly Expanding Milne-like Universe

We expose the scenarios of primordial baryon-photon plasma evolution within the framework of the Milne-like universe models. Recently, such models find a second wind and promise an inflation-free solution of a lot of cosmological puzzles including the cosmological constant one. Metric tensor perturbations are considered using the five-vectors theory of gravity admitting the Friedmann equation satisfied up to some constant. The Cosmic Microwave Background (CMB) spectrum is calculated qualitatively.Comment: 20 page

Neocortex expansion is linked to size variations in gene families with chemotaxis, cell–cell signalling and immune response functions in mammals

Increased brain size is thought to have played an important role in the evolution of mammals and is a highly variable trait across lineages. Variations in brain size are closely linked to corresponding variations in the size of the neocortex, a distinct mammalian evolutionary innovation. The genomic features that explain and/or accompany variations in the relative size of the neocortex remain unknown. By comparing the genomes of 28 mammalian species, we show that neocortical expansion relative to the rest of the brain is associated with variations in gene family size (GFS) of gene families that are significantly enriched in biological functions associated with chemotaxis, cell–cell signalling and immune response. Importantly, we find that previously reported GFS variations associated with increased brain size are largely accounted for by the stronger link between neocortex expansion and variations in the size of gene families. Moreover, genes within these families are more prominently expressed in the human neocortex during early compared with adult development. These results suggest that changes in GFS underlie morphological adaptations during brain evolution in mammalian lineage

Ewing sarcoma of the mandible mimicking an odontogenic abscess – a case report

Ewing sarcoma (ES) of the mandible is rare and can be mistaken for inflammation of dental origin. We present a 24-year old male patient which underwent radical tumour surgery and primary reconstruction with a microvascular osteoseptocutaneous free fibular flap as well as postoperative adjuvant chemotherapy. Incomplete osseous tumour resection required a second intervention. This case report recapitulates the clinical and histopathological findings in oral ES, demonstrates its sometimes difficult diagnosis and discusses the (dis-)advantages of primary osseous reconstruction in ablative tumour surgery

In Vitro Assembly of Multiple DNA Fragments Using Successive Hybridization

Construction of recombinant DNA from multiple fragments is widely required in molecular biology, especially for synthetic biology purposes. Here we describe a new method, successive hybridization assembling (SHA) which can rapidly do this in a single reaction in vitro. In SHA, DNA fragments are prepared to overlap one after another, so after simple denaturation-renaturation treatment they hybridize in a successive manner and thereby assemble into a recombinant molecule. In contrast to traditional methods, SHA eliminates the need for restriction enzymes, DNA ligases and recombinases, and is sequence-independent. We first demonstrated its feasibility by constructing plasmids from 4, 6 and 8 fragments with high efficiencies, and then applied it to constructing a customized vector and two artificial pathways. As SHA is robust, easy to use and can tolerate repeat sequences, we expect it to be a powerful tool in synthetic biology