PCR múltiple para la detección simultánea de los genes mecA y pvl en Staphylococcus spp

Este estudio observacional descriptivo de corte transverso tuvo por objetivo estandarizar una PCR múltiple para la detección simultánea de los genes mecA y pvl en Staphylococcus spp. Se emplearon como cepas control: S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 43300 y un aislado de S. aureus portador de los genes mecA y pvl. La extracción de ADN se realizó por el método de ebullición. El límite de detección se estableció por medio de diluciones seriadas de ADN. Se determinó la aplicabilidad de la PCR múltiple testando 41 aislados de S. aureus y 51 Estafilococos coagulasa negativo (ECN) previamente caracterizados por métodos fenotípicos en noviembre del año 2009. Los productos de PCR fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% previa tinción con bromuro de etidio. Los productos de amplificación de la PCR múltiple presentaron tamaño esperado de 533pb y 433pb para los genes mecA y pvl respectivamente, con límites de detección de hasta 0,5 ng/μL. El gen mecA se detectó en 13 (31,7%) aislados de S. aureus y en 29 (56,7%) ECN. El gen pvl se detectó en 2 (4,9%) S. aureus y no fue detectado en ECN. La presencia del gen mecA tuvo 100% de concordancia con los métodos fenotípicos. Esta técnica es una herramienta útil en la confirmación de cepas de Estafilococos meticilino resistentes e identificación del gen pvl, además de ser relativamente sencilla con la ventaja de detectar ambos genes en una sola reacción

Frecuencia de genes que codifican factores de virulencia en Staphylococcus aureus aislados de niños que concurrieron al Hospital General Pediátrico Niños de Acosta Ñú, durante el año 2010

Staphylococcus aureus es un microorganismo con habilidad de infectar diferentes tejidos celulares, por portar genes que le confieren resistencia a antibióticos, factores de virulencia y su plasticidad genética, que podrían contribuir a una progresión rápida y complicada de la enfermedad. El Paraguay no cuenta con datos epidemiológicos que indiquen los factores de virulencia que presentan las cepas de S. aureus, por lo que el objetivo del trabajo fue determinar un perfil de virulencia detectando los genes codificantes de: hemolisinas α y β, enterotoxinas A, B, C, D, H y toxinas exfoliativas A y B. Este estudio observacional descriptivo de corte transverso, con muestreo no probabilístico de casos consecutivos, incluyó 50 aislados de S. aureus obtenidos a partir de muestras clínicas de secreciones de piel, partes blandas o líquidos corporales de pacientes menores de 17 años que concurrieron al Hospital General Pediátrico Niños de Acosta Ñú durante el año 2.010. Las reacciones de PCR incluyeron la detección de los genes: sea+seb+sec+ADNr16S, hlA+hlB, eta+etb, sed y seh. El 82% de los aislados provenía de niños que presentaron cuadros clínicos compatibles con infecciones de piel y partes blandas y el 18% de cuadros clínicos graves como sepsis, osteomielitis y neumonías. Los aislados contaban con datos de portación de Leucocidina de Panton-Valentine, el cual fue el factor de virulencia más frecuentemente detectado (58%), seguido de las hemolisinas alfa (16%) y beta (8%). Las enterotoxinas y las toxinas exfoliativas fueron menos frecuentes (0-2%), y no se detectaron genes codificantes de las enterotoxinas C y D

Molecular Characterization of Staphylococcus aureus Isolates Obtained from Hemodialyzed Patients at the Hospital de Clínicas of Paraguay: A pilot study

Background: Patients undergoing hemodialysis are susceptible to the nasal carriage of Staphylococcus aureus, increasing the risk of developing infections associated with higher morbidity and mortality. The objective of this study was to describe the frequency of S. aureus carriage in hemodialysis patients and to perform molecular analysis of isolates by applying multiple-locus variable analysis. Methods: We conducted a descriptive cross sectional study with non-probabilistic sampling that included 28 hemodialysis patients attending the Nephrology Department of Hospital de Clínicas in Asunción, Paraguay. We obtained clinical data from medical records and interviews with patients. Nasal swabs were collected and analyzed by microbiological and molecular methods. Results: The frequency of S. aureus carriage was 50% (14/28), 93% of which (13/14) were methicillin resistant, 57% (6/14) were gentamicin resistant and 36% (5/14) were resistant to more than 4 antibiotic classes. S. aureus carriers showed higher frequency of rhinitis (p=0.02 odds ratio [OR]=6.6 (1.2- 34.4)). Seven methicillin-resistant S. aureus isolates had been analyzed by multiple-locus variable analysis, two of them showed identical pattern bands. Conclusion: We found a high frequency of methicillin-resistant Staphylococcus aureus colonization and the presence of two isolates with identical profile in the multiple-locus variable analysis indicating the possibility of transmission between patients

Estandarización del análisis multi-locus de número variable de repeticiones en tándem para el estudio de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aislados de la comunidad en Paraguay

Staphylococcus aureus is a pathogen that can produce several infections with a wide range of severity and it has the hability to adapt to different tissues. The epidemiology is complex, by circulation of many differents clones worlwide, so the analysis for its identification requires reproducible and high discriminatory powder molecular methods. The aim of this study was to standardize the molecular technique multiple-locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) for the genetic variability analysis of S. aureus isolates, previously characterized by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The MLVA was made by PCR amplification of seven VNTR locus (clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, sspA y spA). A high level of reproducibility has reached in the study. The use of isolates previously typified by multi-locus secuencing typing (MLST), PFGE, locus spa and cassette SCCmec, allowed to validate the MLVA clusters comparatively. The isolates that were clustered by MLVA as the same isolate, showed the same results by other molecular techniques, and the MLVA can distinguish isolates with identical PFGE patterns. This technique have all criteria of a usefull molecular typification technique. Staphylococcus aureus es un patógeno capaz de causar infecciones con amplio rango de severidad y adaptarse a diferentes tejidos. Su epidemiología es compleja, por circulación de cientos de clones a nivel mundial, lo que requiere de métodos moleculares reproducibles y de alto poder discriminatorio para la identificación de los mismos. El presente estudio tuvo como objetivo principal la estandarización del análisis multi-locus de número variable de repeticiones en tándem (MLVA) para análisis de variabilidad genética de aislados de S. aureus previamente tipificados por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), gold standard para tipificación de aislados. La MLVA se realizó por amplificación de 7 locus VNTR (clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, sspA y spA) por PCR. Se alcanzó un alto nivel de reproducibilidad. El empleo de cepas previamente tipificadas por análisis de secuencias multi-locus (MLST), PFGE, locus spa y cassette SCCmec, permitió validar de forma comparativa el agrupamiento generado por MLVA. Los aislados que fueron agrupados como idénticos por MLVA presentaron resultados congruentes con la totalidad de las otras técnicas moleculares y ésta demostró ser más sensible que PFGE para distinguir entre aislados que presentaron patrones PFGE idénticos. La MLVA cumple todos los criterios de un método de tipificación útil

Genomic epidemiology of the primary methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones causing invasive infections in Paraguayan children

Address correspondence to Fátima Rodríguez, [email protected] Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major human pathogens. It could carry numerous resistance genes and virulence factors in its genome, some of which are related to the severity of the infection. An observational, descriptive, cross-sectional study was designed to molecularly analyze MRSA isolates that cause invasive infections in Paraguayan children from 2009 to 2013. Ten representative MRSA isolates of the main clonal complex identified were analyzed with short-read paired-end sequencing and assessed for the virulome, resistome, and phylogenetic relationships. All the genetically linked MRSA isolates were recovered from diverse clinical sources, patients, and hospitals at broad gap periods. The pan-genomic analysis of these clones revealed three major and different clonal complexes (CC30, CC5, and CC8), each composed of clones closely related to each other. The CC30 genomes prove to be a successful clone, strongly installed and disseminated throughout our country, and closely related to other CC30 public genomes from the region and the world. The CC5 shows the highest genetic variability, and the CC8 carried the complete arginine catabolic mobile element (ACME), closely related to the USA300-NAE-ACME+, identified as the major cause of CA-MRSA infections in North America. Multiple virulence and resistance genes were identified for the first time in this study, highlighting the complex virulence profiles of MRSA circulating in the country. This study opens a wide range of new possibilities for future projects and trials to improve the existing knowledge on the epidemiology of MRSA circulating in Paraguay.Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPrograma Paraguayo para el Desarrollo de la Ciencia y Tecnología. Financiamiento para la vinculación de científicos y tecnólogo

Bovine reservoir of STEC and EPEC: advances and new contributions

Shiga toxin-producing E. coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) are diarrheagenic E. coli. While EPEC produce only diarrhea, STEC are a causal agent of Hemolytic Uremic Syndrome (HUS) in humans. Those pathotypes are zoonotic pathogens, transferred to humans through contaminated food and water, direct animal or environmental contact, and the bovine is the main reservoir, shedding in their feces those bacteria that could contaminate the environment and the derived foods. The One Health concept is applicable to those bacteria because the health of human is related to health of animals and their environments. This chapter discusses the finding of the last 5 years regarding virulence factors, serotypes, pathogenicity islands, and prevalence in cattle. In addition, the resistance mechanisms and survival strategies of STEC are also included. Prevention and control of the bovine with several strategies including animal handling, probiotics, and vaccines are also explained.Fil: Padola, Nora Lía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; Argentina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva; ArgentinaFil: Castro, Vinicius. University Of Lethbridge; CanadáFil: Etcheverría, Analía Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; Argentina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Sanidad Animal y Medicina Preventiva; ArgentinaFil: Figueiredo, Eduardo. Universidade Federal Do Mato Grosso;Fil: Guillén Fretes, Rosa María. Universidad Nacional de Asunción; ParaguayFil: Umpiérrez, Ana. Instituto de Investigaciones Biológicas "Clemente Estable"; Urugua

Multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis standardization for community isolates methicilineresistant Staphylococcus aureus study in Paraguay

Staphylococcus aureus es un patógeno capaz de causar infecciones con amplio rango de severidad y adaptarse a diferentes tejidos. Su epidemiología es compleja, por circulación de cientos de clones a nivel mundial, lo que requiere de métodos moleculares reproducibles y de alto poder discriminatorio para la identificación de los mismos.El presente estudio tuvo como objetivo principal la estandarización del análisis multi-locus de número variable de repeticiones en tándem (MLVA) para análisis de variabilidad genética de aislados de S. aureus previamente tipificados por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), gold standard para tipificación de aislados. La MLVA se realizó por amplificación de 7 locus VNTR (clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, sspA y spA) por PCR. Se alcanzó un alto nivel de reproducibilidad. El empleo de cepas previamente tipificadas por análisis de secuencias multi-locus (MLST), PFGE, locus spa y cassette SCCmec, permitió validar de forma comparativa el agrupamiento generado por MLVA. Los aislados que fueron agrupados como idénticos por MLVA presentaron resultados congruentes con la totalidad de las otras técnicas moleculares y esta demostró ser más sensible que PFGE para distinguir entre aislados que presentaron patrones PFGE idénticos. La MLVA cumple todos los criterios de un método de tipificación útil.Staphylococcus aureus is a pathogen that can produce several infections with a wide range of severity and it has the hability to adapt to different tissues. The epidemiology is complex, by circulation of many differents clones worlwide, so the analysis for its identification requires reproducible and high discriminatory powder molecular methods. The aim of this study was to standardize the molecular technique multiple-locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) for the genetic variability analysis of S. aureus isolates, previously characterized by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The MLVA was made by PCR amplification of seven VNTR locus (clfA, clfB, sdrC, sdrD, sdrE, sspA y spA). A high level of reproducibility has reached in the study. The use of isolates previously typified by multi-locus secuencing typing (MLST), PFGE, locus spa and cassette SCCmec, allowed to validate the MLVA clusters comparatively. The isolates that were clustered by MLVA as the same isolate, showed the same results by other molecular techniques, and the MLVA can distinguish isolates with identical PFGE patterns. This technique have all criteria of a usefull molecular typification technique.Fil: Rodríguez-Acosta, Fátima. Universidad Nacional de Asunción; ParaguayFil: Fernández, Silvina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaFil: Haim, Maria Sol. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Mollerach, Marta Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Basualdo, Wilma. Hospital General Pediátrico Niños de Acosta Ñú; ParaguayFil: Castro, Héctor. Hospital General Pediátrico Niños de Acosta Ñú; ParaguayFil: Quiñónez, Beatriz. Hospital General Pediátrico Niños de Acosta Ñú; ParaguayFil: Guillén Fretes, Rosa María. Universidad Nacional de Asunción; Paragua

Molecular characterization of Shiga toxin producing Escherichia coli isolated from 2 livestock establishments of Paraguay

Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (R.M. Guillén Fretes).Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno de importancia alimentaria en los humanos, el bovino es su principal reservorio. El objetivo de este estudio fue determinar la portación de STEC en bovinos del Paraguay y analizar el perfil de virulencia y los serotipos de los aislados reunidos. Se estudiaron 197 muestras de hisopado rectal de bovinos y un promedio de 5 a 50 colonias por bovino positivo a genes stx1/stx2. Se amplificaron por PCR los genes stx1, stx2, saa, ehxA y eae. El 84,8% de los bovinos resultaron portadores de STEC. Los perfiles de virulencia predominantes fueron stx2 y stx2/saa/ehxA. La serotipificación se realizó por reacciones de aglutinación en 60 aislamientos seleccionados, se encontró un aislamiento del serogrupo O103, capaz de producir infecciones en humanos. Este trabajo muestra los primeros datos de portación de STEC de ganado bovino paraguayo y señala la necesidad de efectuar otros estudios con mayor cobertura territorial, para lograr una visión completa de este fenómeno.Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a food-borne pathogen in humans, with cattle being the main reservoir. The objective of this study was to determine the carrying of STEC in Paraguayan bovines and to analyze the virulence profile and serotypes of these isolates. A total of 197 samples of bovine fecal samples and an average of 5 to 50 colonies from stx1/stx2positive samples were studied. The stx1, stx2, saa, ehxA and eae genes were amplifiedby PCR. 84.8% of the cattle were carriers of STEC. The predominant virulence profiles were stx2and stx2/saa/ehxA. The serotyping was performed by agglutination reactions for 60 selectedisolates, resulting in isolation of serogroup O103, which could produce infections in humans.This work shows the first data of STEC carriers in Paraguayan cattle, and indicates the need forother studies with greater territorial coverage for a complete vision of this phenomenon.Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPrograma Paraguayo para el Desarrollo de la Ciencia y Tecnología. Proyectos de investigación y desarroll