Conséquences pathologiques des expansions CTG sur le système nerveux central d'un modèle murin de la dystrophie myotonique de Steinert (approches moléculaires, protéomiques et cellulaires)

La dystrophie myotonique de type I (DM1) constitue la plus fréquente des pathologies musculaires héréditaires chez l adulte. Bien qu initialement considérée comme une maladie musculaire, la DM1 présente une atteinte neurologique très handicapante. Cette maladie autosomique dominante résulte de l expansion anormale d un triplet CTG dans la partie 3 UTR du gène DMPK. Un effet trans du transcrit DMPK muté entraine une dérégulation de l épissage alternatif dans de nombreux tissus. Cependant, les mécanismes pathologiques de la DM1 dans le cerveau restent encore peu compris. Afin de disséquer ce mécanisme, notre laboratoire a créé des souris transgéniques exprimant le transcrit DMPK avec de larges expansions CUG dans de nombreux tissus. Ces souris nommées DMSXL, recréent d importants aspects pathologiques de la DM1, comme des anomalies du comportement et électrophysiologiques du cerveau. Elles représentent donc un excellent outil pour explorer l effet pathologique de la mutation dans le SNC. En m appuyant sur ce modèle, j ai exploré dans un premier temps l effet trans des ARNs toxiques et l ampleur de la splicéopathie dans le SNC. De façon intéressante, certains défauts d épissage sont régions spécifiques, et ne montrent pas d aggravation avec l âge des souris DMSXL. Mes résultats démontrent que les ARNs mutés sont capables de déréguler l épissage alternatif dans l ensemble du SNC. La région du cervelet a aussi montré des anomalies de l épissage dans les souris DMSXL, qui, en plus, présentent des perturbations cognitives dépendantes de cette région cérébrale. Le cervelet des souris DMSXL présente aussi des déficits électrophysiologiques suggérant une dysfonction cérébelleuse et plus précisément une dysfonction des cellules de Purkinje. Dans la recherche des populations cellulaires les plus affectées dans le cervelet, j ai démontré la présence de signes de la toxicité de l ARN plus marqués dans la glie de Bergman, entourant les cellules de Purkinje. Pour trouver les voies moléculaires perturbées dans le cervelet, et disséquer le mécanisme derrière les anomalies observées, j ai réalisé une approche protéomique globale et trouvé une sévère baisse de l expression du transporteur glial de glutamate GLT1/EAAT2, suggérant une dysfonction du cervelet, en conséquence d un possible métabolisme anormal du glutamate. L analyse protéomique globale du cerveau des souris DM1 a aussi identifié des différences d expression et des modifications post-traductionnelles de protéines impliquées dans la signalisation du calcium. L étude du métabolisme des ARNm dans la DM1 a mis en évidence la dérégulation de l épissage de gènes impliqués dans le métabolisme du calcium, soutenant l hypothèse d une dysfonction calcique dans le SNC. Pour étudier les conséquences de la mutation sur les variations calciques cellulaires, j ai caractérisé un modèle cellulaire astrocytaire de la DM1. Ce modèle m a permis de démontrer une localisation anormale du récepteur GRIN1/NMDAR1, ainsi qu une réponse calcique anormale dans les astrocytes primaires porteurs des amplifications CTG. Malgré les avancés thérapeutiques dans le muscle, on ne sait pas à quel point les stratégies en cours de développement sont efficaces dans le SNC. Pour étudier ce problème, j ai utilisé le modèle astrocytaire de la DM1 afin de valider in cellulo une stratégie thérapeutique qui vise à rétablir une activité normale du facteur d épissage MBNL1 endogène. Mes travaux de thèse ont permis d avancer dans la compréhension de la neuropathologie de la DM1. Ils ont mis en évidence pour la première fois une dysfonction du cervelet, ainsi que la possible dérégulation de la voix calcique dans le SNC. Mes résultats ont donc contribué à mieux comprendre le mécanisme de la DM1 dans le SNC, pour, à long terme, développer des approches thérapeutiques ciblant des évènements moléculaires précis.Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most frequent inherited muscular disorder in adults. Although traditionally regarded as a muscle disease, DM1 presents debilitating neurological manifestations. DM1 is an autosomic dominant disease caused by the abnormal expansion of a CTG triplet within the 3 UTR of the DMPK gene. Many molecular aspects of the DM1 are mediated by a trans effect of the expanded DMPK transcripts, whose accumulation leads to splicing deregulation in many tissues. Despite recent progress in the understanding of DM1 pathogenesis in muscle and central nervous system (CNS), the detailed molecular disease mechanism operating in the brain is still poorly understood. In order to investigate the pathophysiology, our laboratory has generated DMSXL transgenic mice expressing DMPK transcripts containing large CUG expansions in many tissues. DMSXL mice mimic important features of the DM1, notably in the CNS, showing behaviour as well as electrophysiological abnormalities. Therefore, this mouse line represents an excellent tool to investigate the toxic effects of the mutation in the CNS. Taking advantages of this transgenic model, I have first explored the trans effect of the toxic RNA and the extent of DM1-associated spliceopathy in the CNS. Interestingly, some splicing defects were region-specific, and their severity did not increase with the age of the DMSXL mice. My data demonstrate that CUG-containing RNAs have a wide deleterious effect and deregulate alternative splicing in many areas of the CNS. In addition to splicing abnormalities in cerebellum, DMSXL mice also displayed deficits in cerebellum-dependant motor coordination. Plus, DMSXL cerebellum showed electrophysiological abnormalities, suggesting cerebellar dysfunction and more precisely Purkinje cell dysfunction. In the search for the cellular populations showing the greatest susceptibility to RNA toxicity in the cerebellum, I have found extensive foci accumulation as well as pronounced splicing defects in the Bergman glia, surrounding Purkinje cells, in DMSXL and DM1 patients cerebellum. In order to identify molecular pathways and mechanisms behind the behaviour and electrophysiological abnormalities detected, I have performed a global proteomics approach and found a severe decrease in the expression of a glial glutamate transporter GLT1/EAAT2, suggesting that DM1 causes cerebellum dysfunction, through abnormal glutamate metabolism. Global proteomic analysis of DMSXL cerebellum also identified expression and post-translational changes of several proteins involved in calcium signalling. Missplicing of different transcripts involved in calcium metabolism reinforces the idea of calcium dysfunction in the neuropathogenesis of the DM1. To study the effects of toxic RNA on calcium homeostasis and flux, I have established and characterised a brain cell model of DM1. DMSXL primary astrocyte cultures allowed me to show the mislocalisation of the glutamate receptor GRIN1/NMDAR1, as well as abnormal calcium responses to stimulation. Despite recent therapeutic advances in muscle, we do not know the CNS efficiency of the therapeutic strategies currently being developed. To address this problem, I have used the DM1 astrocyte cell model to validate in cellulo a therapeutic strategy aiming to restore the activity of the endogenous splicing factor MBNL1. My thesis work provided a significant step in the understanding of the DM1 pathology in the CNS. My results revealed for the first time signs of cerebellum dysfunction in DM1, as well as signs of calcium homeostasis deregulation in the SNC. My work contributed to better understand the pathological mechanisms of DM1, the brain pathways and cell types most susceptible to toxic RNA. In the long term, my data will contribute to the rational development of therapeutic strategies targeting precise and deleterious molecular events.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

CTG Trinucleotide Repeat “Big Jumps”: Large Expansions, Small Mice

Trinucleotide repeat expansions are the genetic cause of numerous human diseases, including fragile X mental retardation, Huntington disease, and myotonic dystrophy type 1. Disease severity and age of onset are critically linked to expansion size. Previous mouse models of repeat instability have not recreated large intergenerational expansions (“big jumps”), observed when the repeat is transmitted from one generation to the next, and have never attained the very large tract lengths possible in humans. Here, we describe dramatic intergenerational CTG•CAG repeat expansions of several hundred repeats in a transgenic mouse model of myotonic dystrophy type 1, resulting in increasingly severe phenotypic and molecular abnormalities. Homozygous mice carrying over 700 trinucleotide repeats on both alleles display severely reduced body size and splicing abnormalities, notably in the central nervous system. Our findings demonstrate that large intergenerational trinucleotide repeat expansions can be recreated in mice, and endorse the use of transgenic mouse models to refine our understanding of triplet repeat expansion and the resulting pathogenesis

CRISPR/Cas9-induced (CTG⋅CAG)n repeat instability in the myotonic dystrophy type 1 locus: implications for therapeutic genome editing

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by (CTG⋅CAG)n-repeat expansion within the DMPK gene and thought to be mediated by a toxic RNA gain of function. Current attempts to develop therapy for this disease mainly aim at destroying or blocking abnormal properties of mutant DMPK (CUG)n RNA. Here, we explored a DNA-directed strategy and demonstrate that single clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-cleavage in either its 5′ or 3′ unique flank promotes uncontrollable deletion of large segments from the expanded trinucleotide repeat, rather than formation of short indels usually seen after double-strand break repair. Complete and precise excision of the repeat tract from normal and large expanded DMPK alleles in myoblasts from unaffected individuals, DM1 patients, and a DM1 mouse model could be achieved at high frequency by dual CRISPR/Cas9-cleavage at either side of the (CTG⋅CAG)n sequence. Importantly, removal of the repeat appeared to have no detrimental effects on the expression of genes in the DM1 locus. Moreover, myogenic capacity, nucleocytoplasmic distribution, and abnormal RNP-binding behavior of transcripts from the edited DMPK gene were normalized. Dual sgRNA-guided excision of the (CTG⋅CAG)n tract by CRISPR/Cas9 technology is applicable for developing isogenic cell lines for research and may provide new therapeutic opportunities for patients with DM1

Instabilité des triplets répétés CTG dans la dystrophie myotonique de Steinert (rôle des protéines MSH2 et MSH3)

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

The flash-small-pool PCR: how to transform blotting and numerous hybridization steps into a simple denatured PCR

International audienceNumerous human diseases are associated with abnormal expansion of unstable trinucleotide repeats (TNRs). TNR instability mechanisms are complex, and remain only partially understood. Small-pool-PCR (SP-PCR) is the reference method to assess TNR instability. SP-PCR amplifies a low number of DNA molecules and is followed by Southern blot. However, SP-PCR remains expensive and time consuming. Here, we describe an optimized SP-PCR that can be done in a day, which reduces cost and experimental biases: the flash-small-pool PCR (FSP-PCR). This method consists of a fluorescent PCR on a few DNA molecules, followed by an alkaline gel electrophoresis revealed with a near infra-red detector system. With reduced experimental steps, cost, and time consumption, microsatellite analysis will become more accessible due to FSP-PC

DM1 Phenotype Variability and Triplet Repeat Instability: Challenges in the Development of New Therapies

International audienceMyotonic dystrophy type 1 (DM1) is a complex neuromuscular disease caused by an unstable cytosine thymine guanine (CTG) repeat expansion in the DMPK gene. This disease is characterized by high clinical and genetic variability, leading to some difficulties in the diagnosis and prognosis of DM1. Better understanding the origin of this variability is important for developing new challenging therapies and, in particular, for progressing on the path of personalized treatments. Here, we reviewed CTG triplet repeat instability and its modifiers as an important source of phenotypic variability in patients with DM1

La dystrophie myotonique de Steinert (instabilité des triplets répétés CTG et métabolisme de l'ADN)

La dystrophie myotonique de Steinert (DM1) est une pathologie multisystémique due à l amplification d une répétition CTG dans la région 3 -UTR du gène DMPK. Chez les patients, le nombre de CTG augmente lors des transmissions parentales, ce qui permet d expliquer l apparition et l aggravation des symptômes de plus en plus tôt au cours des générations. La taille de cette répétition augmente également dans les tissus des patients ce qui pourrait expliquer la progression de la sévérité des symptômes au cours de la vie. Afin d identifier quels sont les mécanismes d instabilité impliqués, j ai croisé le modèle murin de la DM1 du laboratoire avec des souris invalidées pour plusieurs gènes codant des protéines intervenant lors de la réparation et de la réplication de l ADN, telles que Msh3, Msh6, p53, Rad52 ou la ligase I. Dans cette thèse, est également décrit pour la première fois chez la souris la reproduction des très grandes expansions intergénérationnelles observées chez les patients.PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Le triplet CTG instable impliqué dans la dystrophie myotonique de Steinert (un "serial" acteur imprévisible)

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Identification de nouveaux facteurs entraînant des contractions CTG.CAG dans la dystrophie myotonique de type 1

International audienceMyotonic dystrophy type 1 (DM1) is a multisystemic neuromuscular disease caused by an abnormal CTG repeat expansion in the 3’UTR region of the DMPK gene. In patients, the CTG repeat size varies from fifty to thousands CTG and usually increases across generations (intergenerational instability) and over time in tissues (somatic instability). Larger expansions are associated with more severe symptoms and a decreasing age of onset. Thus, the larger expansions are often associated with the most severe clinical form of DM1 (congenital form). Our PhD project is to identify new genetic and chemical factors reducing the number of repeats and to better understand the mechanisms underlying instability. To this end, genetic and pharmacological screenings are carried out in a HEK293 cell model allowing the rapid detection of expansions (increase in CTG repeat number) and contractions (decrease in CTG repeat number). The effects of different genes and chemical factors, selected during the screening, on the dynamics of the CTG repeat instability will be studied in a DM1 cell model. The results of our work will provide a better understanding of the mechanisms behind contractions. In addition, the identification of new pharmacological compounds promoting CTG contractions and thus reducing or even reversing the progression of disease will offer new therapeutic prospects for DM1 but also for other triplet repeat diseases.La dystrophie myotonique de type 1 (DM1 ou maladie de Steinert) est une maladie neuromusculaire multi-systémique causée par une expansion anormale de triplets CTG instables dans la région 3’UTR du gène DMPK . Le nombre de répétitions augmente au cours des générations (instabilité intergénérationnelle) mais également avec l’âge du patient (instabilité somatique). Chez les patients, la taille des répétitions CTG est généralement corrélée à l’âge d’apparition et à la sévérité des symptômes. Ainsi, les expansions les plus grandes sont souvent associées à la forme clinique la plus grave de la DM1 (forme congénitale). Notre projet de thèse vise à identifier des nouveaux facteurs génétiques et chimiques capables de diminuer la taille des répétitions, et de mieux comprendre les mécanismes d’instabilité. Pour cela, un criblage génétique et pharmacologique est réalisé dans un modèle cellulaire HEK293 permettant de détecter rapidement les expansions (augmentation de la taille des triplets CTG) et les contractions (diminution de la taille des CTG). Les effets des différents gènes et facteurs chimiques, sélectionnés au cours du criblage, sur la dynamique de l’instabilité des triplets CTG seront étudiés dans un modèle cellulaire DM1. Les résultats de nos travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des contractions. Par ailleurs, l’identification de nouveaux composés pharmacologiques susceptibles de favoriser les contractions CTG et ainsi réduire, voire inverser, la progression de la maladie, offrira de nouvelles perspectives thérapeutiques pour la DM1 mais aussi pour d’autres maladies à triplets répétés

Real Time Videomicroscopy and Semiautomated Analysis of Brain Cell Culture Models of Trinucleotide Repeat Expansion Diseases

International audienceProper brain function requires the coordinated and intricate interaction between neuronal and glial cells. Like many other neurological conditions, trinucleotide repeat expansion disorders are likely initiated by the synergistic combination of abnormalities hitting different brain cell types, which ultimately disrupt brain function and lead to the onset of neurological symptoms. Understanding how trinucleotide repeat expansions affect the phenotypes and physiology of neurons and glia is fundamental to improve our understanding of disease mechanisms in the brain and shape the design of future therapeutic interventions. Here we describe a protocol for semiautomated videomicroscopy analysis of cultured brain cells, maintained under suitable and controlled conditions. Through real-time monitoring of basic cell phenotypes (such as proliferation, cell morphology, differentiation, and migration) this method provides an accurate primary assessment of the impact of the repeat expansion on the physiology of neurons and glia. The versatility of the system, the automated image acquisition and the semiautomated processing of the data collected allow rapid phenotypic analysis of individual cell types, as well as the investigation of cell-cell interactions. The stability of the acquisition system provides reproducible and robust results. The raw data can be easily exported to other software to perform more sophisticated imaging analysis and statistical tests. In summary, the methods described offer versatile, reproducible, and time-effective means to dissect the impact of the repeat expansion on different brain cell types and on intercellular interactions