Digital image analysis for microscope characterisation of the critical parameters involved in the fermentative production of secondary metabolites

Secondary metabolites, particularly antibiotics, are among the most relevant pharmaceutical compounds worldwide and they are generally produced by submerged cultivation of filamentous fungi. From the hydrodynamical point of view, these processes deal with the dispersion of up to four different phases: water-oil-air-fungi. It is well recognized that hydrodynamics has a significant influence on the global performance of the fermentation process; however, very little is understood about the relationships between hydrodynamics-dispersion-physiology-productivity. This poor understanding is partially due to the lack of precise methodologies to assess fungal viability (determining both the yield and productivity of the metabolite) and the size of the air bubbles and oil drops (related to the nutrient transport efficiency like oxygen and fatty acids). In this work, the published developments of our group, regarding image analysis-based methodologies for the study of Trichoderma harzianum cultivation for antimycotics production (v.g. 6-pentyl-alpha-pyrone) have been summarized and revised. The application of such methodologies resulted in the improvement of basic knowledge of the phenomena occurring within the fermenter as well as in the development of strategies for increasing the productivity of these processes. Key words: micelial cultures; hydrodynamics; multiphasic dispersión; microbial physiology; productivity; image analysis.Los metabolitos secundarios, y particularmente los antibióticos, se encuentran entre el grupo de fármacos de mayor relevancia en el mercado mundial, y son producidos, en su mayoría, mediante el cultivo sumergido de hongos filamentosos. Desde el punto de vista hidrodinámico, estos procesos involucran fundamentalmente la dispersión de hasta cuatro fases diferentes: agua-aceite-aire-hongo. Aun cuando se sabe que la hidrodinámica del cultivo determina la eficiencia global del proceso de fermentación, poco se ha logrado en cuanto al entendimiento de las relaciones hidrodinámica-dispersión-fisiología-productividad. Esto se debe en parte a la falta de metodologías que permitan cuantificar y caracterizar con precisión tanto la viabilidad del hongo (ya que en buena medida determina el rendimiento y la productividad del metabolito de interés), como el tamaño de las burbujas de gas y de gotas de aceite (ya que de ello depende la eficiencia de transporte de nutrientes como el oxígeno y los ácidos grasos del aceite). En este trabajo se resume y revisa el desarrollo de las metodologías que nuestro grupo ha publicado, basadas en el procesamiento y el análisis digital de imágenes aplicadas al estudio del cultivo de Trichoderma harzianum, hongo que produce antimicóticos de alta potencia (como la 6-pentil-alfa-pirona). Con el uso de estas metodologías hemos generado conocimiento básico de los fenómenos que ocurren en el fermentador, lo que nos ha permitido establecer estrategias para incrementar la productividad de este tipo de procesos. Palabras clave: cultivos miceliares; hidrodinámica; dispersión multifásica; fisiología microbiana; productividad; análisis de imágene

Longitudinal zonation pattern in Arabidopsis root tip defined by a multiple structural change algorithm

Background and Aims The Arabidopsis thaliana root is a key experimental system in developmental biology. Despite its importance, we are still lacking an objective and broadly applicable approach for identification of number and position of developmental domains or zones along the longitudinal axis of the root apex or boundaries between them, which is essential for understanding the mechanisms underlying cell proliferation, elongation and differentiation dynamics during root development. Methods We used a statistics approach, the multiple structural change algorithm (MSC), for estimating the number and position of developmental transitions in the growing portion of the root apex. Once the positions of the transitions between domains and zones were determined, linear models were used to estimate the critical size of dividing cells (L(critD)) and other parameters. Key Results The MSC approach enabled identification of three discrete regions in the growing parts of the root that correspond to the proliferation domain (PD), the transition domain (TD) and the elongation zone (EZ). Simultaneous application of the MSC approach and G2-to-M transition (CycB1;1DB:GFP) and endoreduplication (pCCS52A1:GUS) molecular markers confirmed the presence and position of the TD. We also found that the MADS-box gene XAANTAL1 (XAL1) is required for the wild-type (wt) PD increase in length during the first 2 weeks of growth. Contrary to wt, in the xal1 loss-of-function mutant the increase and acceleration of root growth were not detected. We also found alterations in L(critD) in xal1 compared with wt, which was associated with longer cell cycle duration in the mutant. Conclusions The MSC approach is a useful, objective and versatile tool for identification of the PD, TD and EZ and boundaries between them in the root apices and can be used for the phenotyping of different genetic backgrounds, experimental treatments or developmental changes within a genotype. The tool is publicly available at www.ibiologia.com.mx/MSC_analysis

Mean Depth-Width Ratio of Extrema as Textural Feature for Automated Cell Proliferation Analysis

As a step towards automation of Mitotic Index estimation for cell proliferation studies, we introduce in this work a roughness feature of surface-intensity images: the mean depth-width ratio of extrema (MDWRE). This feature allowed identification of variable-shaped metaphases and interphase nuclei in the presence of many artifacts (one metaphase per hundreds of nuclei and thousands of artifacts). The texture of the cytological objects (seen as rough surfaces) was quantified by scanning in one dimension the lines contained in a closed contour. MDWRE resulted suitable for image magnifications as low as (x10), making possible a faster scanning of the slides. The use of this feature gave +14%, +65%, +133% and +133% better performance figures than classical textural features derived from cooccurrence matrices such as Contrast, Energy, Entropy and Angular 2nd Moment respectively, and +51% better than the Relative Extrema Density (RED). The MDWRE per object and the shape of the histogram of t..

Análisis digital de imágenes para la caracterización microscópica de parámetros críticos en la producción fermentativa de metabolitos secundarios

Los metabolitos secundarios, y particularmente los antibióticos, se encuentran entre el grupo de fármacos de mayor relevancia en el mercado mundial, y son producidos, en su mayoría, mediante el cultivo sumergido de hongos filamentosos. Desde el punto de vista hidrodinámico, estos procesos involucran fundamentalmente la dispersión de hasta cuatro fases diferentes: agua-aceite-aire-hongo. Aun cuando se sabe que la hidrodinámica del cultivo determina la eficiencia global del proceso de fermentación, poco se ha logrado en cuanto al entendimiento de las relaciones hidrodinámica-dispersión-fisiología-productividad. Esto se debe en parte a la falta de metodologías que permitan cuantificar y caracterizar con precisión tanto la viabilidad del hongo (ya que en buena medida determina el rendimiento y la productividad del metabolito de interés), como el tamaño de las burbujas de gas y de gotas de aceite (ya que de ello depende la eficiencia de transporte de nutrientes como el oxígeno y los ácidos grasos del aceite). En este trabajo se resume y revisa el desarrollo de las metodologías que nuestro grupo ha publicado, basadas en el procesamiento y el análisis digital de imágenes aplicadas al estudio del cultivo de Trichoderma harzianum, hongo que produce antimicóticos de alta potencia (como la 6-pentil-alfa-pirona). Con el uso de estas metodologías hemos generado conocimiento básico de los fenómenos que ocurren en el fermentador, lo que nos ha permitido establecer estrategias para incrementar la productividad de este tipo de procesos. Palabras clave: cultivos miceliares; hidrodinámica; dispersión multifásica; fisiología microbiana; productividad; análisis de imágene