Cultivo primário de células hepáticas de traíra Hoplias malabaricus (Bloch,1794)-empregando método nao enzimático de isolamento

Orientador: Marcos A. F. Randi, Ciro A. O. RibeiroMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Curso de Graduaçao em Ciencias BiológicasResumo : Nos últimos anos vêm crescendo o número de trabalhos científicos que discutem a importância de ensaios in vitro para o estudo de vários processos metabólicos da célula e dos mecanismos de toxicidade envolvendo a presença de contaminantes. Destes, são vários os resultados que apontam o uso de cultivo primário de células altamente funcionais, como os hepatócitos, como uma ferramenta promissora na identificação e caracterização do efeito de agentes tóxicos. Para mamíferos, e mais especificamente, seres humanos, técni.cas de isolamento e cultivo já estão bem estabelecidas, assim como já existem linhagens celulares de hepatócitos. Contudo, para peixes, especialmente de ecossistemas tropicais brasileiros, não existem dados relacionados com o estabelecimento de linhagens ou do uso de cultivo primário de células de espécies nativas para a investigação dos processos supracitados, fazendo com que a iniciativa deste trabalho ganhe relevância e ineditismo. No presente estudo, hepatócitos de traíra (Hoplias malabaricus), uma espécie nativa, foram isolados por perfusão não enzimática e cultivados pelo período de seis dias. Testaram-se diferentes metodologias para o isolamento dessas células e optou-se pelas que se mostraram mais apropriadas, por questões logísticas, e para a espécie "traíra". Estimou-se, após o isolamento, o número de hepatócitos pelo método hemocitométrico e a viabilidade celular dos mesmos pelo método de exclusão de azul de tripan. As células foram cultivadas em meio DMEM (pH 7,85 e 291 mOsm) em duas temperaturas distintas, 25°C e 37°C, somente sobre lamínulas, lamínulas cobertas com poli-L-lisina ou sobre coat de proteínas da matriz extracelular. O cultivo foi acompanhado com o uso de microscópio de contraste de fase, e em intervalos de 24h, as células foram fixadas em Bouin e coradas com Giemsa para avaliar aspectos morfológicos. Cerca de 3,Ox107-108 células/lOOg de massa de peixe foram obtidas, com viabilidade média de 73%. Os hepatócitos de traíra apresentaram relativa <;lificuldade para aderir quando na ausência das proteínas de matriz. As análises morfológicas realizadas evidenciaram que as células não sofreram alterações visíveis no decorrer do período de cultivo e mantiveram a capacidade de organização tecidual. Porém, análises para determinação das alterações metabólicas e do conteúdo enzimático não foram realizadas, devido às dificuldades para padronização da cultura primária dos hepatócitos. Este trabalho é o inicio de mn projeto mais amplo, que na sua continuidade, deverá investigar a possibilidade de manter estas células vivas, funcionais e diferenciadas por um período de tempo maior e seu emprego para estudos de efeitos e de mecanismos de toxicidade relativa a contaminantes de origem antrópica

Avaliação da citotoxicidade de uma mistura complexa de pesticidas, MeHg e DDT em hepatócitos de Hoplias malabaricus

Orientador : Ciro A. de Oliveira RibeiroCo-orientador : Silvio M. ZanataTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2007Inclui bibliografiaUm procedimento de fácil reprodução para o isolamento de hepatócitos de Hoplias malabaricus e condições de cultivo foram padronizadas no capítulo I para posterior emprego em ensaios com xenobióticos (capítulos II e III). Os hepatócitos puderam ser cultivados durante 1-3 semanas, sendo que o período de uma semana foi escolhido como tempo limite para os ensaios. No capitulo II, avaliou-se o efeito de uma mistura de pesticidas organoclorados extraídos da gordura hepática de enguias expostas naturalmente e coletadas na Reseva de Camarguè – França, depois de 48 horas de exposição. O desenho experimental incluía dois controles (grupo controle e solvente) e duas concentrações da mistura (10 e 50 ng.ml-¹), sendo que foram analisados sete biomarcadores (atividade das enzimas catalase e glutationa S-transferase, concentração de glutationa reduzida, peroxidação de lipídios, incidência de apoptose, viabilidade celular e quebras do DNA), os quais responderam conforme o grupo experimental. No capítulo III, foi investigado o efeito do DDT e do monometilmercúrio (MeHg) após 96 horas de exposição. O desenho experimental incluía um grupo controle e quatro expostos (DDT a 50 nM, MeHg a 0,25 µM e a 2,5 µM, e uma mistura de DDT a 50 nM mais MeHg a 0,25 µM). Aos biomarcadores avaliados no capitulo II (com exceção do ensaio de quebras do DNA), acrescentaram-se oito novos para o capítulo III (atividade das enzimas superóxido dismutase, glutationa dissulfeto redutase, delta-aminolevulinato desidratase e glucose-6-fosfato desidrogenase, carbonilação de proteínas, concentração de glicogênio celular, produção de peróxido de hidrogênio e de ânion superóxido). Esses marcadores também responderam conforme o grupo experimental. A soma dos capítulos II e III configura-se no primeiro registro empírico de ensaios in vitro empregando hepatócitos da espécie Hoplias malabaricus como modelo para avaliar o efeito de xenobióticos.A simple and easily reproducible procedure to isolate Hoplias malabaricus hepatocytes and the required culture conditions to maintain these cells were standardized in the chapter I. Then, two independent studies were conducted to evaluate the effects of xenobiotics (chapter II and III) on those cells. Hepatocytes were successfully cultured during 1-3 weeks, and the period of one week was selected as the limit of time for any assay. In the chapter II, the effects of one chlorinated pesticides mixture extracted from the eel hepatic lipids were determined after two days of cell exposure. The experimental design included two controls (control and solvent groups) and two different concentrations of the mixture (10 and 50 ng.ml-¹). Seven biomarkers were analyzed (enzymatic activities of catalase and glutathione S-transferase, concentration of reduced glutathione, lipid peroxidation, incidence of apoptosis, cell viability and DNA fragmentation). They responded according to each experimental group. In the chapter III, the effects of concentrations of DDT and monomethyl mercury (MeHg) reported in the tissues of fishes naturally raised were investigated after four days of cell exposure. The experimental design included one control and four tested groups (DDT at 50 nM, MeHg at 0,25 µM and at 2.5 µM, and the mixture of DDT at 50 nM plus MeHg at 0,25 µM). To the aforementioned biomarkers analyzed in chapter II, eight new biomarkers were added (activity of superoxide dismutase, glutathione reductase, deltaaminolevulinic acid dehydratase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, protein carbonyl content, glycogen content and production of hydrogen peroxide and superoxide anion), which varied according to each experimental group. The sum of chapters II and III is the first empirical register of in vitro assays using Hoplias malabaricus hepatocytes as a research model to evaluate the effects of xenobiotics

Biomarkers responses in fish (Atherinella brasiliensis) of paranaguá bay, southern Brazil, for assessment of pollutant effects

Paranaguá bay is a complex estuary located in southern Brazil containing three protected areas listed by UNESCO. Historically, the estuary has been affected by urban, industrial, agricultural and harbor activities, and occasional accidents. Specifically, the explosion of the Chilean ship Vicuña in December 2004 spilled methanol and crude and fuel oils which affected both protected and non-protected areas. The present study sought to investigate the pollution threat to aquatic organisms in order to evaluate the potential effects of pollutants. One hundred and twenty adult fish Atherinella brasiliensis were collected from different sites within Paranaguá estuary, including the harbor and open ocean, during summer, autumn and winter of 2005. Among the biomarkers, the somatic index, chemical analysis of bile, biochemical, genetic and morphological parameters were considered. Chemical analysis of bile showed a continuous bioavailability of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) according to proximity to the harbor site. The histopathological findings have demonstrated aconsiderable incidence of severe pathologies in the liver and gills, corroborated by biochemical disturbances and genetic damage. These findings indicate that more studies are necessary to evaluate both water quality and fish health so as to permit a better analysis of the impact of pollution in Paranaguá estuary.A Baia de Paranaguá é um complexo estuarino localizado no sul do Brasil constituído de três áreas de proteção ambiental listadas pela UNESCO. Historicamente, o estuário tem sido afetado por atividade urbana, industrial, agricultura e portuária, e eventualmente por acidentes. Particularmente a explosão do navio Chileno Vicuña em dezembro de 2004 derramou metanol, óleo cru e combustível atingindo áreas protegidas e não protegidas. O presente estudo tem por objetivo investigar a poluição em organismos aquáticos. Cento e vinte indivíduos adultos do peixe Atherinella brasiliensis foram coletados em quatro diferentes pontos de coleta no estuário de Paranaguá, partindo do porto até o oceano aberto nos períodos de verão, inverno e primavera de 2005. Os índices somáticos, parâmetros químicos, enzimáticos, genéticos e morfológicos foram considerados. As análises histopatológicas demonstraram expressiva incidência de patologia no fígado e nas brânquias algumas vezes corroboradas pelas alterações bioquímicas. Danos genéticos e anormalidades genéticas também foram observados. As análises químicas na bile mostraram uma contínua biodisponibilidade de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos para os organismos aquáticos. Os dados obtidos indicam que a qualidade da água e a saúde dos peixes encontram-se bastante comprometidos no estuário de Paranaguá

Avaliação da citotoxicidade de uma mistura complexa de pesticidas, MeHg e DDT em hepatócitos de Hoplias malabaricus

Orientador : Ciro A. de Oliveira RibeiroCo-orientador : Silvio M. ZanataTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2007Inclui bibliografiaUm procedimento de fácil reprodução para o isolamento de hepatócitos de Hoplias malabaricus e condições de cultivo foram padronizadas no capítulo I para posterior emprego em ensaios com xenobióticos (capítulos II e III). Os hepatócitos puderam ser cultivados durante 1-3 semanas, sendo que o período de uma semana foi escolhido como tempo limite para os ensaios. No capitulo II, avaliou-se o efeito de uma mistura de pesticidas organoclorados extraídos da gordura hepática de enguias expostas naturalmente e coletadas na Reseva de Camarguè – França, depois de 48 horas de exposição. O desenho experimental incluía dois controles (grupo controle e solvente) e duas concentrações da mistura (10 e 50 ng.ml-¹), sendo que foram analisados sete biomarcadores (atividade das enzimas catalase e glutationa S-transferase, concentração de glutationa reduzida, peroxidação de lipídios, incidência de apoptose, viabilidade celular e quebras do DNA), os quais responderam conforme o grupo experimental. No capítulo III, foi investigado o efeito do DDT e do monometilmercúrio (MeHg) após 96 horas de exposição. O desenho experimental incluía um grupo controle e quatro expostos (DDT a 50 nM, MeHg a 0,25 µM e a 2,5 µM, e uma mistura de DDT a 50 nM mais MeHg a 0,25 µM). Aos biomarcadores avaliados no capitulo II (com exceção do ensaio de quebras do DNA), acrescentaram-se oito novos para o capítulo III (atividade das enzimas superóxido dismutase, glutationa dissulfeto redutase, delta-aminolevulinato desidratase e glucose-6-fosfato desidrogenase, carbonilação de proteínas, concentração de glicogênio celular, produção de peróxido de hidrogênio e de ânion superóxido). Esses marcadores também responderam conforme o grupo experimental. A soma dos capítulos II e III configura-se no primeiro registro empírico de ensaios in vitro empregando hepatócitos da espécie Hoplias malabaricus como modelo para avaliar o efeito de xenobióticos.A simple and easily reproducible procedure to isolate Hoplias malabaricus hepatocytes and the required culture conditions to maintain these cells were standardized in the chapter I. Then, two independent studies were conducted to evaluate the effects of xenobiotics (chapter II and III) on those cells. Hepatocytes were successfully cultured during 1-3 weeks, and the period of one week was selected as the limit of time for any assay. In the chapter II, the effects of one chlorinated pesticides mixture extracted from the eel hepatic lipids were determined after two days of cell exposure. The experimental design included two controls (control and solvent groups) and two different concentrations of the mixture (10 and 50 ng.ml-¹). Seven biomarkers were analyzed (enzymatic activities of catalase and glutathione S-transferase, concentration of reduced glutathione, lipid peroxidation, incidence of apoptosis, cell viability and DNA fragmentation). They responded according to each experimental group. In the chapter III, the effects of concentrations of DDT and monomethyl mercury (MeHg) reported in the tissues of fishes naturally raised were investigated after four days of cell exposure. The experimental design included one control and four tested groups (DDT at 50 nM, MeHg at 0,25 µM and at 2.5 µM, and the mixture of DDT at 50 nM plus MeHg at 0,25 µM). To the aforementioned biomarkers analyzed in chapter II, eight new biomarkers were added (activity of superoxide dismutase, glutathione reductase, deltaaminolevulinic acid dehydratase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, protein carbonyl content, glycogen content and production of hydrogen peroxide and superoxide anion), which varied according to each experimental group. The sum of chapters II and III is the first empirical register of in vitro assays using Hoplias malabaricus hepatocytes as a research model to evaluate the effects of xenobiotics

Immunotoxicity of relevant mixtures of pesticides and metabolites on THP-1 cells

International audienc

Low concentrations of complex mixtures of pesticides and metabolites are toxic to common Carp brain cells (Cyprinus carpio carpio)

International audiencePesticide use increases annually, and Brazil is the world’s largest consumer. However, unlike theEuropean Union (EU), there is no established limit value for pesticide mixtures in drinking water,and therefore the concentration of pesticides can reach 3354 times the EU limit. Thus, determiningthe risk of exposure to pesticide mixtures and their main metabolites is challenging and requiresthe use of alternative methods. In the present study, the Common Carp Brain (CC B) cell line wasused to evaluate the in vitro toxicity of relevant pesticide mixtures (glyphosate, 2,4-D, atrazine, andmancozeb) and their main metabolites after 72 h of exposure. The tested concentrations were basedon the Acceptable Daily Intake (ADI) defined by Brazilian legislation. The results showed that cellsexposed to lower concentrations of the pesticide mixtures and the pesticide + metabolite mixtureswere affected by a decrease in cell confluence, resazurin metabolism, and wound healing capacity.The IBR index showed that lower concentrations had more severe effects, suggesting the absenceof safe concentrations of these pesticide and metabolite mixtures for the CC B cell line within thetested concentration range. These findings raise concerns about the effects of exposure to thesesubstances on animal and human health

Co-exposure to silver nanoparticles and cadmium induce metabolic adaptation in HepG2 cells

<p>Although multiple studies have reported the toxicological effects and underlying mechanisms of toxicity of silver nanoparticles (AgNP) in a variety of organisms, the interactions of AgNP with environmental contaminants such as cadmium are poorly understood. We used biochemical assays and mass spectrometry-based proteomics to assess the cellular and molecular effects induced by a co-exposure of HepG2 cells to AgNP and cadmium. Cell viability and energy homeostasis were slightly affected after a 4-h exposure to AgNP, cadmium, or a combination of the two; these endpoints were substantially altered after a 24-h co-exposure to AgNP and cadmium, while exposure to one of the two contaminants led only to minor changes. Proteomics analysis followed the same trend: while a 4-h exposure induced minor protein deregulation, a 24-h exposure to a combination of AgNP and cadmium deregulated 43% of the proteome. The toxicity induced by a combined exposure to AgNP and cadmium involved (1) inactivation of Nrf2, resulting in downregulation of antioxidant defense and proteasome-related proteins, (2) metabolic adaptation and ADP/ATP imbalance, and (3) increased protein synthesis possibly to reestablish homeostasis. The adaptation strategy was not sufficient to restore ADP/ATP homeostasis and to avoid cell death.</p

Cylindrospermopsin effects on protein profile of HepG2 cells

<p>Human hepatoma cells (HepG2) were exposed to purified cylindrospermopsin (CYN), a potent toxicant for eukaryotic cells produced by several cyanobacteria. Exposure to 10 μg l⁻¹ of CYN for 24 h resulted in alteration of expression of 48 proteins, from which 26 were identified through mass spectrometry. Exposure to 100 μg l⁻¹ of CYN for 24 h affected nuclear area and actin filaments intensity, which can be associated with cell proliferation and toxicity. The proteins are implicated in different biological processes: protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism and cell anabolism, cell signaling, tumorigenic potential, and cytoskeleton structure. Protein profile indicates that CYN exposure may lead to alteration of glucose metabolism that can be associated with the supply of useful energy to cells respond to chemical stress and proliferate. Increase of G protein-coupled receptors (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP), and reactive oxygen species (ROS) levels observed in HepG2 cells can associate with cell proliferation and resistance. Increase of MRP3 and glutathione peroxidase can protect cells against some chemicals and ROS. CYN exposure also led to alteration of the expression of cytoskeleton proteins, which may be associated with cell proliferation and toxicity.</p