PCR en toxoplasmosis

La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR, constituye una metodología sensible y específica que permite la identificación de segmentos génicos mediante la amplificación selectiva de secuencias de ADN particulares. Las técnicas de Biología Molecular han sido adaptadas a la identificación de Toxoplasma gondii en diversas muestras biológicas de animales y humanos como sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, humor vítreo y líquido amniótico

Disección molecular de la etiología de la falla ovárica prematura por secuenciación directa y NGS: estudio de la implicación de los genes CITED2, CDKN1B, FOXO4, BMP15 y ADAMTS19

Entre las causas femeninas de infertilidad, la Falla Ovárica Prematura (FOP) es frecuente, ya que afecta al 1% de las mujeres menores de 40 años de edad (Coulam et al, 1986). La FOP se define clínicamente por amenorrea de más de 6 meses de duración, niveles plasmáticos elevados de gonadotrofinas y deficiencia de esteroides sexuales antes de los 40 años de edad. La FOP puede ocurrir por una variedad de mecanismos que conducen a la disminución del número de folículos, al incremento de la atresia folicular o a la falla en la maduración de los folículos (Beck-Peccoz et al, 2006). La FOP se ha asociado a varias etiologías, pero en más del 80% de los casos, no se conoce la causa de la enfermedad. Esta alta prevalencia de casos idiopáticos sugiere la implicación de factores genéticos y ambientales (Maclaran et al, 2011). La complejidad de los procesos fisiológicos, celulares y genéticos subyacentes a la determinación sexual, la foliculogénesis y la ovulación sugiere la participación de numerosos genes regulados de una manera precisa en cada etapa del desarrollo (Laissue, 2015). En este contexto, es fundamental integrar el alcance de las distintas técnicas para la búsqueda de factores genéticos etiológicos de la FOP. En efecto, tanto la secuenciación directa como las aproximaciones multigénicas para el análisis genómico a gran escala son aproximaciones complementarias para este ejercicio. La iniciativa principal de este trabajo doctoral consistió en realizar aproximaciones monogénicas (secuenciación de Sanger) y multigénicas Next generation sequencing (NGS) para la identificación de nuevos genes asociados a FOP. La identificación de nuevos genes y de variantes potencialmente deletéreas, así como su validación a través de estudios funcionales y análisis poblacionales, permitió aportar nuevo conocimiento en la etiología molecular de la FOPPremature ovarian failure (POF) is a frequent disease, affecting 1% of women under 40 years old (Coulam et al, 1986). Clinically, POF women are affected by primary or secondary amenorrhoea and increased plasma levels of gonadotrophins (e.g. FSH and LH). POF can be originated from a variety of mechanisms leading to a decrease in the number of follicles, to the increase of follicular atresia or to follicle maturation failure (Beck-Peccoz et al, 2006). POF has been associated with different etiologies, but in the majority of the cases the cause remains unknown. The prevalence of idiopathic cases suggests the existence of genetic and environmental aetiological factors (Maclaran et al, 2011). The inherent molecular complexity of sex determination, folliculogenesis and ovulation underlines that hundreds of genes might be related to POF phenotype (Laissue, 2015). In this context, direct sequencing of single genes and large scale genomic approaches are complementary tools for identifying new POF molecular actors. The present PhD thesis focused on the use of direct sequencing, NGS and functional in vitro tests allowing the identification and validation of new POF causative sequence variants

Perda de heterozigosidade e identificação de portadoras de distrofia muscular de Duchenne: um caso familiar com evento de recombinação

La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMD/DMB) es una entidad de herencia recesiva ligada al cromosoma X que se presenta con debilidad muscular y es causada por mutaciones en el gen de la distrofina. La pérdida de heterocigocidad permite identificar a las mujeres portadoras de deleción en el gen de la distrofina mediante haplotipos. Objetivo: identificar mujeres portadoras en una familia con un paciente afectado de DMD mediante análisis de pérdida de heterocigocidad. Materiales y métodos: se analizaron nueve miembros de una familia con un afectado de DMD. Se hizo extracción de ADN y amplificación de diez STR del gen de la distrofina; se construyeron haplotipos, y se determinó el estado de portadora de deleción en dos de las seis mujeres analizadas, quienes mostraron pérdida de heterocigocidad de tres STR. Se establecieron algunos eventos de recombinación. Resultados: Dos de las seis mujeres analizadas, mostraron perdida de heterocigocidad en tres de los diez STR genotipificados, indicando su estado de portadora de deleción en este fragmento del gen de la Distrofina Con la segregación familiar de los haplotipos se establecieron eventos de recombinación. Conclusiones: mediante pérdida de heterocigocidad es posible establecer el estado de portadora de deleción en el gen de la distrofina con un 100% de certeza. La construcción de haplotipos identifica el cromosoma X portador de la deleción en familiares del caso índice. Se evidenció un evento de recombinación en una de las hermanas del afectado, lo que hace indeterminado su estado de portadora.Duchenne/Becker Muscular Dystrophy (DMD/BMD) is an X-linked recessive disease characterized by muscular weakness. It is caused by mutations on the dystrophin gen. Loss of heterozygosity allows us to identify female carriers of deletions on the dystrophin gen. Objective: identify female carriers in a family with a patient affected by DMD. Material and methods: nine family members and the affected child were analyzed using DNA extraction and posterior amplification of ten STRs on the dystrophin gen. Haplotypes were constructed and the carrier status determined in two of the six women analyzed due to loss of heterozygosity in three STRs. Additionally, we observed a recombination event. Conclusions: loss of heterozygosity allows us to establish with a certainty of 100% the carrier status of females with deletions on the dystrophin gen. By the construction of haplotypes we were able to identify the X chromosome with the deletion in two of the six women analyzed. We also determined a recombination event in one of the sisters of the affected child. These are described with a high frequency (12%). A possible origin for the mutation is a gonadal mosaicism in the maternal grandfather or in the mother of the affected child in a very early stage in embryogensis. This can be concluded using the analysis of haplotypes.A distrofia muscular de Duchenne e Becker (DMD/DMB) é uma entidade de herança recessiva ligada ao cromossoma X que se apresenta com debilidade muscular e é causada por mutações no gene da distrofia. A perda de heterozigosidade permite identificar às mulheres portadoras de deleção no gene da distrofina mediante haplótipos. Objetivo: identificar mulheres portadoras em uma família com um paciente afetado de DMD mediante análises de perda de heterozigosidade. Materiais e métodos: se analisaram nove membros de uma família com um afetado de DMD. De fez extração de ADN e amplificação de dez STR do gene da distrofina; construíram-se haplótipos, e determinou-se o estado de portadora de deleção em duas das seis mulheres analisadas, as quais mostraram perda de heterozigosidade de três STR. Estabeleceram-se alguns eventos de recombinação. Resultados: duas das seis mulheres analisadas mostraram perda de heterozigosidade em três dos dez STR genotipados, indicando seu estado de portadora de deleção neste fragmento do gene da distrofina. Com a segregação familiar dos haplótipos se estabeleceram eventos de recombinação. Conclusões: mediante perda de heterozigosidade é possível estabelecer o estado de portadora de deleção no gene da distrofina com um 100% de certeza. A construção de haplótipos identifica o cromossoma X portador da deleção em familiares do caso índice. Evidenciou-se um evento de recombinação em uma das irmãs do afetado, o que faz indeterminado seu estado de portadora

THBD sequence variants potentially related to recurrent pregnancy loss

Recurrent pregnancy loss (RPL) is a frequently occurring disease, which is classified as idiopathic in more than 50% of cases. THBD, the endothelial cell receptor for thrombin, has been associated with distinct biological processes and considered a coherent RPL-related candidate gene. In the present study, we have sequenced the complete coding region of THBD in 262 patients affected by RPL. Bioinformatics analysis and screening of controls strongly suggested that the THBD-p.Trp153Gly mutation might be related to RPL aetiology. It could be used, after its validation by functional assays, as a molecular marker for diagnostic/prognostic purposes. © 2017 The Author(s)

Analysis of Urine Samples for the Molecular Detection of Infectious Diseases. Application to the Identification of Human Cytomegalovirus

La implementación de metodologías de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha permitido la realización de diagnósticos sensibles y específicos para múltiples enfermedades, dentro de las cuales son de gran interés las infecciosas. Hasta hoy, los métodos de identificación se basan principalmente en cultivos y serología por su sensibilidad y especificidad, pero consumen tiempo y dinero. Las muestras de orina se han constituido en una alternativa no invasiva de obtención de ADN para la realización de análisis de biología molecular. Metodología: Implementación de una estrategia para la obtención de ADN a partir de muestras de orina. Las muestras fueron tomadas de niños de guardería, para documentar la presencia o no de inhibidores de PCR a través de la amplificación de genes de Citomegalovirus humano (CMVH). Resultados: En el 27,1% de las muestras analizadas se evidenció amplificación específica para CMVH, no se encontraron diferencias significativas en la presencia del virus en los tres estratos, pero sí en la intensidad de las bandas. Conclusión: Se verificó la ausencia de inhibidores de PCR mediante la amplificación del gen de la B-globina. Se estandarizó una metodología molecular para la identificación de CMVH, la cual puede ser aplicadaMolecular biology methods like Polimerase Chain Reaction (PCR) has been used for diagnosis of infectious diseases. Until today, the identification methods are based mainly on cultures and serology due to their sensibility and specificity, but they are expensive and time consuming. Urine samples constitute an alternative, noninvasive, method of obtaining DNA for the accomplishment of molecular Biology analysis. Methodology: implementation of a strategy to obtain DNA from urine samples. Samples were taken from children in daycare centers, to document the presence of inhibitors, PCR amplification of genes of human Cytomegalovirus (HCMV) was done. Results: In 27.1% of the analyzed samples, specific amplification for HCMV was demonstrated. No viral significant differences were found in the three layers, although it was present in the bands. Conclusion: The inhibitor absence was verified using PCR by amplificating the gene of the B-globine. A molecular methodology for the HCMV identification was standardized, which can be applied in prenatal diagnosis of congenital infection

Análisis de deleciones en 15 exones situados dentro y fuera del hot spot mutacional del gen de la distrofina en pacientes con distrofia muscular de Duchenne

Introducción. La distrofia muscular de Duchenne (DMD), y su forma alélica más leve, la distrofia muscular de Becker (DMB), es una entidad de herencia recesiva ligada al X, que se presenta con debilidad muscular, pérdida progresiva de las habilidades motoras y muerte precoz. Es causada principalmente por deleciones en el gen de la distrofina, el cual contiene 79 exones.Objetivo. Realizar un análisis ampliado para evaluar la presencia de deleciones en 15 exones del gen de la distrofina situados dentro y fuera del hot spot mutacional en 58 pacientes afectados con DMD/DMB sin mutación previamente identificada.Metodología. Amplificación, mediante PCR múltiplex, de 4 exones situados dentro y 11 fuera del hot spot mutacional descrito para el gen de la distrofina en 58 pacientes afectados con DMD y determinar la frecuencia de deleciones en la población analizada. Resultados. Se encontró deleción del exón 16 en uno de los pacientes estudiados, hecho que indica una frecuencia de 1,7%. No se observó ninguna deleción de los exones situados fuera del hot spot mutacional.Conclusiones. La frecuencia de deleciones en los 15 exones del gen de la distrofina analizados es baja; sólo se presentó en el exón 16, el cual se encuentra localizado en el hot spot mutacional proximal del gen. Es importante analizar este exón en los afectados, en la medida en que aumenta la tasa de detección de deleciones en un 1,7%. Se debe analizar otro tipo de mutaciones como puntuales y duplicaciones en los afectados.Introduction. Duchenne and Becker Muscular Dystrophies (DMD/DMB) are X-linked recessive diseases characterized by progressive muscle weakness and wasting, loss of motor skills and death after the second decade of life. Deletions are the most prevalent mutations that affect the dystrophin gene, which spans 79 exons.Objective: Identify deletions on the dystrophin gene in 58 patients affected with DMD.Methods: Through multiplex PCR identify deletions on the dystrophin gene in 58 patients with DMD and observe the frequency of this mutation in our population.Results: We found deletions in 1.72% of patients (1 of 58 persons). Deletions were not the principal cause of disease in our population. It is possible that duplications and point mutations caused this illness in our patients.Conclusions: The frequency of deletions in the 15 exons analyzed from the dystrophin gene was low. The predominant types of mutation in our patients` samples were not deletions as has been observed in the literature worldwide, therefore, it is important to determine other types of mutations as are duplications and point mutations

Identification of point mutations of the 21-hydroxylase gene in patients affected with congenital adrenal hyperplasia

Introducción: La hiperlasia suprarrenal congenita es un trastorno autosomico recesivo debido a la inadecuada secreción de cortisol. Más del 95% de los casos de hiperplasia suprarrenal congenita son causados por defectos del gen de la 21 hidroxilasa, CYP21A2. Las manifestaciones clinicas incluyen la forma clasica y la forma no clasica. Objetivos: determinar la frecuencia de las mutaciones puntuales P30L, IVS2-12A/C-G,del 8pb, I172N, cluster Ex 6, V281L, Q318X,R356W y P453S en pacientes con hiperplasia suprarrenal congenita. Materiales y metodos: Se estudiaron 58 pacientes, de los cuales, 48 fueron clasicos y 10 no clasicos. Mediante PCR alelo-especifica y ACRS (Amplified Creation Restriction Sites), se analizaron 9 mutaciones puntuales del gen CYP21A2 y se determino la frecuencia en la población analizada. Resultados. Los alelos afectados se identificaron en el 82,8% de los cromosomas. Las mutaciones mas frecuentes fueron: IVS2-12A/C-G (26,7%),Q318X(21-5%), V281L (12,1%) e I172N (12,15). Conclusiones: Las mutaciones mas frecuentes en Colombia son similares a las de otros paises del mundo, exepto para Q318X que presento una mayor frecuencoa, pero similar a la de otros paises latinoamericanos. Este hallazgo y la existencia de 17,2% de alelos no identificados puede indicar diferencia entre el acervo genetico de las poblaciones. En la forma clasica perdedora de la sal predominaron las mutaciones Q318X e IVS2-A12/C-G; en la virilizante simple, IVS2-12A/C-G e I172N y en la no clasica, V281L, lo cual esta relaiconado con el grado de actividad enzimatica. En la forma no clasica, se encontraron alelos severos en el 66,7% de los casos, lo que determina el riesgo de tener hijos afectados con la forma grave virilizante simple o perdedora de sal. Los resultados reportados permiten ofrecer asesoramiento genetico y diagnostico personal.Introduction: Congenital adrenal hyperlasia is an autosomal recessive disorder due to inadequate cortisol secretion. More than 95% of cases of congenital adrenal hyperplasia are caused by defects of the 21 hydroxylase gene, CYP21A2. Clinical manifestations include the classical form and the non-classical form. Objectives: to determine the frequency of point mutations P30L, IVS2-12A / C-G, del 8pb, I172N, cluster Ex 6, V281L, Q318X, R356W and P453S in patients with congenital adrenal hyperplasia. Materials and methods: 58 patients were studied, of which 48 were classical and 10 non-classical. Using allele-specific PCR and ACRS (amplified creation restriction sites), analyze 9 point mutations of the CYP21A2 gene and determine the frequency in the population analyzed. Results. The affected alleles are identified in 82.8% of the chromosomes. The most frequent mutations were: IVS2-12A / C-G (26.7%), Q318X (21-5%), V281L (12.1%) and I172N (12.15). Conclusions: The most frequent mutations in Colombia are similar to those of other countries in the world, except for Q318X, which has a higher frequency, but similar to that of other Latin American countries. This finding and the existence of 17.2% of unidentified alleles may indicate a difference between the gene pool of the populations. In the classic salt-losing form, predominantly the Q318X and IVS2-A12 / C-G mutations; in the simple virilizer, IVS2-12A / C-G and I172N and in the non-classical one, V281L, which is related to the degree of enzymatic activity. In the non-classical form, severe alleles were found in 66.7% of the cases, which determined the risk of having children affected with the severe virilizing simple or salt-losing form. The reported results allow to offer genetic counseling and personal diagnosis

STR Markers Analysis on X Chromosome in aPopulation from Bogotá

El análisis de marcadores del cromosoma X ha sido ampliamente usado en el área de lagenética clínica, particularmente, para el análisis molecular de enfermedades ligadas al X.Recientemente, se han reconocido muchas repeticiones cortas en tándem (Short TandemRepeats, STR) sobre este cromosoma, por su importancia en análisis forense y de paterni-dad. Los marcadores gonosómicos son especialmente eficientes para resolver casos difíci-les, ya que las probabilidades de exclusión media son mayores que con los marcadoresSTR autosómicos.Objetivo. Determinar la frecuencia alélica y haplotípica de 10 marcadores STRs sobre elcromosoma X en 200 muestras de hombres no relacionados de la ciudad de Bogotá.Materiales y métodos. Se analizaron 200 muestras de sangre de hombres no emparentadosnacidos en Bogotá. El ADN genómico fue extraído mediante la técnica Whatman FTA yamplificados por PCR. Los productos se analizaron en un secuenciador automático ABIPrism 310, con el software GeneMapper, versión 3.2.Resultados. Los sistemas evaluados indicaron la presencia de 6 a 11 alelos, con el mayorpolimorfismo para los sistemas DXS6809 y DXS6789, seguido por el sistema DXS9902.Las frecuencias alélicas oscilaron entre 0,005 y 0,565, mientras que la frecuencia haplotí-pica fue de 0,005. Los parámetros forenses utilizados en este estudio reportaron que elsistema DXS7132 mostró una mayor diversidad y PD (0,832211 y 0,82805) respectiva-mente indicando que este sistema es altamente informativo; el sistema que presentó menordiversidad y PD fue el sistema DXS7133.Conclusión. Los diez marcadores analizados en este estudio permiten la genotipifica-ción simultánea de los 10 STRs en solo una PCR, adicionalmente se evidenció que losmarcadores analizados son ampliamente informativos y que su utilización puede ser degran aporte en la práctica forense, particularmente en los casos de parentesco u otrasdeficiencias.X chromosome markers analysis has been usedwidely in the clinical genetics area, particularly inmolecular diseases X-linked analysis. Recently,many short tandem repeats (Short Tandem Repeats,STRs) on this chromosome has been recognized,by importance in forensic and paternity analysis. Thegonosomal markers are particularly efficient resolvedifficult cases, since the odds of half exclusionoutweigh the STR autosomes markers.Objective. Determine the allelic frequency andhaplotype frequency of 10 STRs markers locatedon the X chromosome, in 200 samples of unrelatedmen in the Bogotá city.Materials and methods. 200 blood samples wereanalyzed from unrelated males born in Bogotá.DNA extraction was performed using the WhatmanFTA technique and PCR amplified. The productswere analyzed in automatic sequencer ABI Prism310, software GeneMapper, version 3.2.Results. The systems tested, showed of 6-11alleles, with greater polymorphism DXS6809 andDXS6789 systems and this followed for DXS9902system. The range of Allele frequencies from 0.005to 0.565, while the haplotype frequency was0.005. The forensic parameters used in this study,reported that the DXS7132 system showed greaterdiversity and PD (0.832211 and 0.82805)respectively, suggesting that this system is highlyinformative, the system had lower PD and diversityDXS7133 system.Conclusion. The ten analyzed markers in this studyallow simultaneous genotyping of 10 STRs in onlyone PCR additionally revealed that informativemarkers are widely analyzed and their use cangreatly contribute in forensics practice, particularlyin cases of family or other deficiencie

Whole-Exome Sequencing Enables Rapid Determination of Xeroderma Pigmentosum Molecular Etiology

Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare autosomal recessive disorder haracterized by extreme sensitivity to actinic pigmentation changes in the skin and increased incidence of skin cancer. In some cases, patients are affected by neurological alterations. XP is caused by mutations in 8 distinct genes (XPA through XPG and XPV). The XP-V (variant) subtype of the disease results from mutations in a gene (XPV, also named POLH) which encodes for Polg, a member of the Y-DNA polymerase family. Although the presence and severity of skin and neurological dysfunctions differ between XP subtypes, there are overlapping clinical features among subtypes such that the sub-type cannot be deduced from the clinical features. In this study, in order to overcome this drawback, we undertook whole-exome sequencing in two XP sibs and their father. We identified a novel homozygous nonsense mutation (c.897T.G, p.Y299X) in POLH which causes the disease. Our results demonstrate that next generation sequencing is a powerful approach to rapid determination of XP genetic etiology

Possible Genetic Determinants of Response to Phenytoin in a Group of Colombian Patients With Epilepsy.

Background: Epilepsy is a serious health problem worldwide. Despite the introduction of new antiepileptic drugs (AEDs) almost 30% of these patients have drug-resistant forms of the disease (DRE), with a significant increase in morbi-mortality.Objective: Our objective was to assess the impact of some genetic factors and its possible association with treatment response and adverse drug reactions (ADRs) to phenytoin in 67 adult Colombian patients with epilepsy.Methods: We conducted an analytical, observational, prospective cohort study to screen four polymorphisms in pharmacogenes: CYP2C9*2-c.430C>T (rs1799853), CYP2C9*3-c.1075A>C (rs1057910), ABCB1-c.3435T>C (rs1045642), and SCN1A-IVS5-91G>A (rs3812718), and their association with treatment response. Patients were followed for 1 year to confirm the existence of DRE (non-response) and ADRs using an active pharmacovigilance approach, followed by a consensus in order to classify ADRs according to causality, preventability, intensity and their relation with phenytoin dose, the duration of treatment, and susceptibility factors (DoTS methodology).Results: A little more than half of evaluated subjects (52.2%) were non-responding to phenytoin. Regarding the genotype-phenotype correlation there was no association between polymorphisms of SCN1A and ABCB1 and DRE (non-response) (p = 0.34), and neither with CYP2C9 polymorphisms and the occurrence of ADRs (p = 0.42). We only found an association between polymorphic alleles of CYP2C9 and vestibular-cerebellar ADRs (dizziness, ataxia, diplopia, and dysarthria) (p = 0.001). Alleles CYP2C9*2-c.430C>T and CYP2C9*3-c.1075A>C were identified as susceptibility factors to ADRs in 24% of patients.Conclusions: Decreased function alleles of CYP2C9 were highly predictive of vestibular-cerebellar ADRs to phenytoin in our study (p = 0.001). However, the genetic variants CYP2C9*2-c.430C>T, CYP2C9*3-c.1075A>C, ABCB1-c.3435T>C, and SCN1A-IVS5-91G>A, were not associated with treatment response in our study