Ο ρόλος της στροφής και του μοτίβου της επτάδας στην αναδίπλωση και σταθερότητα της πρωτεΐνης Rop

Since Anfinsens pioneering experiments, it was known that the information necessary to drive protein folding is coded in the linear amino acid sequence of the protein. Despite intense research, the folding process is not fully understood. Various proteins have been used as model systems in order to examine the folding process and numerous theories have tried to interpret the experimental results. A well characterized protein, used in this context, is the Rop protein. Rop is a homodimeric, 4-α-helix bundle, which participates in the control of plasmid copies of the ColE1 family. The topology of each monomer is of the type helix-loop-helix, the loop consisting of three residues. A heptad pattern is present in the Rop sequence and is disturbed only in the loop region. The roles of loop and heptad periodicity in the folding process and stability of Rop have been extensively studied. In this study, we have attempted to farther elucidate the roles of turn and heptad pattern in Rop folding. Towards this aim, four mutants were designed. Two of them comprise altered residues in the turn region, while the other two mutants aim at restoring the heptad periodicity in the same region. A mutant, comprising two proline residues in positions 30 and 31 of wtRop, was constructed. Spectroscopic and thermodynamic studies were carried out and protein crystallization experiments were set up. Results of this work suggest that this mutant is comparable in its spectroscopic and thermodynamic properties to the A31P mutant, which has been compared to a molten-globule like state. This confirms the role of turn residues in the choice of folding pathway. Farther experiments are needed in order to fully characterize this protein. Protein crystals were obtained, but these are not yet suitable for X-ray diffraction experiments. This mutant, although being a loop variant, crystallizes in conditions more close to those of hydrophobic core Rop variants.Οι πρωτεΐνες είναι πολυπεπτιδικές αλυσίδες οι οποίες αναδιπλώνουν σε συγκεκριμένες τρισδιάστατες διαμορφώσεις. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται αναδίπλωση των πρωτεϊνών και γίνεται εξαιρετικά γρήγορα. Από τα πρωτοποριακά πειράματα του Anfinsen ήταν γνωστό ότι η απαραίτητη πληροφορία για την αναδίπλωση των πρωτεϊνών βρίσκεται κωδικοποιημένη στα αμινοξέα που τις αποτελούν. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν έχει γίνει εφικτή η πλήρης κατανόηση του μηχανισμού αναδίπλωσης των πρωτεϊνών, κάτι που είναι γνωστό ως πρόβλημα αναδίπλωσης των πρωτεϊνών. Στην προσπάθεια κατανόησης αυτού του μηχανισμού έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες πρωτεΐνες ως μοντέλα και βάσει των πειραματικών αποτελεσμάτων και των θεωρητικών προσεγγίσεων έχουν διατυπωθεί ποικίλες θεωρίες για τον τρόπο αναδίπλωσης των πρωτεϊνών. Μια από τις πρωτεΐνες που έχουν χρησιμοποιηθεί είναι η πρωτεΐνη Rop. Η Rop είναι ένα ομοδιμερές, αντιπαράλληλο, 4-α-ελικοειδές δεμάτιο και, φυσιολογικά, συμμετέχει στο μηχανισμό ελέγχου του αριθμού των αντιγράφων των πλασμιδίων της ColE1 οικογένειας. Η τοπολογία κάθε μονομερούς είναι έλικα-στροφή-έλικα με τη στροφή να σχηματίζεται από τρία κατάλοιπα. Επίσης, στο δεμάτιο της Rop, όπως και σε όλα τα α-ελικοειδή δεμάτια, εμφανίζεται η περιοδικότητα της επτάδας, η οποία διαταράσσεται στην περιοχή της στροφής. Ποικίλες μελέτες έχουν αποδώσει δευτερεύοντες ή περισσότερο πρωταρχικούς ρόλους στη στροφή και στην περιοδικότητα της επτάδας, σε ότι αφορά στην αναδίπλωση και σταθερότητα της Rop. Στην παρούσα εργασία γίνεται προσπάθεια να διαφωτιστεί ακόμη περισσότερο η σημασία των παραπάνω στοιχείων στον τρόπο με τον οποίο αναδιπλώνεται η πρωτεΐνη Rop. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν τέσσερα μεταλλάγματα. Από αυτά, τα δυο αφορούν στο σχεδιασμό στρατηγικών μεταλλαγών στην περιοχή της στροφής με σκοπό την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της στην πορεία αναδίπλωσης της πρωτεΐνης, ενώ τα άλλα δυο αφορούν στην αποκατάσταση της περιοδικότητας της επτάδας στην περιοχή της στροφής. Στα πλαίσια αυτής της εργασίας έγινε δυνατή η παραγωγή ενός από τα παραπάνω μεταλλάγματα, το οποίο αφορά στην αντικατάσταση των καταλοίπων Asp30 και Ala31 της στροφής της αγρίου τύπου Rop, με δυο προλίνες. Η πρωτεΐνη μελετήθηκε ως προς τις φασματοσκοπικές και θερμοδυναμικές της ιδιότητες και υπήρξε δυνατή η κρυστάλλωσή της. Τα αποτελέσματα της εργασίας δείχνουν ότι το μετάλλαγμα αυτό έχει παρόμοιες φασματοσκοπικές και θερμοδυναμικές ιδιότητες με αυτές του μεταλλάγματος A31P, το οποίο έχει υποτεθεί ότι αποτελεί μια molten globule κατάσταση και επιβεβαιώνουν τη σημασία των καταλοίπων της στροφής στην επιλογή του μονοπατιού αναδίπλωσης της πρωτεΐνης. Περαιτέρω πειράματα απαιτούνται για τον ακριβή χαρακτηρισμό του. Οι κρύσταλλοι του μεταλλάγματος D30PA31P, που σχηματίστηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας χρειάζονται περαιτέρω βελτίωση, προκειμένου να είναι κατάλληλοι για περίθλαση ακτίνων Χ. Το μετάλλαγμα D30PA31P κρυσταλλώνει σε συνθήκες παρόμοιες με τις συνθήκες στις οποίες κρυσταλλώνουν οι παραλλαγές του υδρόφοβου πυρήνα και όχι οι παραλλαγές της στροφής

Purification, crystallization and preliminary characterization of a putative LmbE-like deacetylase from Bacillus cereus

The BC1534 protein from B. cereus was purified and crystallized and a native X-ray diffraction data set was collected to 2.5 Å using synchrotron radiation