PROPRIETA’ PRO-APOPTOTICHE DI EUPLOTINA C, UN METABOLITA SECONDARIO ISOLATO DAL CILIATO MARINO EUPLOTES CRASSUS: MECCANISMI MOLECOLARI.

PROPRIETA’ PRO-APOPTOTICHE DI EUPLOTINA C, UN METABOLITA SECONDARIO ISOLATO DAL CILIATO MARINO EUPLOTES CRASSUS: MECCANISMI MOLECOLARI. RAZIONALE L’apoptosi è un vero e proprio programma di morte potenzialmente presente in tutte le cellule, codificato a livello del loro genoma, che determina l’eliminazione controllata di alcune cellule per salvaguardare la sopravvivenza dell’organismo nel suo complesso. L’innesco del processo apoptotico può essere mediato da numerosi stimoli, e può avvenire secondo meccanismi diversi, a seconda del tipo di cellula coinvolta, che sembrano comunque convergere verso una sequenza di eventi altamente conservata. La concentrazione di Ca2+ intracellulare ([Ca2+]i) sembra rivestire un ruolo cruciale nel processo apoptotico. In particolare, la fase di innesco è seguita da una fase esecutrice in cui la cellula va incontro a diversi cambiamenti biochimici che culminano con l'attivazione di enzimi catabolici (proteasi e nucleasi) che tagliano proteine e DNA. In una morte cellulare per apoptosi si devono riscontrare condensazione nucleare, frammentazione del nucleo, taglio del DNA in frammenti internucleosomali e formazione di corpi apototici senza rottura della membrana plasmatica. Un ruolo principale è giocato dalle caspasi (cistein-proteasi). Infatti, dopo attivazione delle caspasi iniziatrici si attivano, con un segnale a cascata, le caspasi esecutrici che tagliano proteine critiche per la sopravvivenza cellulare inducendo cosi la morte della cellula. Attualmente sono stati identificati diversi meccanismi di apoptosi che possono comunicare e interscambiare alcuni componenti e che possono o meno essere associati all'attivazione delle caspasi. Molti agenti farmacologici già in uso nella terapia contro i tumori ed alcuni potenziali agenti antitumorali attualmente in fase di sperimentazione, sono composti ad azione citotossica/proapoptotica che derivano da piante, animali, organismi marini e microrganismi. La ricerca sui composti naturali ha dimostrato che spesso funzionano come “armi chimiche” evolute in quanto potenti inibitori di processi cellulari nelle prede, nei predatori, nei parassiti o nei competitori degli organismi che li producono. I sesquiterpeni, in particolare, sono una classe di molecole che hanno dimostrato un potenziale terapeutico nella riduzione della progressione tumorale. Si tratta di isoprenoidi a 15 atomi di carbonio presenti tipicamente nelle piante e negli organismi marini. L’aldeide sesquiterpenica euplotina C, uno dei metaboliti secondari prodotti dal protozoo ciliato marino Euplotes Crassus, ha una notevole attività biologica in quanto uccide i ceppi di Euplotes non produttori di euplotine, mentre a dosi sub-letali altera il ciclo cellulare, la motilità cellulare e la forma cellulare. Studi precedenti, condotti dal gruppo di ricerca della Prof. Bagnoli (Dip. di Biologia-Unità di Fisiologia Generale) su cellule tumorali AtT-20 (corticotrope di topo) e PC12 (cromaffini di ratto) hanno dimostrato l’effetto citotossico dell’euplotina C a concentrazioni micromolari e la sua capacità di indurre morte cellulare per apoptosi. In particolare, l’apoptosi si manifesta dopo le 6 h di trattamento. Inoltre, l’euplotina C induce un rapido e sostenuto aumento della [Ca2+]i attraverso la deplezione di Ca2+ dai compartimenti del reticolo endoplasmatico (RER). In particolare, l’euplotina C determina l’apertura dei canali al Ca2+ rianodinici presenti sulla membrana der RER. Questa tesi ha lo scopo di indagare ulteriormente i meccanismi molecolari che mediano l’effetto apoptotico dell’euplotina C. Infatti, la valutazione delle potenzialità terapeutiche di un composto naturale si basa, oltre che sullo studio del tipo di attività biologica, anche sulla comprensione dei meccanismi biochimici che ne regolano l’azione. In questa ottica, la conoscenza dei meccanismi di traduzione del segnale apoptotico mediato dall’euplotina C nelle cellule tumorali rappresenta un passaggio essenziale. RISULTATI Nelle cellule PC12, è stato valutato l’effetto dell’euplotina C su i) una serie di fattori pro- e anti- apoptotici tipicamente coinvolti nei processi di morte cellulare e, ii) su enzimi effettori quali le calpaine (proteasi calcio-dipendenti) e le caspasi. Infine è stato studiato anche l’effetto dell’euplotina C sull’induzione di stress ossidativo. Misure di vitalità cellulare (test MTT) dopo applicazione di euplotina C in presenza o meno di rianodina, uno specifico bloccante dei canali rianodinici, hanno dimostrato che la rianodina è in grado di inibire, almeno in parte, l’azione citotossica del sesquiterpene, suggerendo l’importanza fondamentale del Ca2+ come mediatore dell’apoptosi indotta da euplotina C. La deplezione di Ca2+ dal RER può indurre il cosiddetto “stress del reticolo”. La proteina chaperone Bip/GRP78 è comunemente usata come indicatore di stress. Mediante tecnica di Western blot abbiamo dimostrato che l’espressione di tale proteina aumenta in presenza di euplotina C a partire da 1 h di trattamento fino ad un massimo dopo 6 h. Oltre al RER anche altri organuli intracellulari, tra cui i mitocondri, costituiscono importanti sedi di integrazione tra la fase di induzione apoptotica e l’attivazione delle caspasi (fase di esecuzione). Fattori pro-apoptotici come Bax, una volta traslocati dal citosol alla membrana mitocondriale determinano la formazione di megapori inducendo la caduta del potenziale mitocondriale e la fuoriuscita di fattori necessari per il prosieguo della cascata apoptotica, tra cui il citocromo c. Al contrario fattori anti-apoptotici come BCl-2 garantiscono l’integrità della membrana mitocondriale e sono in grado di sequestrare e silenziare fattori proapoptotici. Mediante PCR semiquantitativa abbiamo dimostrato che l’espressione dell’mRNA di Bax aumenta dopo 1-3 h di trattamento con euplotina C, per poi tornare a valori basali dopo 6 h dal trattamento. Al contrario l’espressione dell’mRNA di BCl-2 diminuisce progressivamente a partire da 1 h di trattamento con euplotina C. Questi risultati sono stati confermati in maniera speculare dallo studio dell’espressione delle proteine Bax e Bcl-2 tramite Western blot. Con la stessa tecnica abbiamo dimostrato che l’espressione del citocromo c aumenta dopo applicazione di euplotina C a partire da 1 h di trattamento. In particolare, l’incremento del citocromo c si verifica in estratti citosolici privi di mitocondri suggerendo che tale proteina viene indotta dall’euplotina C a traslocare dal lume mitocondriale al citosol. Abbiamo quindi spostato la nostra attenzione sulla fase di esecuzione del programma apoptotico, studiando l’effetto di euplotina C su alcuni importanti effettori implicati nel processo di morte cellulare. La procaspasi-12, è una proteina localizzata sul versante citoplasmatico della membrana del RER che in seguito ad un prolungato “stress del reticolo” ed alla mobilitazione del Ca2+ dal RER viene attivata a caspasi-12. Esperimenti di Western blot hanno dimostrato che solo tempi di incubazione prolungati delle cellule con l’euplotina C (6 h) causano una diminuzione dei livelli di procaspasi-12, suggerendo che l’attivazione della caspasi-12 interviene solo in seguito ad una esposizione prolungata delle cellule all’euplotina C. L’attività della caspasi-3, una delle principali caspasi esecutrici del programma di morte cellulare, spesso utilizzata come marker apoptotico, è stata determinata mediante un test colorimetrico condotto su cellule trattate a diversi tempi con l’euplotina C. Dopo 3-6 h di trattamento con l’euplotina C si verifica un incremento dell’attività della caspasi-3, suggerendo il coinvolgimento di tale enzima nel processo apoptotico indotto da euplotina C. Anche le proteasi della famiglia delle calpaine possono essere implicate nella fase di esecuzione dell’apoptosi e possono essere attivate in seguito ad un aumento massivo della [Ca2+]i. Nel nostro studio, l’espressione dell’mRNA della calpaina e la sua l’attivita enzimatica sono stata valutate in cellule trattate con euplotina C mediante PCR semiquantitativa e dosaggio enzimatico fluorescente. L’espressione dell’mRNA della calpaina aumenta dopo 1-3 h di trattamento con euplotina C, per poi tornare a valori basali dopo 6 h dal trattamento. Anche l’attività della calpaina risulta incrementata dopo 1 h di applicazione di euplotina C per poi tornare a livelli basali dopo 3-6 di trattamento. Per sostenere l’importanza dell’attività della calpaina nel processo di apoptosi indotto dall’euplotina C, la vitalità delle cellule è stata misurata con il test MTT in assenza o in presenza di uno specifico inibitore delle calpaine. I risultati dimostrano che l’applicazione dell’inibitore delle calpaine induce morte cellulare in assenza di euplotina C suggerendo che le calpaine attivate in condizioni di Ca2+ basale hanno un ruolo importante per la sopravvivenza cellulare. D’altra parte, l’applicazione dell’inibitore delle calpaine sembra potenziare l’efficacia citotossica dell’euplotina C. Per spiegare questo risultato possiamo speculare che l’attivazione delle calpaine da parte di euplotina C possa svolgere un ruolo di feedback negativo che limita l’azione citotossica del sesquiterpene. Tuttavia, la verifica di questa ipotesi ha bisogno di ulteriore approfondimento. Lo stress ossidativo è un processo che avviene all’interno delle cellule in seguito ad una massiccia produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e può essere indotto da insulti tossici subiti dalla cellula. Lo stress ossidativo può essere un’importante componente dei meccanismi apoptotici. Esperimenti condotti tramite test MTT dopo applicazione di euplotina C in presenza o meno di uno specifico inibitore di ROS hanno dimostrato che gli effetti citotossici di euplotina C sono ridotti, almeno in parte, in presenza dell’inibitore, suggerendo che la generazione di ROS è un meccanismo del processo apoptotico indotto dall’euplotina C. Tale ipotesi è stata verificata ulteriormente misurando la generazione di ROS con un dosaggio fluorescente. Infatti, l’applicazione dell’euplotina C causa un rapido aumento della generazione di ROS; tale aumento è lineare e progressivo, con un massimo dopo 3 h dall’applicazione di euplotina C. Al fine di stabilire se Ca2+ de generazione di ROS agiscono in concomitanza od in maniera indipendente nel processo apoptotico indotto da euplotina C, sono state effettuate misure della [Ca2+]i con tecnica spettrofluorimetrica. In particolare, abbiamo dimostrato che l’incremento della [Ca2+]i indotta da euplotina C è significativamente ridotta in presenza dell’inibitore di ROS. Questi risultati suggeriscono che la deplezione del Ca2+ dal RER indotta da euplotina C è in qualche modo facilitata dall’induzione di stress ossidativo all’interno delle cellule, suggerendo una sorta di interazione tra vie di trasduzione Ca2+-dipendenti e stress ossidativo

Toxic organic contaminants in airborne particles: levels, potential sources and risk assessment

In the last years, many studies have focused on risk assessment of exposure of workers to airborne particulate matter (PM). Several studies indicate a strong correlation between PM and adverse health outcomes, as a function of particle size. In the last years, the study of atmospheric particulate matter has focused more on particles less than 10 m or 2.5 m in diameter; however, recent studies identify in particles less than 0.1 m the main responsibility for negative cardiovascular effects. The present paper deals with the determination of 66 organic compounds belonging to six different classes of persistent organic pollutants (POPs) in the ultrafine, fine and coarse fractions of PM (PM < 0.1 m; 0.1 < PM < 2.5 mand 2.5 < PM < 10 m) collected in three outdoor workplaces and in an urban outdoor area. Data obtained were analyzed with principal component analysis (PCA), in order to underline possible correlation between sites and classes of pollutants and characteristic emission sources. Emission source studies are, in fact, a valuable tool for both identifying the type of emission source and estimating the strength of each contamination source, as useful indicator of environment healthiness. Moreover, both carcinogenic and non-carcinogenic risks were determined in order to estimate human health risk associated to study sites. Risk analysis was carried out evaluating the contribution of pollutant distribution in PM size fractions for all the sites. The results highlighted significant differences between the sites and specific sources of pollutants related to work activities were identified. In all the sites and for all the size fractions of PM both carcinogenic and non-carcinogenic risk values were below acceptable and safe levels of risks recommended by the regulatory agencies

Molecular mechanisms of euplotin C-induced apoptosis: involvement of mitochondrial dysfunction, oxidative stress and proteases

The metabolite euplotin C (EC), isolated from the marine ciliate Euplotes crassus, is a powerful cytotoxic and pro-apoptotic agent in tumour cell lines. For instance, EC induces the rapid depletion of ryanodine Ca2+ stores, the release of cytochrome c from the mitochondria, and the activation of caspase-3, leading to apoptosis. The purpose of this study was to gain further insight into the mechanisms of EC-induced apoptosis in rat pheochromocytoma PC12 cells. We found that EC increases Bax/Bcl-2 ratio and that Bax is responsible of the EC-induced dissipation of the mitochondrial membrane potential (Δψm). In addition, EC induces the generation of reactive oxygene species (ROS) without involvement of p53. The inhibition of ROS generation prevents, at least in part, the pro-apoptotic effects of EC as well as the effects of EC on Bax, Δψm and intracellular free Ca2+, indicating a cross-talk between different pathways. However, definition of the effector cascade turns out to be more complex than expected and caspase-independent mechanisms, acting in parallel with caspases, should also be considered. Among them, EC increases the expression/activity of calpains downstream of ROS generation, although calpains seem to exert protective effects.L'articolo è disponibile sul sito dell'editore http://www.springerlink.co

Role of Daptomycin in Cutaneous Wound Healing: A Narrative Review

Daptomycin is active against Gram-positive bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the on-label indications for its use include complicated skin and skin structure infections (cSSSI). We performed a narrative review of the literature with the aim to evaluate the role of daptomycin in the skin wound healing process, proposing our point of view on the possible association with other molecules that could improve the skin healing process. Daptomycin may improve wound healing in MRSA-infected burns, surgical wounds, and diabetic feet, but further studies in humans with histological examination are needed. In the future, the combination of daptomycin with other molecules with synergistic action, such as vitamin E and derivates, IB-367, RNA III-inhibiting peptide (RIP), and palladium nanoflowers, may help to improve wound healing and overcome forms of antibiotic resistanc

Determination of the main bioaerosol components using chemical markers by liquid chromatography–tandem mass spectrometry

This work is part of an extensive research project aimed at the determination and characterization of bioaerosol with a multidisciplinary approach. In this context, one of the main objectives of the project has been the development of a comprehensive analytical method for the determination of different chemical biomarkers of the bioaerosol, by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. The following biomarkers have been considered, and correlated to specific components of bioaerosol as unambiguous indicators: • ergosterol fungal components • chlorophylls, phytosterols (stigmasterol and b-sitosterol), -tocoferol vegetable cells and algae • cholesterol animal cells, vegetable cells and algae. • dipicolinic acid bacterial spores • muramic and meso-2,6-diaminopimelic acid bacterial cells To verify the method, to find diagnostic ratios and to calculate the appropriate conversion factors, fungal spores, bacterial cells and spores, and algae of known species, commonly airborne, were analysed. The material was subjected to freezing and de-freezing cycles, followed by extraction, hydrolysis and purification of the biomarkers. The chromatographic separation of the bacterial biomarkers was achieved by using a polymeric column, based on Hydrophilic Liquid Interaction with the electrospray ionization mass spectrometric detection, whereas sterols and chlorophylls were separated by a reversed phase column, coupled to atmospheric pressure chemical ionization – tandem mass spectrometer. The optimized method was applied to environmental particulate matter sampled in an outdoor site. Bacterial and fungal content was compared to the results obtained from the classical direct viable counting method in the sampled particulate matte

Fibrin gel: a new scaffold for cardiovascular applications

Aims: Peripheral blood endothelial progenitor cells (EPC) are promising therapies for irreversible myocardial damage, heart failure and peripheral ischemia disease. Natural biopolymers as fibrin are appealing in tissue engineering, because fibrin is biocompatible and bioresorbable. In vitro studies indicate that fibrin can support the growth migration and proliferation of several cells types. Up to date numerous studies have proved the potential of fibrin based injectable cell delivery systems. No studies are available with fibrin as scaffold for EPC. The goal of this study was to investigate if fibrin is a suitable matrix for EPC culture as compared with fibronectin and if different concentrations of fibrinogen (Fb) and thrombin (Th) can influence fibrin structure and EPC behaviour. Methods: Fibrin (Kedrion S.p.a. Lucca, Italy) was prepared mixing Fb (final 4.5-9-18-36 mg/ml) and Th (final 6-12.5-25-50 U/ml). The scaffolds were maintained for 1 hour at 37?C, 5% CO2 before cell seeding. The ultrastructure of fibrin was investigated by scanning electron microscopy (SEM), cryogenic SEM (CRYO-SEM) and atomic force microscopy (AFM) that allow the hydratating analysis of the sample, to evaluate fibre diameter and density. EPC were obtained from peripheral blood of healthy donors and cultured for 1 week on fibrin at the concentration of 1x106 cell/ml in endothelial growth medium. EPC seeded on fibronectin were used as control. Metabolic cell activity on the different scaffolds was assessed after 7 and 14 days by WST1 while cell viability by confocal microscopy (Calcein AM incorporation). Results: Fibrin polymerization rate ranged between 17 and 68 seconds and increased at higher Fb or Th concentrations. Both AFM and SEM analysis revealed a nanometric fibrous structure, with a decrease in fiber diameter with higher fibrinogen concentrations (4.5 mg/ml: 166?4 nm. vs. 36 mg/ml: 119?3 nm, p<0.005, n=5). Different concentrations of Th didn\u27t affect fibre diameter and density. CRYO-SEM suggested a reticulate structure with mesh-size up to 10?m. WST1 assay showed that EPC metabolic activity was better with lower fibrinogen concentrations (4.5 mg/ml: 0.890?0.134 a.u. vs. 36 mg/ml 0.234?0.046 a.u., p<0.05, n=5), while Th had no significant effect. Calcein staining demonstrated that EPC were viable at 14 days and even organised in cluster. Conclusions: Fibrin combines important properties of an ideal biological scaffold, like the nanometric structure, important for the growth and migration of cells. Fibrin is also an ideal scaffold for EPC but the ratio between fibrinogen and thrombin is important for cell viability

ASPECTOS PRODUTIVOS DO USO DE BIOESTIMULANTES NA CULTURA DA SOJA

A utiliza&ccedil;&atilde;o de bioestimulantes proporciona incrementos no desenvolvimento vegetal, embora poucos estudos tenham abordado aspectos fisiol&oacute;gicos da soja relacionados &agrave; aplica&ccedil;&atilde;o destes produtos. Sendo assim o presente trabalho tem por objetivo avaliar o efeito de diferentes dosagens do produto bioestimulante a base de extrato de algas marinhas no incremento da produtividade da soja. O experimento foi realizado em propriedade rural, no munic&iacute;pio de Ubirat&atilde;-PR. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 5 tratamentos e 4 repeti&ccedil;&otilde;es, totalizando 20 parcelas. As vari&aacute;veis analisadas foram: n&uacute;mero de vagens por planta, massa de 100 sementes, n&uacute;mero de gr&atilde;os por planta, comprimento da raiz e peso seco da raiz. Os dados obtidos foram submetidos &agrave; an&aacute;lise de vari&acirc;ncia e as m&eacute;dias dos tratamentos comparadas pelo teste tukey a 5% de signific&acirc;ncia, com aux&iacute;lio do programa estat&iacute;stico ASSISTAT. Em rela&ccedil;&atilde;o ao n&uacute;mero de vagens, n&uacute;mero de gr&atilde;os por planta e tamanho da raiz, o uso de bioestimulante a base de extrato de algas demonstrou ganhos produtivos significativos para a cultura da soja. Mas em rela&ccedil;&atilde;o &agrave; massa de 100 gr&atilde;os e peso seco da raiz, n&atilde;o houve incremento.&nbsp

Development of a new technology for 3-D nanostructured scaffolds with potential cardiovascular applications

Aims The in situ release and maintaining of cells to promote revascularization is a new goal of cardiovascular therapy. Endothelial progenitor cells (EPC) may contribute to the process of vascular repair. Medical devices realized according to tissue engineering are composed by a cellular component and by an artificial component, usually made of a biocompatible polymer. Scaffolds may be coated with bio-polymers like fibrin to enhance cell adhesion and growth. Aim of this study was to realize nanocomposite 3D scaffolds composed by a synthetic polymer coated with fibrin to support EPC growth and to promote in vivo angiogenesis. Methods 3D PEtU-PDMS scaffolds were studied in vitro for their biocompatibility (viability and proliferation tests; citokine release). In vivo biocompatibility was studied by intramuscular implant in a rabbit model. The scaffolds were fabricated by spray-phase inversion technique. 25U/mL thrombin was sprayed during the fabrication process. The composite scaffold was then incubated o.n. at 37?C with 18mg/mL fibrinogen. The scaffold morphology was analysed by stereo-microscopy and by scanning electron microscopy (SEM). EPC obtained from peripheral blood were cultured for 1 week on the scaffolds at the concentration of 1x106 cell/ml. Fibronectin coating was used as a control. Cell viability was assessed by confocal laser (Calcein-AM incorporation). To test in vivo angiogenesis, EPC-seeded scaffolds were subcutaneously implanted into the back of rats for 14 days. After harvesting, the scaffolds were examined histologically and immunohistochemically to evaluate inflammatory response and neovascularization. Results In vitro and in vivo biocompatibility data demonstrated absence of any citotoxic effect, immunocompatibility and a slight inflammatory reaction without any sign of encapsulation and implant rejection. Morphological analyses showed an homogeneus fibrin coating of the scaffolds, tightly bound and interconnected to the PEtU-PDMS surface. SEM showed the presence of a well organized layer of fibres in a nm scale (mean diameter ~140nm). Cell viability and phenotype were not affected when EPC were seeded on PEtU-PDMS/fibrin scaffolds. The histological observation of explanted scaffolds revealed a slightly inflammatory response and a significant increased numbers of neovessels in tissues surrounding the EPC-seeded scaffold as compared to the scaffold without cells. Conclusions Our data suggest that PEtU-PDMS/fibrin scaffold obtained with a new spray manufacturing technology can support in vitro EPC growth and promote in vivo neovascularisation. Further studies are currently under way in an ischemic hindlimb rat model

Thymol-functionalized hyaluronic acid as promising preservative biomaterial for the Inhibition of Candida albicans biofilm formation

Hyaluronic acid (HA) is a naturally occurring biopolymer that has been employed for a plethora of medicinal applications. Nevertheless, as HA is a natural polysaccharide, it can be a substrate able to promote microbial growth and proliferation. Biopolymer–drug conjugates have gained attention over the years to overcome drawbacks of each single component. Within this context, thymol (Thy), a phenolic compound occurring in essential oils (EOs) extracted from Thymus and Origanum, has been largely studied for its antimycotic applications. However, it is characterized by a low water solubility and moderate cytotoxicity. Herein, we report an innovative HA–thymol conjugate (HA-Thy) biomaterial to circumvent the drawbacks of free thymol use by providing the polymer conjugate with the beneficial properties of both components. Preliminary biological tests evidenced the decrease of thymol cytotoxicity for the HA-Thy conjugate, paired with a promising antibiofilm formation activity against Candida albicans, similar to pure thymol, highlighting its potential application as a preservative biomaterial in formulations