Clostridium botulinumin geneettiset stressinsieto- ja itiöintimekanismit

Clostridium botulinum presents a significant hazard to the food processing industry. However, the cellular mechanisms and factors that contribute to their regulation utilized by this feared foodborne pathogen in response and adaptation to food processing and storage-induced stress are poorly characterized. Another major aspect of C. botulinum presenting serious implications on food safety is its capability to produce heat-resistant endospores. Nevertheless, the sporulation cascade of C. botulinum has not been characterized. This study sought to investigate the effects of temperature downshift on the global gene expression pattern of Group I C. botulinum type strain ATCC 3502, and further characterize the roles of regulatory mechanisms identified as cold tolerance-related. Furthermore, the role of a major regulatory element, the alternative sigma factor SigK, in the sporulation cascade of C. botulinum was determined. Additionally, its putative function in stress tolerance was investigated. Transcriptomic analysis of the foodborne pathogen C. botulinum ATCC 3502 upon temperature downshift revealed the induction of several mechanisms previously identified as cold-related in other bacteria, thus suggesting that also C. botulinum utilizes these mechanisms in cold tolerance. Mechanisms with hitherto uncharacterized functions in cold tolerance were also found. The results suggested that secondary oxidative stress was present as a component of cold stress. Additionally, two previously uncharacterized putative DNA-binding regulatory proteins CBO0477 and CBO0558A were shown to play a role in cold tolerance of C. botulinum ATCC 3502. The two-component system (TCS) CBO0366/CBO0365 was shown to be important in the cold tolerance of C. botulinum ATCC 3502. Expression of this TCS was induced upon temperature downshift, but not under optimal temperature and growth conditions. Disruption of either of the TCS components resulted in deteriorated cold tolerance, whereas over-expression of cbo0366 in a wild-type strain resulted in an increase of growth rate at low temperature. Inactivation of the TCS response regulator-encoding cbo0365 markedly altered the transcriptome of C. botulinum ATCC 3502. Totals of 150 and 141 chromosomal coding sequences (CDS) were significantly differently expressed in the cbo0365 mutant at either 37 °C or 15 °C, respectively. There was an overlap of 141 common CDSs between the two temperatures. The genes differentially expressed included ones related to acetone-butanol-ethanol (ABE) fermantion, arsenic resistance, phosphate uptake and flagellar rotation. The involvement of CBO0365-regulated metabolic pathways in cold tolerance was demonstrated by the deteriorated cold tolerance of mutants of the respective pathways. Cold-sensitive phenotypes were observed for mutants of the acetone-butanol-ethanol fermentation pathway components bcd, crt, bdh and ctfA, the arsenic detoxifying machinery components arsC and arsR, and the phosphate uptake mechanism component phoT. Electrophoretic mobility shift assays confirmed transcriptional activation or repression as a means for CBO0365 in regulating itself, and the crt, ars, and pho operons. A dual role for the alternative sigma factor SigK in sporulation and in stress tolerance of C. botulinum ATCC 3502 was demonstrated. Disruption of SigK halted sporulation at an early stage but the phenotype was restored by in trans complementation of the mutation. The expression of sigK was induced upon exposure to low temperature and high salinity, but not upon a downshift in pH. A deteriorated tolerance to low temperature and to high salinity was observed for the sigK mutant strains.Elintarvikevälitteinen taudinaiheuttaja, Clostridium botulinum -bakteeri, voi elintarvikkeessa kasvaessaan tuottaa voimakkainta tunnettua biologista myrkkyä, botulinumneurotoksiinia. Elimistöön päästyään toksiini sitoutuu motorisiin hermopäätteisiin estäen hermoimpulssin välittymisen lihakseen. Tästä seurauksena on etenevä velttohalvaus, botulismi, joka voi hoitamattomana johtaa kuolemaan hengityslihasten lopulta halvaantuessa. C. botulinum muodostaa erittäin kestäviä lepomuotoja eli itiöitä, joita esiintyy yleisesti ympäristössä ja siten myös elintarvikkeiden raaka-aineissa. Itiöiden riittävä tuhoaminen elintarvikkeista vaatii erittäin voimakasta lämpökäsittelyä; kuluttajien mieltymysten vuoksi tällaiset käsittelyt ovat kuitenkin epätoivottuja. Patogeenien lisääntyminen elintarvikkeissa pyritäänkin usein estämään yhdistämällä useita lievempiä käsittelyjä ja olosuhteita, joista tärkein on alhainen säilytyslämpötila. Ymmärrys patogeenisten bakteerien tavoista selviytyä näistä esteistä on tärkeää tehokkaiden elintarviketurvallisuuden hallintakeinojen kehittämiseksi. Tästä huolimatta, tutkimustieto keinoista joiden avulla C. botulinum pystyy selviämään ja sopeutumaan elintarvikeprosessien olosuhteisiin on vaillinaista; sen itiöintikoneistoa ei ole aiemmin tutkittu lainkaan. Tässä väitöstutkimuksessa selvitettiin C. botulinum -tyyppikannan ATCC 3502 geneettisiä mekanismeja elintarvikkeiden prosessoinnissa ja säilytyksessä kohtaamiensa ympäristöolosuhteiden, erityisesti alhaisen lämpötilan, havaitsemiseen ja niihin sopeutumiseen. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin kannan itiöinnin geneettistä säätelyä. Koko genomin tasolla tehdyssä geenien ilmentymisanalyysissa havaittiin kohdennettu nopea vaste lämpötilan laskuun, sekä kattava aineenvaihdunnan uudelleenjärjestely pidempiaikaisen kylmäaltistuksen seurauksena. Useita muilla bakteereilla kylmässä aktivoituvia ja niiden kylmänsiedossa tärkeiksi osoitettuja mekanismeja aktivoitui myös C. botulinumilla, näin ollen näillä mekanismeilla saattaa olla merkitystä myös C. botulinumin kylmänsiedossa. Kylmäaltistuksen seurauksena rasvahapposynteesiin, hapetus-pelkistystasapainoon, hapettavaan stressiin sekä raudan kuljetukseen ja varastointiin todennäköisesti liittyvien geenien ilmentyminen kasvoi. Nämä tulokset antavat viitteitä toissijaisen hapettavan stressin ja siltä suojautumiseen tarkoitettujen mekanismien roolista kylmänsiedossa tällä patogeenillä. Lisäksi osoitettiin kahden aiemmin karakterisoimattoman geenien ilmentymistä säätelevän tekijän (CBO0477 ja CBO0558A) merkitys kylmänsiedossa. Geeni-ilmentymistä säätelevän nk. kaksoiskomponenttijärjestelmä CBO0366/CBO0365:n ilmentymisen todettiin lisääntyvän kylmässä, ja sen todettiin olevan välttämätön kannan kasvulle alhaisessa lämpötilassa. Sen osoitettiin suoraan säätelevän useita aineenvaihduntareittejä kuten asetoni-butanoli-etanoli (ABE)-käymiseen, arseeninsietoon ja fosfaatin kuljetukseen liittyviä mekanismeja, joiden tässä tutkimuksessa havaittiin ensimmäistä kertaa liittyvän bakteerien kylmänsietoon. Lisäksi säätelytekijä SigK:lla havaittiin olevan kaksoisrooli sen ollessa C. botulinumille välttämätön sekä itiönmuodostuksen alkuvaiheessa että kasvussa alhaisessa lämpötilassa ja korkeassa suolapitoisuudessa

Transcriptomic Analysis of (Group I) Clostridium botulinum ATCC 3502 Cold Shock Response

Peer reviewe

PCR-menetelmä ryhmän I (proteolyyttisten) ja ryhmän II (ei-proteolyyttisten) Clostridium botulinum -kantojen erottamiseksi toisistaan

Clostridium botulinum on ehdottoman anaerobinen gram-positiivinen sauvabakteeri ja vaarallinen ruokamyrkytyspatogeeni. Sen tuottama hermomyrkky, botulinumtoksiini, aiheuttaa hengenvaarallista botulismia ihmisillä ja eläimillä. C. botulinum muodostaa itiöitä, jotka säilyvät äärimmäisissäkin ympäristöolosuhteissa. C. botulinum -kannat jaetaan metabolisten ominaisuuksiensa perusteella ryhmiin I-IV, joista ryhmät I ja II ovat ihmisille vaarallisia neurotoksiineja tuottavia. Ryhmän I kannat ovat proteolyyttisiä ja ryhmän II kannat ei-proteolyyttisiä. Bakteerin tuottaman toksiinin tyypin perusteella kannat jaetaan toksinotyyppeihin A-G, joista ryhmään I kuuluvat tyypit A, B ja F sekä ryhmään II tyypit B, E ja F. Koska samaa toksinotyyppiä olevia kantoja esiintyy sekä ryhmässä I että ryhmässä II, pelkän toksinotyypin perusteella kantojen erottelu ryhmiin ei ole mahdollista. Samaa toksinotyyppiä olevissa eri metabolisiin ryhmiin kuuluvissa kannoissa ainoa yhteinen tekijä on tuotetun toksiinin tyyppi. C. botulinum -kantojen tyypittämiseksi ryhmiin on tällä hetkellä käytössä erilaisia molekyylibiologisia menetelmiä, sekä perinteinen mikrobiologinen menetelmä jolla saadaan selville kannan proteolyyttisyys tutkimalla sen kykyä hajottaa kaseiinia. Molekyylibiologisista menetelmistä mainittakoon AFLP ja ribotyypitys. Menetelmien ongelmina ovat mm. niiden hitaus ja työläys sekä perinteisessä mikrobiologiassa epätarkka tulkinta. Tässä tutkimuksessa etsittiin ryhmien I ja II C. botulinum -kantoja erottelevat geenialueet DNAmikrosirutekniikan avulla. Ryhmien I ja II kaikista eri toksino-tyyppisistä (ryhmä I: A, B, F; ryhmä II: B, E, F) C. botulinum -kannoista eristetyt puhtaat DNA-näytteet leimattiin fluoresoivalla merkkiaineella ja hybridisoitiin C. botulinum ATCC 3502 DNA-mikrosirulle kilpailevaa hybridisaatiota käyttäen. Kontrollina käytettiin C. botulinum ATCC 3502 -kannan DNA:ta. DNA-mikrosirulla oli koettimina PCR-tuotteet ATCC 3502 -kannan kaikista geeneistä. Siten kaikkien näiden geenien läsnäoloa näytteessä pystyttiin tutkimaan yhdellä DNA-mikrosirukokeella. DNA:n hybridisaatioastetta koetinkohtaisesti tutkimalla etsittiin suurimman logaritmisen intensiteettieron ryhmien I ja II välillä antaneet geenialueet. Tunnistettujen alueiden perusteella suunniteltiin kuusi ryhmän I kannoille spesifistä alukeparia, joista kahden (CBO0250F/R ja CBO1073F/R) toimivuus testattiin 60 ryhmän I ja II eri toksinotyyppisellä C. botulinum -kannalla. PCR-menetelmä ryhmien I ja II erottamiseksi toisistaan optimoitiin käyttäen alukeparia CBO0250F/R, joka erotteli tarkasti kaikki 60 testattua C. botulinum -kantaa ryhmiin I ja II. Kehitetyllä PCR- menetelmällä voidaan erotella C. botulinum -kannat ryhmiin I ja II aikaisempiin molekyylibiologiin menetelmiin verrattuna huomattavasti nopeammin ja perinteisiin menetelmiin verrattuna luotettavammin. Menetelmä soveltuu rutiinikäyttöön C. botulinum -kantojen ryhmiin I ja II tyypittämiseen. Yksinkertaisten ja nopeiden tyypitysmenetelmien käyttö osana C. botulinumin diagnostiikkaa olisi tärkeää tautitapausten epidemiologisessa selvitystyössä, ja niitä tulisikin ottaa mahdollisimman paljon rutiinikäyttöön

PCR assay for differentiating between Group I (proteolytic) and Group II (nonproteolytic) strains of Clostridium botulinum.

Groups I (proteolytic) and II (nonproteolytic) C. botulinum are genetically and physiologically distinct groups of organisms, with both groups being involved with human botulism. Due to differences in spore heat resistance and growth characteristics, the two groups possess different types of human health risks through foods, drink, and the environment. The epidemiology of human botulism due to Groups I and II C. botulinum is poorly understood, largely due to insufficient characterization of disease isolates, and warrants thorough outbreak investigation with a particular attention to discrimination between the different physiological groups of C. botulinum. In this study, a PCR assay was developed to discriminate between Group I and Group II C. botulinum. The assay is based on the fldB associated with phenylalanine metabolism in proteolytic clostridia, and employs an internal amplification control targeted to conservative regions of 16S rrn in Groups I and II C. botulinum. The assay correctly identified all 36 Group I and 24 Group II C. botulinum strains, possessing a 100% exclusivity and inclusivity. The assay provides a substantial improvement in discriminating between the Groups I and II C. botulinum, which traditionally is based on a time-consuming and error-prone culture method. Differentiation between the physiological groups of C. botulinum is an essential step in investigation of human botulism outbreaks, and should be considered as a diagnostic corner-stone in order to improve our epidemiological understanding of human botulism

Growth of <i>C. botulinum</i> ATCC 3502 wild type, and <i>cbo0097</i>, <i>cbo0477</i> and <i>cbo0558A</i> mutants at 17°C.

<p>Growth of <i>C. botulinum</i> ATCC 3502 wild type (WT, A-C), <i>cbo0097</i> mutant (A), <i>cbo0477</i> mutant (B), and <i>cbo0558A</i> mutant (C) cultures in TPGY broth at 17°C. Antisense (AS) and sense (S) orientation mutants were constructed for each gene. The error bars represent the minimum and maximum OD₆₀₀ values measured for three independent biological replicates.</p

Strains and plasmids used in this study.

1<p>ATCC, American Type Culture Collection.</p

Confirmation of DNA microarray results with quantitative real-time reverse-transcription PCR (RT-qPCR).

<p>Log₂ fold changes of transcript levels measured with DNA microarrays (x-axis) and RT-qPCR (y-axis) in <i>C. botulinum</i> ATCC 3502 cultures 1 h after temperature downshift from 37°C to 15°C. 16S <i>rrn</i> transcript levels were used as a normalization reference in the RT-qPCR. Linear regression analysis showed an R² correlation value of 0.93 between the microarray and RT-qPCR transcription fold change results.</p

Distribution of significantly up- or down-regulated genes in functional categories.

<p>The number of significantly up- or down-regulated and unaffected genes 5 h after temperature downshift from 37°C to 15°C in <i>C. botulinum</i> ATCC 3502 divided into functional categories. The bar lengths portray the percentage of affected and unaffected genes of all genes assigned to each functional category. The functional categories were as described in the original annotation of the ATCC 3502 genome <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0089958#pone.0089958-Sebaihia1" target="_blank">[12]</a>. Genes with no expression data available due to poor array hybridization are assigned to the “Not affected/unknown” category.</p