Rôle du LSR dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol dans le système nerveux central

Cholesterol is a crucial lipid in the central nervous system (CNS) and its strict regulation ensures proper neuronal development and function. Cholesterol is synthesized in the CNS by glial cells which produce and secrete cholesterol to meet neuronal needs. Lipoproteins and their receptors are key elements of this intercellular transport: where the latter recognize, bind and endocytose lipoproteins containing cholesterol. The lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR) is the most recently discovered receptor in the CNS. It is a multimeric protein complex that undergoes conformational changes during the binding of free fatty acids, thus revealing a binding site which recognizes apolipoproteins B and E. Complete inactivation of the LSR gene is lethal at embryonic level, probably due to a leaky blood brain barrier. In addition, studies in LSR +/- mice have revealed a change in the distribution of cholesterol and cognitive functions. Our first goal was to perform LSR profiling at the tissue and cell level. Our results revealed a differential expression of the LSR subunits. In vitro studies in primary cell cultures have shown that LSR is highly expressed in different regions of the CNS, both in glial and neuronal cells. Our hypothesis was that a strong expression of LSR in glial cells could play a role in controlling the synthesis of cholesterol, by limiting the cholesterol circulating in the extracellular fluid of the brain. To verify this hypothesis, we have developed an inducible Cre-lox system specifically targeting glial cells. Behavioral phenotyping demonstrated a deficit in olfactory function which has an impact on the social memory of these animals. Although no visual problems were detected, the object recognition test showed that the visual memory was affected. Additionally, Y and Barnes mazes tests revealed an impacted short- and long-term memory. Our results suggest that specific inactivation of LSR in glial cells impairs animal memory, affecting spatial and social memory. Interestingly and similarly to AD, the early signs monitored olfactory deficits. Using a strategy combining behavioral phenotyping, immunostaining and biochemical analysis of specific markers of synaptic plasticity, this model could also be used to determine the role of LSR in brain cognition and cholesterol trafficking in the CNS, and could provide the means to validate LSR as a potential therapeutic target for the treatment of damage caused by lipid storage and the development of neurodegenerative diseases in the aging brain.Le cholestérol est un lipide crucial dans le système nerveux central (SNC) et sa régulation stricte assure un développement et une fonction neuronaux appropriés. Le cholestérol est synthétisé dans le SNC par les cellules gliales qui produisent et sécrètent le cholestérol pour répondre aux besoins neuronaux. Les lipoprotéines et leurs récepteurs sont des éléments clés de ce transport intercellulaire : où ces derniers reconnaissent, lient et endocytent les lipoprotéines contenant du cholestérol. Le récepteur de lipoprotéine stimulé par lipolyse (LSR) est le récepteur le plus récemment découvert dans le SNC. C'est un complexe protéique multimère qui subit des changements conformationnels lors de la liaison des acides gras libres, révélant ainsi un site de liaison qui reconnaît les apolipoprotéines B et E. L'inactivation complète du gène LSR est létale au niveau embryonnaire, probablement due à une fuite de la barrière hématoencéphalique. De plus, des études sur des souris LSR +/- ont révélé une modification de la distribution du cholestérol et des fonctions cognitives. Notre premier objectif était de réaliser le profilage LSR au niveau des tissus et des cellules. Nos résultats ont révélé une expression différentielle des sous-unités de LSR. Les études in vitro sur des cultures de cellules primaires ont démontré que le LSR était fortement exprimé dans différentes régions du SNC, à la fois dans les cellules gliales et neuronales. Notre hypothèse est qu'une forte expression du LSR dans les cellules gliales pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la synthèse du cholestérol, en limitant le cholestérol en circulation dans le liquide extracellulaire du cerveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons développé un système inductible Cre-lox ciblant spécifiquement les cellules gliales. Le phénotypage comportemental démontre un déficit de la fonction olfactive ayant un impact sur la mémoire sociale de ces animaux. Bien qu'aucun problème de vision n'ait été détecté, le test de reconnaissance d'objet a démontré que la mémoire visuelle était affectée. En outre, les tests sur le labyrinthe en Y et celui de Barns semblent affecter la mémoire à court et à long terme. Nos résultats suggèrent que l'inactivation spécifique de LSR dans les cellules gliales altère la mémoire des animaux, affectant la mémoire spatiale et sociale. Fait intéressant et similaire à AD, le signe précoce était lié au déficit en olfaction. En utilisant une stratégie combinant phénotypage comportemental, immunomarquage et analyse biochimique de marqueurs spécifiques de la plasticité synaptique, ce modèle pourrait également être utilisé pour déterminer le rôle du LSR dans la cognition cérébrale et le trafic de cholestérol dans le SNC, et pourrait fournir les moyens de valider le LSR en tant que cible thérapeutique potentielle pour le traitement des dommages causés par le stockage des lipides et le développement de maladies neurodégénératives dans le cerveau vieillissant

Role of LSR in the regulation of cholesterol homeostasis in the central nervous system

Le cholestérol est un lipide crucial dans le système nerveux central (SNC) et sa régulation stricte assure un développement et une fonction neuronaux appropriés. Le cholestérol est synthétisé dans le SNC par les cellules gliales qui produisent et sécrètent le cholestérol pour répondre aux besoins neuronaux. Les lipoprotéines et leurs récepteurs sont des éléments clés de ce transport intercellulaire : où ces derniers reconnaissent, lient et endocytent les lipoprotéines contenant du cholestérol. Le récepteur de lipoprotéine stimulé par lipolyse (LSR) est le récepteur le plus récemment découvert dans le SNC. C'est un complexe protéique multimère qui subit des changements conformationnels lors de la liaison des acides gras libres, révélant ainsi un site de liaison qui reconnaît les apolipoprotéines B et E. L'inactivation complète du gène LSR est létale au niveau embryonnaire, probablement due à une fuite de la barrière hématoencéphalique. De plus, des études sur des souris LSR +/- ont révélé une modification de la distribution du cholestérol et des fonctions cognitives. Notre premier objectif était de réaliser le profilage LSR au niveau des tissus et des cellules. Nos résultats ont révélé une expression différentielle des sous-unités de LSR. Les études in vitro sur des cultures de cellules primaires ont démontré que le LSR était fortement exprimé dans différentes régions du SNC, à la fois dans les cellules gliales et neuronales. Notre hypothèse est qu'une forte expression du LSR dans les cellules gliales pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la synthèse du cholestérol, en limitant le cholestérol en circulation dans le liquide extracellulaire du cerveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons développé un système inductible Cre-lox ciblant spécifiquement les cellules gliales. Le phénotypage comportemental démontre un déficit de la fonction olfactive ayant un impact sur la mémoire sociale de ces animaux. Bien qu'aucun problème de vision n'ait été détecté, le test de reconnaissance d'objet a démontré que la mémoire visuelle était affectée. En outre, les tests sur le labyrinthe en Y et celui de Barns semblent affecter la mémoire à court et à long terme. Nos résultats suggèrent que l'inactivation spécifique de LSR dans les cellules gliales altère la mémoire des animaux, affectant la mémoire spatiale et sociale. Fait intéressant et similaire à AD, le signe précoce était lié au déficit en olfaction. En utilisant une stratégie combinant phénotypage comportemental, immunomarquage et analyse biochimique de marqueurs spécifiques de la plasticité synaptique, ce modèle pourrait également être utilisé pour déterminer le rôle du LSR dans la cognition cérébrale et le trafic de cholestérol dans le SNC, et pourrait fournir les moyens de valider le LSR en tant que cible thérapeutique potentielle pour le traitement des dommages causés par le stockage des lipides et le développement de maladies neurodégénératives dans le cerveau vieillissant.Cholesterol is a crucial lipid in the central nervous system (CNS) and its strict regulation ensures proper neuronal development and function. Cholesterol is synthesized in the CNS by glial cells which produce and secrete cholesterol to meet neuronal needs. Lipoproteins and their receptors are key elements of this intercellular transport: where the latter recognize, bind and endocytose lipoproteins containing cholesterol. The lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR) is the most recently discovered receptor in the CNS. It is a multimeric protein complex that undergoes conformational changes during the binding of free fatty acids, thus revealing a binding site which recognizes apolipoproteins B and E. Complete inactivation of the LSR gene is lethal at embryonic level, probably due to a leaky blood brain barrier. In addition, studies in LSR +/- mice have revealed a change in the distribution of cholesterol and cognitive functions. Our first goal was to perform LSR profiling at the tissue and cell level. Our results revealed a differential expression of the LSR subunits. In vitro studies in primary cell cultures have shown that LSR is highly expressed in different regions of the CNS, both in glial and neuronal cells. Our hypothesis was that a strong expression of LSR in glial cells could play a role in controlling the synthesis of cholesterol, by limiting the cholesterol circulating in the extracellular fluid of the brain. To verify this hypothesis, we have developed an inducible Cre-lox system specifically targeting glial cells. Behavioral phenotyping demonstrated a deficit in olfactory function which has an impact on the social memory of these animals. Although no visual problems were detected, the object recognition test showed that the visual memory was affected. Additionally, Y and Barnes mazes tests revealed an impacted short- and long-term memory. Our results suggest that specific inactivation of LSR in glial cells impairs animal memory, affecting spatial and social memory. Interestingly and similarly to AD, the early signs monitored olfactory deficits. Using a strategy combining behavioral phenotyping, immunostaining and biochemical analysis of specific markers of synaptic plasticity, this model could also be used to determine the role of LSR in brain cognition and cholesterol trafficking in the CNS, and could provide the means to validate LSR as a potential therapeutic target for the treatment of damage caused by lipid storage and the development of neurodegenerative diseases in the aging brain

High-Throughput Mapping of 2'-O-Me Residues in RNA Using Next-Generation Sequencing (Illumina RiboMethSeq Protocol).

International audienceDetection of RNA modifications in native RNAs is a tedious and laborious task, since the global level of these residues is low and most of the suitable physico-chemical methods require purification of the RNA of interest almost to homogeneity. To overcome these limitations, methods based on RT-driven primer extension have been developed and successfully used, sometimes in combination with a specific chemical treatment. Nowadays, some of these approaches have been coupled to high-throughput sequencing technologies, allowing the access to transcriptome-wide data. RNA 2'-O-methylation is one of the ubiquitous nucleotide modifications found in many RNA types from bacteria, archaea, and eukarya. Here, we describe a reliable and optimized protocol based on alkaline fragmentation of total RNA coupled to a commonly used ligation approach followed by Illumina sequencing. We describe the methodology for detection and relative quantification of 2'-O-methylations with a high sensitivity and reproducibility even with a limited amount of starting material (1 ng of total RNA). Altogether this technique unlocks a technological barrier since it will be applicable for routine parallel treatment of biological and clinical samples to decipher the functions of 2'-O-methylations in pathologies

Age-related changes in regiospecific expression of Lipolysis Stimulated Receptor (LSR) in mice brain

International audienceThe regulation of cholesterol, an essential brain lipid, ensures proper neuronal development and function, as demonstrated by links between perturbations of cholesterol metabolism and neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease. The central nervous system (CNS) acquires cholesterol via de novo synthesis, where glial cells provide cholesterol to neurons. Both lipoproteins and lipoprotein receptors are key elements in this intercellular transport, where the latter recognize, bind and endocytose cholesterol containing glia-produced lipoproteins. CNS lipoprotein receptors are like those in the periphery, among which include the ApoB, E binding lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR). LSR is a multi-meric protein complex that has multiple isoforms including α and α', which are seen as a dou-blet at 68 kDa, and β at 56 kDa. While complete inactivation of murine lsr gene is embryonic lethal, studies on lsr +/-mice revealed altered brain cholesterol distribution and cognitive functions. In the present study, LSR profiling in different CNS regions revealed regiospecific expression of LSR at both RNA and protein levels. At the RNA level, the hippocampus, hypo-thalamus, cerebellum, and olfactory bulb, all showed high levels of total lsr compared to whole brain tissues, whereas at the protein level, only the hypothalamus, olfactory bulb, and retina showed the highest levels of total LSR. Interestingly, major regional changes in LSR expression were observed in aged mice which suggests changes in cholesterol homeostasis in specific structures in the aging brain. Immunocytostaining of primary cultures of mature murine neurons and glial cells isolated from different CNS regions showed that LSR is expressed in both neurons and glial cells. However, lsr RNA expression in the cerebellum was predominantly higher in glial cells, which was confirmed by the immunocytostaining profile of cerebellar neurons and glia. Based on this observation, we would propose that LSR in glial cells may play a key role in glia-neuron cross talk, particularly in the feedback control of cholesterol synthesis to avoid cholesterol overload in neurons and to maintain proper functioning of the brain throughout life

Targeted Suppression of Lipoprotein Receptor LSR in Astrocytes Leads to Olfactory and Memory Deficits in Mice

Perturbations of cholesterol metabolism have been linked to neurodegenerative diseases. Glia–neuron crosstalk is essential to achieve a tight regulation of brain cholesterol trafficking. Adequate cholesterol supply from glia via apolipoprotein E-containing lipoproteins ensures neuronal development and function. The lipolysis-stimulated lipoprotein receptor (LSR), plays an important role in brain cholesterol homeostasis. Aged heterozygote Lsr+/− mice show altered brain cholesterol distribution and increased susceptibility to amyloid stress. Since LSR expression is higher in astroglia as compared to neurons, we sought to determine if astroglial LSR deficiency could lead to cognitive defects similar to those of Alzheimer’s disease (AD). Cre recombinase was activated in adult Glast-CreERT/lsrfl/fl mice by tamoxifen to induce astroglial Lsr deletion. Behavioral phenotyping of young and old astroglial Lsr KO animals revealed hyperactivity during the nocturnal period, deficits in olfactory function affecting social memory and causing possible apathy, as well as visual memory and short-term working memory problems, and deficits similar to those reported in neurodegenerative diseases, such as AD. Furthermore, GFAP staining revealed astroglial activation in the olfactory bulb. Therefore, astroglial LSR is important for working, spatial, and social memory related to sensory input, and represents a novel pathway for the study of brain aging and neurodegeneration