Transcriptional and post-transcriptional control of eEF1A2 expression during myoblast diffrerentiation

During postnatal development, the switch of the expression from isoform A1 to the isoform A2 of eukaryotic translation elongation factor (eEF1A) is observed in neuronal and muscle tissues. The switch of the expression is a vital fundamental process, as mutant mice, with the partial EEF1A2 deletion dies on the 28th day after birth. Mechanism of the inhibition of A1 and stimulation of A2 expression during the first days of postnatal development is unknown. The existence of potential miRNA binding sites in the 3’UTR of mRNAs encoding the isoforms assumes a post-transcriptional control of abovementioned phenomenon. Aim. To check the possibility of post-transcriptional regulation of the isoforms A1 and A2 expression during differentiation of the human immortalized myoblasts cell line LHCN. Methods. The level of gene expression was quantified by qPCR, the existence of post-transcriptional regulation was demonstrated with Dual-Luciferase® Reporter Assay. Results. Using immortalized human myoblasts cell line LHCN, the induction of isoform A2 of eEF1 during differentiation of myoblasts was shown. The existence of transcriptional and post-transcriptional control of the abovementioned process was confirmed. Downregulation of mir-661 and mir-744 that have binding sites in the 3’ UTR of EEF1A2 mRNA, during differentiation suggests a potential role of microRNAs in the eEF1A2 induction during myoblast differentiation. Conclusions. Induction of A2 isoform of eEF1 during differentiation of myoblasts occurs on transcriptional and post-transcriptional level. Keywords: eEF1A1, eEF1A2, immortalized human myoblasts LHCN, differentiation, microRNA.Abstract У процесі постнатального розвитку в нейрональній і м’язовій тканинах відбувається зміна ізоформи А1 фактора елонгації трансляції на ізоформу А2. Перемикання експресії ізоформ є життєво важливою подією, оскільки мутантні миші, що містять делецію EEF1A2, гинуть на 28-й день після народження. Механізми інгібування А1 і стимуляції А2 протягом перших днів постнатального розвитку невідомі. Наявність сайтів зв’язування мікроРНК у 3'-нетрансльованих послідовностях мРНК ізоформ фактора елонгації трансляції передбачає існування посттранскрипційного контролю даного процесу. Мета. Перевірити можливість посттранскрипційної регуляції експресії ізоформ А1 і А2 під час диференціації імморталізованих міобластів людини LHCN. Методи. Рівень експресії генів визначали методом кількісної ПЛР, наявність посттранскрипційного контролю детектували методом репортерних генів. Результати. Використовуючи як модель клітинну лінію імморталізованих міобластів людини LHCN, показано індукцію ізоформи А2 фактора елонгації трансляції eEF1 при диференціації міобластів, наявність транскрипційного і посттранскрипційного контролю в даному процесі, а також потенційну участь мікро-РНК у процесі зміни експресії ізоформ. Висновки. Індукція ізоформи А2 протягом диференціації міобластів може відбуватися як на транскрипційному, так і на посттранскрипційному рівні. Ключові слова: eEF1A1, eEF1A2, імморталізовані міобласти людини LHCN, диференціація, мікроРНК

Leucine-zipper motif is responsible for self-association of translation elongation factor 1Bβ

Translation elongation factor 1Bβ (eEF1Bβ) is a metazoan-specific protein catalyzing the guanine nucleotide exchange on translation elongation factor 1A (eEF1A). eEF1Bβ was reported to form oligomers. Aim. To define the structural region of human eEF1Bβ that mediates its self-association. In addition, the various truncated forms of this protein were tested in the guanine nucleotide exchange assay with two isoforms of mammalian eEF1A. Methods. The truncated forms of eEF1Bβ were generated by PCR, cloned, expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Their apparent molecular masses were determined by analytical gel filtration and their guanine nucleotide exchange activities were assessed by filter binding assay. Results. Complete deletion of the N-terminal domain of eEF1Bβ does not affect its oligomerization propensity while deletion of the leucine-zipper motif drastically decreases the apparent molecular mass of the truncated form compared to the full-length protein. Also, the leucine-zipper motif of eEF1Bβ fused to glutathione S-transferase causes oligomerization of the chimeric protein. It was demonstrated that all N-terminally truncated forms of eEF1Bβ displayed similar catalytic activity to that of the full-length protein. Weak inhibitory effect on the catalytic activity was observed only for the truncated form with partially deleted central acidic region. Conclusions. The leucine-zipper motif facilitates oligomerization of recombinant eEF1Bβ. Stepwise deletion of the eEF1Bβ N-terminal domain does not significantly affect the guanine nucleotide exchange activity of the truncated proteins.Фактор елонгації трансляції 1Bβ(eEF1Bβ) – це білок, наявний лише у багатоклітинних організмів. Він каталізує обмін гуанінових нуклеотидів на факторі елонгації трансляції 1A (eEF1A). Відомо, що eEF1Bβ утворює олігомери. Мета. Визначити структурний домен eEF1Bβ людини, який опосередковує його олігомеризацію. Для встановлення ймовірного впливу N-кінцевої ділянки eEF1Bβ на каталітичну активність цього білка, було перевірено здатність різних вкорочених форм eEF1Bβ каталізувати обмін гуанінових нуклеотидів на обох ізоформах eEF1A ссавців. Методи. Фрагменти кДНК, які кодують вкорочені форми, eEF1Bβ отримували шляхом ПЛР ампліфікації, потім клонували у відповідні вектори, які експресували в клітинах Escherichia coli. Рекомбінантні білки очищали і їхні молекулярні маси визначали аналітичною гель-фільтрацією. Активність вкорочених форм eEF1Bβ перевіряли в реакції обміну гуанінових нуклеотидів. Результати. Видалення N-кінцевого домену eEF1Bβ не вплинуло на його олігомерізацію, в той час як видалення мотиву типу «лейцинова застібка» значно зменшувало молекулярну масу вкороченої форми білка в порівнянні з повнорозмірною. Також, амінокислотний мотив eEF1Bβ типу «лейцинова застібка» злитий з глутатіон S-трансферазою спричиняв олігомерізацію цього химерного білка. Показано, що всі вкорочені з N-кінця форми eEF1Bβ проявляли каталітичну активність, подібну до повнорозмірного білка. Інгібіторний ефект на каталітичну активність спостерігався лише для вкороченої форми білка, в якої була відсутня частина центрального негативно зарядженого регіону. Висновки. Амінокислотний мотив типу «лейцинова застібка» сприяє олігомерізації рекомбінантного eEF1Bβ. Поступове вкорочення N-кінцевого домену не має значного впливу на каталітичну активність eEF1Bβ.Фактор элонгации трансляции 1Bβ (eEF1Bβ) – белок, присутствующий только в многоклеточных организмах. Он катализирует обмен гуаниновых нуклеотидов на факторе элонгации трансляции 1A (eEF1A). Известно, что eEF1Bβ образует олигомеры. Цель. Определить структурный домен eEF1Bβ человека, который вызывает его олигомеризацию. Для исследования возможного влияния N-концевого участка eEF1Bβ на каталитическую активность этого белка, мы проверили способность различных укороченных форм eEF1Bβ катализировать обмен гуаниновых нуклеотидов на обеих изоформах eEF1A млекопитающих. Методы. Фрагменты кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bβ, получали при помощи ПЦР амплификации, потом клонировали в соответствующие вектора, которые экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали и их молекулярные массы определяли аналитической гель-фильтрацией. Активность укороченных форм eEF1Bβ проверяли в реакции обмена гуаниновых нуклеотидов. Результаты. Полное удаление N-концевого домена не влияло на олигомеризацию eEF1Bβ, однако удаление мотива типа «лейцинова застёжка» значительно уменьшало молекулярную массу укороченной формы белка по сравнению с полноразмерной. Также, присоединение аминокислотного мотива eEF1Bβ типа «лейциновая застёжка» к глутатион S-трансферазе вызвало олигомеризацию этого химерного белка. Показано, что все укороченные с N-конца формы eEF1Bβ проявляли такую же каталитическую активность, как и полноразмерный белок. Слабый ингибирующий эффект на каталитическую активность наблюдался лишь для укороченной формы белка с отсутствующей частью центрального негативно заряженного региона. Выводы. Аминокислотный мотив типа «лейциновая застёжка» способствует олигомеризации рекомбинантного eEF1Bβ. Постепенное укорочение N-концевого домена не оказывает значительного влияния на каталитическую активность eEF1Bβ

PTI-1: novel way to oncogenicity

Aim. The prostate tumor-inducing oncogene (PTI-1), presumably encoding a truncated form of eukaryotic translation elongation factor 1A1 (eEF1A1), was discovered as a gene overexpressed in prostate tumor samples and absent in normal tissues. The mechanism of PTI-1 oncogenicity remains obscure. Methods. Several bioinformatics methods were applied to analyze the PTI-1 mRNA structure, translation efficiency and coding potential. Results. In silico analysis of 5'UTR of its mRNA suggest that PTI-1 mRNA most probably belongs to the class of templates with low translation efficiency. Additionally, novel open reading frame (ORF) starting with alternative initiation site situated upstream of the main ORF start codon was found. Finally, the peptide that does not resemble eEF1A1 but is partially homologous to relaxin can be synthesized. Conclusions. We suggest that the alternative upstream start codon may initiate synthesis of a peptide (uPTI-1) homologous to relaxin, the hormone shown to promote the prostate cancer progression. uPTI-1 protein may interact with the respective relaxin-specific receptors, suggesting that the tumorigenic outcome of PTI-1 is possibly realized via the relaxin-dependent pathway. Keywords: prostate cancer, PTI-1, eEF1A1, non-coding RNA, relaxin, ORF, uAUG.Мета. Онкоген, який індукує рак простати (PTI-1), може кодувати вкорочену форму фактора елонгації eEF1A1. PTI-1 відкрито як ген, що надекспресується у зразках раку простати і не екпресується у нормальній тканині. Механізм онкогенної дії PTI-1 на сьогодні залишається нез’ясованим. Методи. Біоінформатичні методи застосовано для аналізу структури, ефективності трансляції і кодуючого потенціалу мРНК PTI-1. Результати. Аналізом in silico 5'UTR мРНК PTI-1 виявлено, що зазначений транскрипт належить до класу мРНК з низькою ефективністю трансляції. Додатково визначено нову відкриту рамку зчитування (ORF), яка починається з альтернативного старт-кодону і передує основній ORF. Пептид, що не має гомології з eEF1A1, але частково гомологічний релаксину, потенційно може синтезуватися з цієї альтернативної ORF. Висновки. Ми припустили, що з альтернативного старт-кодону починається синтез пептиду (uPTI-1), гомологічного релаксину, – гормону, що, як відомо, бере участь в індукції раку простати. Білок uPTI-1 може взаємодіяти з відповідним рецептором клітини, специфічним для релаксину, спричиняючи її трансформацію. Таким чином, онкогенна дія гена PTI-1 може реалізуватися релаксин-опосередкованим шляхом. Ключові слова: рак простати, PTI-1, eEF1A1, некодуюча РНК, релаксин, ORF, uAUG.Цель. Онкоген, индуцирующий рак простаты (PTI-1), может кодировать укороченную форму фактора элонгации eEF1A1. PTI-1 открыт как ген, сверхэкспрессирующийся в образцах рака простаты и не экспрессирующийся в нормальной ткани. Механизм онкогенного действия PTI-1 на сегодня остается неизвестным. Методы. Биоинформатические методы применены для анализа структуры, эффективности трансляции и кодирующего потенциала мРНК PTI-1. Результаты. С использованием анализа in silico 5'UTR мРНК PTI-1 виявлено, что указанный транскрипт принадлежит к классу мРНК с низкой эффективностью трансляции. Дополнительно определена новая открытая рамка считывания (ORF), начинающаяся с альтернативного старт-кодона и находящаяся перед основной ORF. Пептид, не имеющий гомологии с eEF1A1, но частично гомологичный релаксину, потенциально может синтезироваться с этой альтернативной ORF. Выводы. Мы предположили, что с альтернативного старт-кодона начинается синтез пептида (uPTI-1), гомологичного релаксину, – гормону, участвующему, как известно, в индукции рака простаты. Белок uPTI-1 может взаимодействовать с соответствующим рецептором клетки, специфическим для релаксина, приводя к ее трансформации. Таким образом, онкогенное действие гена PTI-1 может реализоваться релаксин-опосредованным путем. Ключевые слова: рак простаты, PTI-1, eEF1A1, некодирующая РНК, релаксин, ORF, uAUG

Elaboration of new method of enzyme adsorption on silicalite and nano beta zeolite for amperometric biosensor creation

Aim. Optimization of a new method of enzyme immobilization for amperometric biosensor creation. Methods. The amperometric biosensor with glucose oxidase immobilized on zeolites as bioselective elements and platinum disk electrode as transducers of biochemical signal into the electric one was used in the work. Results. The biosensors based on glucose oxidase adsorbed on zeolites were characterized by a higher sensitivity to glucose and a better inter-reproducibility. The best analytical characteristics were obtained for the biosensors based on nano beta zeolite. It has been found that an increase in the amount of zeolite on the surface of amperometric transducer may change such biosensor parameters as sensitivity to the substrate and duration of the analysis. Conclusions. The proposed method of enzyme immobilization by adsorption on zeolites is shown to be quite promising in the development of amperometric biosensors and therefore should be further investigated.Мета. Оптимізація нового методу іммобілізації ферментів для розробки амперометричних біосенсорів. Методи. Використано іммобілізовану глюкозооксидазу на цеоліті як біоселективний елемент біосенсора та платиновий дисковий електрод – як амперометричний перетворювач біохімічного сигналу в електричний. Результати. Біосенсор на основі глюкозооксидази, адсорбованої на цеолітах, вирізняється високою чутливістю до глюкози та покращеною інтер-відновлюваністю виготовлення біосенсорів. Найкращі аналітичні характеристики притаманні біосенсору на основі нано-бета цеоліту. Встановлено, що при зміні кількості цеолітів на поверхні амперметричного перетворювача можна варіювати параметри біосенсора, такі як чутливість до субстрату та час аналізу. Висновки. Показано, що запропонований метод іммобілізації, а саме – адсорбція ферментів на цеолітах є дуже перспективним при розробці амперометричних біосенсорів.Цель. Оптимизация нового метода иммобилизации ферментов для разработки амперометрических биосенсоров. Методы. Использовали иммобилизованную глюкозооксидазу на цеолитах как биоселективный элемент биосенсора и платиновый дисковый электрод – как амперометрический преобразователь биохимического сигнала в электрический. Результаты. Биосенсор на основе глюкозооксидазы, адсорбированной на цеолитах, отличается высокой чувствительностью к глюкозе и улучшенной интер-воспроизводимостью приготовления биосенсоров. Наилучшими аналитическими характеристиками обладает биосенсор на основе нано-бета цеолита. Установлено, что при изменении количества цеолитов на поверхности амперометрического преобразователя можно менять параметры биосенсора, такие как чувствительность к субстрату и время анализа. Выводы. Показано, что предложенный метод иммобилизации, а именно – адсорбция ферментов на цеолитах является перспективным при разработке амперометрических биосенсоров

Colorimetric biomimetic sensor systems based on molecularly imprinted polymer membranes for highly-selective detection of phenol in environmental samples

Aim. Development of an easy-to-use colorimetric sensor system for fast and accurate detection of phenol in envi- ronmental samples. Methods. Technique of molecular imprinting, method of in situ polymerization of molecularly imprinted polymer membranes. Results. The proposed sensor is based on free-standing molecularly imprinted polymer (MIP) membranes, synthesized by in situ polymerization, and having in their structure artificial binding sites capable of selective phenol recognition. The quantitative detection of phenol, selectively adsorbed by the MIP membranes, is based on its reaction with 4-aminoantipyrine, which gives a pink-colored product. The intensity of staining of the MIP membrane is proportional to phenol concentration in the analyzed sample. Phenol can be detected within the range 50 nM–10 mM with limit of detection 50 nM, which corresponds to the concentrations that have to be detected in natural and waste waters in accordance with environmental protection standards. Stability of the MIP-membrane-based sensors was assessed during 12 months storage at room temperature. Conclusions. The sensor system provides highly-selective and sensitive detection of phenol in both mo- del and real (drinking, natural, and waste) water samples. As compared to traditional methods of phenol detection, the proposed system is characterized by simplicity of operation and can be used in non-laboratory conditions.Мета. Розробка простих у використанні колориметричних сенсорних систем для швидкого і точного визначення фенолу у зразках із довкілля. Методи. Метод молекулярного імпринтингу, метод полімеризації in situ молекулярно імпринтованих полімерних (МІП) мембран. Результати. Запропонований сенсор створено на основі МІП мембран, синтезованих методом полімеризації in situ, які мають у своїй структурі штучні рецепторні сайти зв’язування фенолу. Кількісне визначення фенолу, селективно адсорбованого МІП мембранами, грунтується на детекції забарвленого у малиновий колір продукту його реакції з 4-аміноантипірином. Інтенсивність забарвлення МІП мембран є пропорційною концентрації фенолу в аналізованому зразку. Фенол детектується у діапазоні 50 нМ–10 мМ, що відповідає концентраціям, які необхідно виявляти у природних і стічних водах. Стабільність сенсорних систем на основі МІП мембран становить12 місяців за кімнатної температури. Висновки. Сенсорні системи забезпечують високоселективний і чутливий аналіз фенолу як у модельних, так і реальних зразках (питна, природна, стічна вода). Порівняно до традиційних методів визначення фенолу пропонована система є простою у використанні та може бути застосована за польових умов.Цель. Разработка простых в использовании колориметрических сенсорных систем для быстрого и точного определения фенола в образцах из окружающей среды. Методы. Метод молекулярного импринтинга, метод полимеризации in situ молекулярно импринтированных полимерных (МИП) мембран. Результаты. Предложенный сенсор создан на основе МИП мембран, синтезированных методом полимеризации in situ, имеющих в своей структуре синтетические рецепторные сайты связывания фенола. Количественное определение фенола, селективно адсорбированного МИП мембранами, основано на детекции окрашенного в малиновый цвет продукта его реакции с 4-аминоантипирином. Интенсивность окрашивания МИП мембран пропорциональна концентрации фенола в анализируемом образце. Фенол можно детектировать в пределах 50 нМ–10 мМ, что соответствует концентрациям, которые необходимо выявлять в природных и сточных водах. Стабильность сенсорных систем на основе МИП мембран составляет 12 месяцев при комнатной температуре. Выводы. Сенсорные системы обеспечивают высокоселективный и чувствительный анализ фенола как в модельных, так и реальных образцах (питьевая, природная и сточная вода). По сравнению с традиционными методами определения фенола предложенная система проста в использовании и может применяться в полевых условиях

Leucine-zipper motif is responsible for self-association of translation elongation factor 1Bβ

Translation elongation factor 1Bβ (eEF1Bβ) is a metazoan-specific protein catalyzing the guanine nucleotide exchange on translation elongation factor 1A (eEF1A). eEF1Bβ was reported to form oligomers. Aim. To define the structural region of human eEF1Bβ that mediates its self-association. In addition, the various truncated forms of this protein were tested in the guanine nucleotide exchange assay with two isoforms of mammalian eEF1A. Methods. The truncated forms of eEF1Bβ were generated by PCR, cloned, expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Their apparent molecular masses were determined by analytical gel filtration and their guanine nucleotide exchange activities were assessed by filter binding assay. Results. Complete deletion of the N-terminal domain of eEF1Bβ does not affect its oligomerization propensity while deletion of the leucine-zipper motif drastically decreases the apparent molecular mass of the truncated form compared to the full-length protein. Also, the leucine-zipper motif of eEF1Bβ fused to glutathione S-transferase causes oligomerization of the chimeric protein. It was demonstrated that all N-terminally truncated forms of eEF1Bβ displayed similar catalytic activity to that of the full-length protein. Weak inhibitory effect on the catalytic activity was observed only for the truncated form with partially deleted central acidic region. Conclusions. The leucine-zipper motif facilitates oligomerization of recombinant eEF1Bβ. Stepwise deletion of the eEF1Bβ N-terminal domain does not significantly affect the guanine nucleotide exchange activity of the truncated proteins.Фактор елонгації трансляції 1Bβ(eEF1Bβ) – це білок, наявний лише у багатоклітинних організмів. Він каталізує обмін гуанінових нуклеотидів на факторі елонгації трансляції 1A (eEF1A). Відомо, що eEF1Bβ утворює олігомери. Мета. Визначити структурний домен eEF1Bβ людини, який опосередковує його олігомеризацію. Для встановлення ймовірного впливу N-кінцевої ділянки eEF1Bβ на каталітичну активність цього білка, було перевірено здатність різних вкорочених форм eEF1Bβ каталізувати обмін гуанінових нуклеотидів на обох ізоформах eEF1A ссавців. Методи. Фрагменти кДНК, які кодують вкорочені форми, eEF1Bβ отримували шляхом ПЛР ампліфікації, потім клонували у відповідні вектори, які експресували в клітинах Escherichia coli. Рекомбінантні білки очищали і їхні молекулярні маси визначали аналітичною гель-фільтрацією. Активність вкорочених форм eEF1Bβ перевіряли в реакції обміну гуанінових нуклеотидів. Результати. Видалення N-кінцевого домену eEF1Bβ не вплинуло на його олігомерізацію, в той час як видалення мотиву типу «лейцинова застібка» значно зменшувало молекулярну масу вкороченої форми білка в порівнянні з повнорозмірною. Також, амінокислотний мотив eEF1Bβ типу «лейцинова застібка» злитий з глутатіон S-трансферазою спричиняв олігомерізацію цього химерного білка. Показано, що всі вкорочені з N-кінця форми eEF1Bβ проявляли каталітичну активність, подібну до повнорозмірного білка. Інгібіторний ефект на каталітичну активність спостерігався лише для вкороченої форми білка, в якої була відсутня частина центрального негативно зарядженого регіону. Висновки. Амінокислотний мотив типу «лейцинова застібка» сприяє олігомерізації рекомбінантного eEF1Bβ. Поступове вкорочення N-кінцевого домену не має значного впливу на каталітичну активність eEF1Bβ.Фактор элонгации трансляции 1Bβ (eEF1Bβ) – белок, присутствующий только в многоклеточных организмах. Он катализирует обмен гуаниновых нуклеотидов на факторе элонгации трансляции 1A (eEF1A). Известно, что eEF1Bβ образует олигомеры. Цель. Определить структурный домен eEF1Bβ человека, который вызывает его олигомеризацию. Для исследования возможного влияния N-концевого участка eEF1Bβ на каталитическую активность этого белка, мы проверили способность различных укороченных форм eEF1Bβ катализировать обмен гуаниновых нуклеотидов на обеих изоформах eEF1A млекопитающих. Методы. Фрагменты кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bβ, получали при помощи ПЦР амплификации, потом клонировали в соответствующие вектора, которые экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали и их молекулярные массы определяли аналитической гель-фильтрацией. Активность укороченных форм eEF1Bβ проверяли в реакции обмена гуаниновых нуклеотидов. Результаты. Полное удаление N-концевого домена не влияло на олигомеризацию eEF1Bβ, однако удаление мотива типа «лейцинова застёжка» значительно уменьшало молекулярную массу укороченной формы белка по сравнению с полноразмерной. Также, присоединение аминокислотного мотива eEF1Bβ типа «лейциновая застёжка» к глутатион S-трансферазе вызвало олигомеризацию этого химерного белка. Показано, что все укороченные с N-конца формы eEF1Bβ проявляли такую же каталитическую активность, как и полноразмерный белок. Слабый ингибирующий эффект на каталитическую активность наблюдался лишь для укороченной формы белка с отсутствующей частью центрального негативно заряженного региона. Выводы. Аминокислотный мотив типа «лейциновая застёжка» способствует олигомеризации рекомбинантного eEF1Bβ. Постепенное укорочение N-концевого домена не оказывает значительного влияния на каталитическую активность eEF1Bβ

Structural dissection of human translation elongation factor 1Bγ (eEF1Bγ): expression of full-length protein and its truncated forms

Aim. To gain more insights into properties of the human translation elongation factor eEF1Bγ and its interaction with partners we intended to produce the full-length protein and its truncated forms. Methods. cDNAs encoding truncated forms of eEF1Bγ were generated by PCR amplification with respective primers and cloned into vectors providing polyhistidine, glutathione S-transferase or maltose binding protein tags. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. An aggregation state of the proteins was analyzed by analytical gel filtration. Results. The expression, purification and storage conditions for the full-length recombinant His-eEF1Bγ were optimized. Several truncated forms of eEF1Bγ were also expressed and purified to homogeneity. Two short variants of C-terminal domain comprising amino acids 263–437 or 228–437 were obtained in monomeric state. Two short variants of N-terminal domain comprising amino acids 1–33 or 1–230, fused with glutathione S-transferase, were obtained and estimated to be dimers by gel filtration. The mutants of N-terminal domain comprising amino acids 1–93 or 1–165, fused with maltose binding protein, were obtained as soluble high molecular weight aggregates only. Conclusions. The purified recombinant His-eEF1Bγ and several truncated forms of the protein were obtained and characterized. These protein variants will be used for further studies on the protein-protein interaction.Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.Цель. Для более детального изучения свойств человеческого фактора элонгации трансляции eEF1Bγ и его взаимодействия с партнерами оптимизировать експрессию кДНК полноразмерного белка, а также его усеченных форм. Методы. кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bγ, генерировали методом ПЦР-амплификации с соответствующими праймерами и клонировали в векторы, содержащие в качестве аффинной метки полигистидиновую последовательность, глутатион S-трансферазу или белок, связывающий мальтозу. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериях и очищали аффинной хроматографией. Агрегатное состояние полученных белков анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Результаты. Оптимизированы экспрессия, очистка и условия хранения полноразмерного рекомби- нантного His-eEF1Bγ. Также експрессированы и очищены до гомогенного состояния несколько усеченных форм eEF1Bγ. Две укороченные формы С-концевого домена, содержащие аминокис- лотные остатки 263–437 и 228–437, получены в виде растворимых мономерных белков. Две укороченные формы N-концевого домена, содержащие аминокислотные остатки 1–33 и 1–230, слитые с глутатион S-трансферазой, получены в виде димеров по результатам гель-фильтрации. Другие делеционные мутанты, содержащие аминокислотные остатки 1–93 и 1–165 N-концевого домена и слиты с белком, связывающим мальтозу, могут быть получены только в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов. Выводы. Получены и охарактеризованы рекомбинантный фактор элонгации трансляции His-eEF1B и его четыре усеченные формы, которые в дальнейшем будут использованы для изу- чения белково-белковых взаимодействий

Structural dissection of human translation elongation factor 1Bγ (eEF1Bγ): expression of full-length protein and its truncated forms

Aim. To gain more insights into properties of the human translation elongation factor eEF1Bγ and its interaction with partners we intended to produce the full-length protein and its truncated forms. Methods. cDNAs encoding truncated forms of eEF1Bγ were generated by PCR amplification with respective primers and cloned into vectors providing polyhistidine, glutathione S-transferase or maltose binding protein tags. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by affinity chromatography. An aggregation state of the proteins was analyzed by analytical gel filtration. Results. The expression, purification and storage conditions for the full-length recombinant His-eEF1Bγ were optimized. Several truncated forms of eEF1Bγ were also expressed and purified to homogeneity. Two short variants of C-terminal domain comprising amino acids 263–437 or 228–437 were obtained in monomeric state. Two short variants of N-terminal domain comprising amino acids 1–33 or 1–230, fused with glutathione S-transferase, were obtained and estimated to be dimers by gel filtration. The mutants of N-terminal domain comprising amino acids 1–93 or 1–165, fused with maltose binding protein, were obtained as soluble high molecular weight aggregates only. Conclusions. The purified recombinant His-eEF1Bγ and several truncated forms of the protein were obtained and characterized. These protein variants will be used for further studies on the protein-protein interaction.Мета. Для детального вивчення властивостей фактора елонгації трансляції eEF1Bγ людини і його взаємодії з партнерами оптимізувати експресію кДНК повнорозмірного білка та його вкорочених форм. Методи. кДНК, які кодують вкорочені форми eEF1Bγ, синтезували методом ПЛР-ампліфікації з відповідними праймерами і клонували у вектори, що містять які афінну мітку полігістидинову послідовність, глутатіон S-трансферазу або білок, який зв’язує мальтозу. Рекомбінантні білки експресували в бактеріях і очищували афінною хроматографією. Агрегатний стан отриманих білків аналізували з використанням аналітичної гель-фільтрації. Результати. Оптимізовано експресію, очищення та умови зберігання повнорозмірного рекомбінантного His-eEF1Bγ. Також експресовано і очищено до гомогенного стану кілька вкорочених форм eEF1Bγ. Дві вкорочені форми С-кінцевого домену, які містять амінокислотні залишки 263–437 і 228–437, отримано у вигляді розчинних мономерних білків. Дві вкорочені форми N-кінцевого домену, що містять амінокислотні залишки 1–33 і 1–230, злиті з глутатіон S-трансферазою, одержано у вигляді димерів згідно з результатами гель-фільтрації. Інші делеційні мутанти, які містять амінокислотні залишки 1–93 і 1–165 N-кінцевого домену та злиті з білком, що зв’язує мальтозу, можуть бути отримані лише у вигляді розчинних високомолекулярних агрегатів. Висновки. Отримано і охарактеризовано рекомбінантний білок His-eEF1Bγ та його чотири вкорочені форми. Ці форми в подальшому буде використано для вивчення білково-білкових взаємодій.Цель. Для более детального изучения свойств человеческого фактора элонгации трансляции eEF1Bγ и его взаимодействия с партнерами оптимизировать експрессию кДНК полноразмерного белка, а также его усеченных форм. Методы. кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bγ, генерировали методом ПЦР-амплификации с соответствующими праймерами и клонировали в векторы, содержащие в качестве аффинной метки полигистидиновую последовательность, глутатион S-трансферазу или белок, связывающий мальтозу. Рекомбинантные белки экспрессировали в бактериях и очищали аффинной хроматографией. Агрегатное состояние полученных белков анализировали с помощью аналитической гель-фильтрации. Результаты. Оптимизированы экспрессия, очистка и условия хранения полноразмерного рекомби- нантного His-eEF1Bγ. Также експрессированы и очищены до гомогенного состояния несколько усеченных форм eEF1Bγ. Две укороченные формы С-концевого домена, содержащие аминокис- лотные остатки 263–437 и 228–437, получены в виде растворимых мономерных белков. Две укороченные формы N-концевого домена, содержащие аминокислотные остатки 1–33 и 1–230, слитые с глутатион S-трансферазой, получены в виде димеров по результатам гель-фильтрации. Другие делеционные мутанты, содержащие аминокислотные остатки 1–93 и 1–165 N-концевого домена и слиты с белком, связывающим мальтозу, могут быть получены только в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов. Выводы. Получены и охарактеризованы рекомбинантный фактор элонгации трансляции His-eEF1B и его четыре усеченные формы, которые в дальнейшем будут использованы для изу- чения белково-белковых взаимодействий

Elaboration of new method of enzyme adsorption on silicalite and nano beta zeolite for amperometric biosensor creation

Aim. Optimization of a new method of enzyme immobilization for amperometric biosensor creation. Methods. The amperometric biosensor with glucose oxidase immobilized on zeolites as bioselective elements and platinum disk electrode as transducers of biochemical signal into the electric one was used in the work. Results. The biosensors based on glucose oxidase adsorbed on zeolites were characterized by a higher sensitivity to glucose and a better inter-reproducibility. The best analytical characteristics were obtained for the biosensors based on nano beta zeolite. It has been found that an increase in the amount of zeolite on the surface of amperometric transducer may change such biosensor parameters as sensitivity to the substrate and duration of the analysis. Conclusions. The proposed method of enzyme immobilization by adsorption on zeolites is shown to be quite promising in the development of amperometric biosensors and therefore should be further investigated.Мета. Оптимізація нового методу іммобілізації ферментів для розробки амперометричних біосенсорів. Методи. Використано іммобілізовану глюкозооксидазу на цеоліті як біоселективний елемент біосенсора та платиновий дисковий електрод – як амперометричний перетворювач біохімічного сигналу в електричний. Результати. Біосенсор на основі глюкозооксидази, адсорбованої на цеолітах, вирізняється високою чутливістю до глюкози та покращеною інтер-відновлюваністю виготовлення біосенсорів. Найкращі аналітичні характеристики притаманні біосенсору на основі нано-бета цеоліту. Встановлено, що при зміні кількості цеолітів на поверхні амперметричного перетворювача можна варіювати параметри біосенсора, такі як чутливість до субстрату та час аналізу. Висновки. Показано, що запропонований метод іммобілізації, а саме – адсорбція ферментів на цеолітах є дуже перспективним при розробці амперометричних біосенсорів.Цель. Оптимизация нового метода иммобилизации ферментов для разработки амперометрических биосенсоров. Методы. Использовали иммобилизованную глюкозооксидазу на цеолитах как биоселективный элемент биосенсора и платиновый дисковый электрод – как амперометрический преобразователь биохимического сигнала в электрический. Результаты. Биосенсор на основе глюкозооксидазы, адсорбированной на цеолитах, отличается высокой чувствительностью к глюкозе и улучшенной интер-воспроизводимостью приготовления биосенсоров. Наилучшими аналитическими характеристиками обладает биосенсор на основе нано-бета цеолита. Установлено, что при изменении количества цеолитов на поверхности амперометрического преобразователя можно менять параметры биосенсора, такие как чувствительность к субстрату и время анализа. Выводы. Показано, что предложенный метод иммобилизации, а именно – адсорбция ферментов на цеолитах является перспективным при разработке амперометрических биосенсоров