Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Testing by Flow Cytometry: Brief Overview for Clinicians

Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) is a rare, acquired hematopoietic stem cell disorder, caused by a somatic mutation in the PIG-A gene. This mutation is responsible for the synthesis of glycophosphatidylinositol (GPI) anchor that attaches a number of proteins to the cell surface. The mutant gene leads to partial deficiency or absence of all proteins normally linked to the cell membrane by GPI anchor. The primary clinical manifestations of PNH are complement mediated hemolytic anemia, thrombosis in atypical locations and blood cytopenias. Flow cytometry has become the gold standard method for PNH clone detection due to its high sensitivity and specificity and due to the ability to examine multiple GPI-linked proteins on red and white blood cells surface. It is the method of choice for the detection of very small PNH clones in subclinical PNH that often accompanies aplastic anemia and other bone marrow disorders. PNH clone detection traditionally involves the analysis of CD55 and CD59 on red and white blood cells. Other markers such as CD14, CD16, CD24, CD66b and CD157 are suitable to detect GPI-linked proteins in the surface of granulocytes and monocytes. The most useful reagent to assess white blood cell PNH clones is Fluorescent Aerolysin (FLAER) which is a mutated form of proaerolysin conjugated with a fluorochrome. Its advantage in PNH clones detection is due to the ability to bind directly to the glycan portion of the GPI anchor. Flow cytometry is a sophisticated method and a useful tool for clinical cell analysis. However, PNH is a clinical diagnosis and flow cytometric results should always be interpreted with respect to clinical manifestations and other laboratory findings

A Case of an Unusual Relapse of Multiple Myeloma

Extramedullary relapse constitutes an uncommon manifestation of multiple myeloma, but central nervous system involvement as the only manifestation of relapse appears even less common. A 50-year-old man with a history of multiple myeloma achieved complete remission after autologous hematopoietic stem cell transplantation. Fifteen months later, he presented with central nervous relapse with no signs of systemic disease

Could Immunophenotype Guide Molecular Analysis in Patients with Myeloid Malignancies?

Objective: Immunophenotype has been correlated with molecular aberrations in several studies. The aim of this study was the discovery of immunophenotypic features related to mutations in AML and MDS patients connected to prognostic factors. Moreover, an effort to evaluate a method for the detection of the most common NPM1 mutations of exon12 and Internal Tandem Duplications (ITD) mutations of FLT3 gene by flow cytometry was performed. Method: Patients with de novo myeloid neoplasms [ AML and MDS (AML-M3 patients were excluded)] were included. FLT3/ITD/TKD and NPM1 mutations were detected by PCR and fragment analysis. The immunophenotypic analysis was performed by multi-dimensional flow cytometry (FC) with a standardized panel of monoclonal antibodies on peripheral blood or bone marrow samples. Nucleophosmin Antibody and CD135 were used for the mutations immunophenotypic detection. Results: NPM1 and/or FLT3 mutations correlated with low or no expression of more immature cells markers such as CD34, CD117, HLADR, as well as higher expression of more mature markers such as CD11b. The higher expression of CD33 should be mentioned as well. The presence of NPM1mut and FLT3/ITD does not seem to be detectable by FC at least using these two monoclonal antibodies. The presence of CD7 aberrant lymphoid marker’s expression was associated with FLT3mut, NPM1wt genotype. CD56 or CD2 positivity was found only in patients’ samples negative for NPM1 and/or FLT3 mutations. Conclusions: Certain immunophenotype findings including the presence of aberrant lymphoid markers may be indicative of the presence of mutations in NPM1 and FLT3 linked to prognosis

Minimal residual disease evaluation of adult precursor B cell acute lymphoblastic leukemia cases by four color flow cytometry

Introduction: The knowledge of the immunophenotypic profile of normal precursor B lymphocytes in bone marrow, known as hematogones, is essential for the recognition of blasts in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia (p-B ALL) cases. The immunophenotypic aberrancies of blasts might be related to molecular variations or have prognostic significance or be used for the recognition of the Minimal Residual Disease (MRD). The MRD detection is clinically significant because it helps in identifying patients at risk of relapse.Aim: The aim of the study was to investigate the immunophenotype of blasts in bone marrow or peripheral blood samples of adult p-B ALL patients on diagnosis and evaluate its prognostic significance, its stability after chemotherapy or during relapse and its relation to BCR-ABL hybrid gene presence. Moreover, we examined the ability to detect the fusion BCR-ABL protein with flow cytometry and the prognostic significance of MRD.Material and Methods: Four colour flow cytometry was performed on 199 bone marrow or peripheral blood samples of 30 patients with p-B ALL and on 30 bone marrow samples of 30 patients with other types of acute leukemia apart from p-B ALL (control group).Results: The study of the control group defined the immunophenotypic profile of normal precursor B lymphocytes according to maturation stage. Common immunophenotypic characteristic of all stages was the presence of CD10, CD19, CD22 and CD38 antigens. Leukemia Associated ImmunoPhenotype (LAIP) was detected in 86.6% of the p-B ALL cases. The low expression of CD45 antigen was associated with less frequent detection of MRD>5% (p<0.05). On the contrary CD20 expression in the subgroup of newly diagnosed patients emerged as a poor prognosticator (p<0.05). Similar prognostic value was found with regard to the immunophenotype TDT (+)/CD20(+) (p=0.03). The immunophenotypes CD45 weakly positive/CD10(-) and CD10(-)/CD34(+) on newly diagnosed patients were found to be useful in MRD detection as well as in the prediction of disease relapse (p=0.001 and p=0.01, respectively). In addition, the immunophenotype CD10(-)/CD34(+) was found to have indicative, but not statistically significant, relation to mortality. The immunophenotype CD10(+)bright/CD34(+)/CD38(+) was found more often in Ph positive patients compared to patients with normal karyotype (p=0.04). Furthermore, the present study confirmed the ability of BCR-ABL fusion protein detection by flow cytometry. MRD detection before the allogenic bone marrow transplantation tended to characterize patients who relapsed after the transplantation as well as patients who died due to relapse.Conclusion: According to the aforementioned findings, the present study, a) identified immunophenotypes with prognostic value as far as the mortality and relapse is concerned, b) identified a certain immunophenotype in Ph (+) adult p-B-ALL patients and c) confirmed the ability of BCR-ABL fusion protein detection by flow cytometry.Η γνώση του ανοσοφαινοτυπικού προφίλ των φυσιολογικών πρόδρομων Β λεμφοκυττάρων στο μυελό, των λεγόμενων αιματογονίων, είναι βασική προϋπόθεση για την αναγνώριση και το διαχωρισμό των βλαστικών κυττάρων στις περιπτώσεις Β οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (Β ΟΛΛ). Οι ανοσοφαινοτυπικές αποκλίσεις που παρουσιάζουν τα βλαστικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά αντίστοιχά τους μπορεί να σχετίζονται με συγκεκριμένες μοριακές διαταραχές ή να έχουν προγνωστική αξία για την έκβαση του νοσήματος. Επιπλέον, μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης του ασθενούς για την αναγνώριση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (Minimal Residual Disease, MRD), των βλαστικών δηλαδή κυττάρων που παραμένουν στο μυελό μετά τη θεραπεία. Ο προσδιορισμός της MRD έχει κλινική σημασία γιατί αξιολογεί το αποτέλεσμα της θεραπείας και διακρίνει τους ασθενείς με κίνδυνο υποτροπής της νόσου. Σκοπός της διατριβής ήταν η ανοσοφαινοτυπική μελέτη των βλαστικών κυττάρων στο μυελό ή το περιφερικό αίμα ενήλικων ασθενών με Β ΟΛΛ κατά τη διάγνωση, η ανίχνευση της MRD κατά τη διάρκεια της θεραπείας σε δείγματα μυελού και η αξιολόγηση της κλινικής της σημασίας. Μελετήθηκαν οι επιμέρους ανοσοφαινοτυπικοί δείκτες κάθε περίπτωσης Β ΟΛΛ και εξετάστηκε η πιθανή προγνωστική τους αξία ως προς την έκβαση του νοσήματος, η σταθερότητά τους μετά τη χορήγηση χημειοθεραπείας ή κατά την υποτροπή, η σχέση τους με την παρουσία του BCR-ABL γονιδίου, η δυνατότητα ανίχνευσης της υβριδικής BCR-ABL πρωτεΐνης με την κυτταρομετρία ροής καθώς και η προγνωστική σημασία της MRD ως προς την έκβαση του νοσήματος. Υλικό - Μέθοδος Η ομάδα των ασθενών περιελάμβανε 199 δείγματα μυελού ή περιφερικού αίματος, προερχόμενα από 30 ενήλικες ασθενείς με Β ΟΛΛ. Την ομάδα των μαρτύρων αποτελούσαν 30 δείγματα μυελού των οστών προερχόμενα από ενήλικες ασθενείς με ιστορικό λευχαιμίας διαφορετικού κυτταρικού τύπου από την Β ΟΛΛ. Η μελέτη έγινε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τετραπλούς συνδυασμούς μονοκλωνικών αντισωμάτων συνδεδεμένων με διαφορετικές φθορίζουσες ουσίες και στην περίπτωση ανίχνευσης της υβριδικής BCR-ABL πρωτεΐνης, με ένα νέο kit, που βασίζεται στη σφαιριδομετρία.Αποτελέσματα. Η μελέτη της ομάδας των μαρτύρων καθόρισε το ανοσοφαινοτυπικό προφίλ των φυσιολογικών πρόδρομων Β λεμφοκυττάρων κατά στάδιο ωρίμασης (αιματογόνια σταδίου Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και ώριμα Β λεμφοκύτταρα). Κοινό ανοσοφαινοτυπικό χαρακτηριστικό και των τριών πρόδρομων σταδίων είναι οι παρουσία των αντιγόνων CD10, CD19, CD22 και CD38. Ασύγχρονη συνέκφραση πρώιμων και όψιμων δεικτών ή αποκλίσεις του τύπου υπερ- ή υποέκφραση αντιγόνου, δεν παρατηρήθηκε στα φυσιολογικά πρόδρομα Β λεμφοκύτταρα.Στον πληθυσμό των ασθενών με Β ΟΛΛ που μελετήθηκε, παρατηρήθηκαν ανοσοφαινοτυπικές αποκλίσεις (Leukemia Associated ImmunoPhenotypes, LAIP), κατάλληλες για την αναγνώριση της MRD σε ποσοστό 86.6%. Η χαμηλή ένταση έκφρασης του δείκτη CD45 σχετίζεται με λιγότερες πιθανότητες εμφάνισης υψηλών ποσοστών MRD (p < 0.05). Αντιθέτως, η παρουσία του δείκτη CD20 στους πρωτοδιαγνωσμένους ασθενείς είναι ανεξάρτητος δυσμενής προγνωστικός παράγοντας, καθώς η παρουσία του αυξάνει την πιθανότητα θανάτου (p < 0.05). Ανάλογη προγνωστική σημασία έχει και η συνέκφραση των δεικτών TDT θετικό/CD20 θετικό (p=0.03). Ο ανοσοφαινότυποι CD45 ασθενώς θετικό/CD10 αρνητικό και CD10 αρνητικό/CD34 θετικό στους λεμφοβλάστες των ασθενών κατά την αρχική διάγνωση του νοσήματος χρησιμεύουν αφενός μεν στην ανίχνευση της MRD, αφετέρου στην πρόβλεψη της υποτροπής (p=0.001 και p=0.01, αντιστοίχως). Επιπλέον, ο ανοσοφαινότυπος CD10 αρνητικό/CD34 θετικό φαίνεται να έχει ενδεικτική, αλλά όχι στατικά σημαντική σχέση με τη θνητότητα. Βρέθηκε επίσης σχέση της ανοσοφαινοτυπικής ταυτότητας των βλαστών με το χρωμόσωμα Ph, καθώς ο ανοσοφαινότυπος CD10(+)έντονο/CD34(+)/CD38(+) των βλαστικών κυττάρων ήταν συχνότερος στους ασθενείς με τη συγκεκριμένη καρυοτυπική ανωμαλία σε σύγκριση με τους ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο (p=0.04). Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η δυνατότητα ανίχνευσης της υβριδικής BCR-ABL πρωτεΐνης με την κυτταρομετρία ροής. Η ανίχνευση της MRD πριν τη μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων χαρακτήριζε τους ασθενείς που υποτροπίασαν μετά τη μεταμόσχευση, καθώς και εκείνους που κατέληξαν λόγω της υποτροπής. Συμπέρασμα. Τα ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά συνδέονται κατά περίπτωση με την πρόγνωση του νοσήματος και μπορεί να είναι ενδεικτικά συγκεκριμένων μοριακών ή καρυοτυπικών διαταραχών, όπως του χρωμοσώματος Ph. Η μέθοδος ανίχνευσης της BCR-ABL υβριδικής πρωτεΐνης στις περιπτώσεις Β ΟΛΛ με την κυτταρομετρία ροής αποδείχθηκε σχετικά εύκολη και αξιόπιστη. Η κυτταρομετρία ροής είναι κατάλληλη τεχνική για την ανίχνευση της MRD, ο υπολογισμός της οποίας έχει αφ’ ενός σημασία στην αξιολόγιση του θεραπευτικού αποτελέσματος και αφ’ ετέρου προγνωστική αξία ως προς την έκβαση του νοσήματος

Development of a model for the estimation of oil spill waste generation

Μετά την εκδήλωση μιας πετρελαιοκηλίδας, η ανάκτηση του πετρελαίου που διέφυγε, είτε από την επιφάνεια της θάλασσας, είτε από τις ακτές, συνήθως προκαλεί την ανάμιξη του πετρελαίου με μεγάλες ποσότητες και άλλων υλικών. Το γεγονός αυτό, προκαλεί μεγάλη αύξηση του όγκου των αποβλήτων που θα πρέπει να υποστούν επεξεργασία (σε ακραίες περιπτώσεις μπορεί τα απόβλητα που θα παραχθούν μπορεί να είναι ακόμα και 30 φορές μεγαλύτερα σε όγκο σε σχέση με το πετρέλαιο που αρχικά διέφυγε) κάνοντας τη διαδικασία επιλογής της αντιμετώπισης αυτών των αποβλήτων σύνθετη και κρίσιμη. Η παραγωγή αποβλήτων διαφέρει πολύ από το ένα περιστατικό ρύπανσης στο άλλο και δεν απαραίτητα ανάλογη του μεγέθους της πετρελαιοκηλίδας. Η ποσότητα και τα χαρακτηριστικά των αποβλήτων που συλλέγονται εξαρτώνται από τις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν και την οργάνωση της ανάκτησης του πετρελαίου. Κατά συνέπεια, η πρόβλεψη του όγκου των αποβλήτων που προκύπτουν μετά τη διενέργεια των επιχειρήσεων αντιμετώπισης της πετρελαιοκηλίδας, είναι ένα δύσκολο έργο αφού εξαρτάται από πολλές παραμέτρους. Στο πλαίσιο αυτή της εργασίας, το πρώτο βήμα ήταν ο καθορισμός των ειδών αποβλήτων που μπορεί να προκύψουν από τις προαναφερθείσες εργασίες. Επιπλέον, θεωρήθηκε αναγκαία η καταγραφή των διαδικασιών διαχείρισης αυτών των ειδών αποβλήτων και η περιγραφή του νομικού πλαισίου που τις διέπει. Το επόμενο βήμα αποτέλεσε η συλλογή πληροφοριών σχετικά με τις παραμέτρους που επηρεάζουν την παραγωγή αυτών των αποβλήτων. Προκειμένου να συλλεχθούν αυτές οι πληροφορίες, συγκεντρώθηκαν τριάντα ιστορικά ατυχημάτων πλοίων. Η μελέτη αυτών των ιστορικών ανέδειξε το γεγονός ότι ο όγκος των υγρών αποβλήτων που παράγονται εξαρτάται από: (1) την ποσότητα του πετρελαίου που διέφυγε (tons), (2) το είδος του πετρελαίου που διέφυγε, (3) τις καιρικές συνθήκες, (4) την απόσταση του σημείου εκδήλωσης της πετρελαιοκηλίδας από την ακτή και (5) τη χώρα και τη χρονολογία κατά την οποία εκδηλώθηκε η πετρελαιοκηλίδα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι ο όγκος των στερεών αποβλήτων που παράγονται εξαρτάται από: (1) την ποσότητα πετρελαίου που διέφυγε (tons), (2) την ποσότητα υγρών αποβλήτων που συλλέχθηκαν (tons), (3) το είδος του πετρελαίου που διέφυγε, (4) την απόσταση του σημείου εκδήλωσης της πετρελαιοκηλίδας από την ακτή (km), (5) το μήκος της ακτογραμμής που προσβλήθηκε από το πετρέλαιο (km), (6) το είδος της ακτής, (7) τις καιρικές συνθήκες και (8) την ικανότητα αντιμετώπισης της πετρελαιοκηλίδας με βάση την τοποθεσία και τη χρονολογία κατά την οποία εκδηλώθηκε το ατύχημα. Στη συνέχεια, οι προαναφερθείσες παράμετροι έγιναν το αντικείμενο της ανάλυσης της παραγωγής αποβλήτων που προκύπτουν από τις επιχειρήσεις καταπολέμησης της πετρελαιοκηλίδας. Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν υπέστησαν επεξεργασία με τις μεθόδους της γραμμικής στατιστικής παλινδρόμησης (απλής και πολλαπλής) και της γραμμικής ασαφούς παλινδρόμησης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης που διεξήχθη, η παραγωγή υγρών αποβλήτων εξαρτάται κυρίων από την ποσότητα πετρελαίου που διέφυγε στη θάλασσα (τόνοι) και η παραγωγή στερεών αποβλήτων εξαρτάται κυρίως από την ποσότητα των υγρών αποβλήτων που συλλέχθηκαν (τόνοι) και το μήκος της ακτογραμμής που προσβλήθηκε από το πετρέλαιο (χιλιόμετρα). Επιπλέον, η παρούσα εργασία παρέχει μαθηματικές σχέσεις, οι οποίες βασίζονται στις μεθόδους της στατιστικής και της ασαφούς παλινδρόμησης και μπορούν να συμβάλουν στην πρόβλεψη της παραγωγής αποβλήτων.In the aftermath of a spill, the recovery of spilled oil either from the sea surface, or from the shoreline usually results in the collected oil becoming mixed with a large quantity of water, debris and beach material. This greatly increases the volume of oily waste for treatment and disposal (in extreme cases the produced waste may be 30 times more than the oil originally spilt) rendering the process of deciding how to deal with the waste oil and contaminated material, critical and complex. Waste generation varies greatly from one pollution incident to another and is not necessarily directly proportional to the size of the spill. The quantity and the characteristics of collected waste depend on the techniques used and the organization of recovery. Therefore, the prediction of volume of waste that occur after the conduct of oil spill combat operations, is a difficult task since it involves various parameters. In the context of this project, the first step was to define the types of waste that occur from the afore-mentioned operations. It was also considered appropriate to list the management procedures and the legal framework considering these types of waste. The next step was to collect information considering the parameters that affect waste generation. With a view to collecting this information, the accident histories of thirty ships were collected. The study of these accident histories revealed that the volume of generated liquid waste depends on: (1) the quantity of oil spilled (tons), (2) the type of oil spilled, (3) the weather conditions, (4) the distance of the spot where the oil spill occurred from the shore (km), (5) the chronology and the country where the oil spill occurred. It was also revealed that the volume of generated solid waste depends on: (1) the quantity of oil spilled (tons), (2) the quantity of collected liquid waste, (3) the distance of the spot where the oil spill occurred from the shore (km), (4) the length of the coastline that was affected by the oil spilled (km), (5) the type of shore, (6) the weather conditions, (7) the chronology and the country where the oil spill occurred. Then, the afore-mentioned parameters became the subject of the analysis of waste generation following the conduct of oil spill combat operations. The collected data were analyzed by means of the methods of linear statistical (simple and multiple) and linear fuzzy regression. According to the results of the analysis, the generation of liquid waste depends mainly on the quantity of oil spilled (tons) and the generation of solid waste depends mainly on the quantity of collected liquid waste (tons) and the length of the affected coastline (km). Furthermore, this project provides relationships that are based on the methods of statistical and fuzzy regression, which can assist to the prediction of waste generation.Ειρήνη Δ. Γρηγορίο

Obsessive compulsive symptoms are associated with better functioning independently of cognition in schizophrenia

Objectives: Although the relationship of obsessive compulsive symptoms (OCSs) with both cognition and social functioning (SF) has already been the focus of research in schizophrenia, the moderation of the relationship of OCSs with SF by cognition has not been explored to date. We investigated the association of OCSs with SF and its interaction with cognition in schizophrenia. Methods: We recruited 110 schizophrenia patients and assessed OCSs (Yale-Brown Scale), schizophrenia symptoms (Positive and Negative Syndrome Scale), SF (Strauss-Carpenter Scale) and cognition. 51 patients had one obsessive compulsive symptom or more, whereas 59 patients had no obsessive compulsive-symptom, according to the Yale-Brown Scale. We mainly investigated: a) the predictive effect of OCSs on SF, controlling for cognition, illness duration and symptoms&apos; severity and b) the moderating effect of cognition on the OCSs-SF relationship. Results: The mean score of OCSs for patients having at least one symptom was 13.43 (SD = 8.32). Higher OCSs predicted increased SF (B = 0.98, t = 2.41, df = 88, p = 0.018). This relationship was driven by the association of compulsions with job functioning (B = 0.074, t = 2.029, df = 88, p = 0.046). Patients without OCSs demonstrated worse functioning compared with those having at least one obsessive compulsive symptom (mean difference = 2.496, t = 3.732, df = 88, p &lt; 0.001). We failed to find evidence that cognition moderates the effect of OCSs on SF. Conclusion: There may be a beneficial effect of OCSs on SF in patients with schizophrenia which is independent of their cognitive performance. (C) 2016 Elsevier Inc. All rights reserved

Kinetics of Immune Subsets in COVID-19 Patients Treated with Corticosteroids

Rationale: Changes in anti-SARS-CoV-2 defense immune subsets in patients treated with dexamethasone (DXM) for severe COVID-19 and their relation to disease outcomes are poorly understood. Methods: Blood-lymphocyte subsets of 110 hospitalized COVID-19 patients were prospectively examined. A first sample was taken at enrollment and a second one 7–10 days later. Total B-, T-lymphocytes, CD4+, CD8+, T-regulatory (Treg), Natural-Killer (NK) and NK T-cells were counted using flow cytometry. Results: At enrollment, patients with respiratory failure, characterized by DXM failure (intubation/death) or DXM success (hospital discharge) exhibited significantly fewer CD3+, CD4+ and CD8+ cells and B-lymphocytes compared to the control group (no respiratory failure/no DXM). At the time of treatment completion, the DXM-failure group exhibited significantly fewer CD3+, CD4+ and CD8+ cells, memory CD4+ and CD8+ T-lymphocytes, compared to the control and the DXM-success groups and fewer activated CD4+ T-lymphocytes, Tregs and NK cells compared to the control group. At the time of treatment completion, the number of all investigated lymphocyte subsets increased in the DXM-success group and was similar to those of the control group. NK cells significantly decreased over time in the DXM-failure group. Conclusion: The lymphocyte kinetics differ between DXM-treated and control COVID-19 patients and are associated with clinical outcomes