"Untersuchungen zur biologischen Funktion des trankriptionellen Repressors E2F6"

E2F Transkriptionsfaktoren sind zentrale Regulatoren der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung. E2F Proteine binden über eine konservierte DNA Bindedomäne an DNA Motiv der Sequenz (T(c/g)CCGC(c/g). Dieses Konsensusmotiv konnte in den Promotoren zahlreicher Gene nachgewiesen werden. Der E2F Familie werden derzeit sieben Proteine zugeordnet (E2F1-E2F7). E2F1-E2F5 sind transkriptionelle Aktivatoren. Ihre transaktivierende Wirkung wird durch die zellzyklusabhängige Bindung an Pocket Proteine (pRb, p107, p130) negativ reguliert. E2F1-E2F5 zeigen eine sowohl spezifische als auch überlappende Funktionen in der Zellzyklusregulation und in der Embryonalentwicklung. Dagegen bilden E2F6 und E2F7 transkriptionelle Repressoren, die nicht an Pocket Proteine binden. Ihre physiologische Funktionen sind unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die in-vivo Funktion von E2F6 analysiert werden. Hierzu wurden E2F6 defiziente Mäuse charakterisiert, die in Vorarbeiten durch Dr. Stefan Gaubatz hergestellt und zur Verfügung gestellt wurden. E2F6 defiziente Mäuse sind lebensfähig, gesund und fruchtbar. E2f6-/- Fibroblasten proliferieren normal und zeigen eine zu den Kontrollzellen identische Zellzyklusverteilung. E2F6 defiziente Fibroblasten arretieren reversibel in der G0 Phase des Zellzyklus. Außerdem induzieren sie eine normale replikative und onkogene Seneszenz. Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen werden, dass E2F6 nicht für die Zellzyklusregulation benötigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei gewebespezifische Phänotypen E2F6 defizienter Mäuse beobachtet werden: Zum einen wurde ein Defekt in der Spermatogenese E2F6 defizienter Männchen festgestellt, dessen molekulare Ursache jedoch unklar ist. Dieser Defekt beeinträchtigt nicht die Fruchtbarkeit von E2f6-/- Mäusen. Zum anderen konnten posteriore homeotische Transformationen entlang der antero-posterioren Achse von Skeletten E2F6 defizienter Mäuse identifiziert werden. Diese ähneln auffällig den Skelettphänotypen Polycomb Protein defizienter Mäuse. Da vorangegangene Studien eine Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen zeigten, konnte durch den in dieser Arbeit beobachteten E2f6-/- Phänotyp erstmals in-vivo Evidenz für einen funktionelle Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen erhalten werden. Polycomb Proteine inhibieren die Expression von Hox Genen. Es kann daher spekuliert werden, dass E2F6 Polycomb Proteine an die Promotoren von Hox Gene rekrutiert. Im Gegensatz zu den Polycomb defizienten Mäusen konnte allerdings in ersten Untersuchungen keine deregulierte Expression spezifischer Hox Gene in 9.5 Tage alten E2f6-/- Embryonen nachgewiesen werden. Unter Verwendung eines cDNA Microarrays konnten die meiotischen Kohäsine Smc1l2 (Structural Maintenance of Chromosomes 1l2) und Stag3 (Stromal Antigen 3), sowie das noch nicht charakterisierte Gen XM_196054 als E2F6 regulierte Gene identifiziert und mit verschiedenen experimentellen Ansätzen bestätigt werden. Durch den Nachweis von E2F6 auf dem endogenen Promotor von Stag3 kann eine direkte Regulation von Stag3 durch E2F6 angenommen werden. Weiterhin konnte eine E2F Konsensussequenz im Stag3 und Smc1l2 Promotor identifiziert werden, die eine Bindung von E2F6 ermöglicht und für eine Repression benötigt wird. Anhand dieser Gene wurde in dieser Arbeit der E2F6 vermittelte Repressionsmechanismus untersucht: Dabei konnte beobachtet werden, dass Histon H3 des Smc1l2 und Stag3 Promotors in E2f6+/+, nicht jedoch in E2f6-/- Fibroblasten an H3 Lysin 9 (K9) dimethyliert und am Lysin 27 (K27) trimethyliert ist. Diese Methylierungen korrelieren mit der Repression der Stag3 und Smc1l2 Expression in E2f6+/+ Fibroblasten. Zusätzlich konnte in E2F6-/- Fibroblasten eine stärkere Acetylierung von Histon H3 am Stag3 Promotor im Vergleich zu E2f6+/+ Fibroblasten gezeigt werden. Diese Histonacetylierung korreliert mit einer Expression von Stag3 in E2F6 defizienten Zellen. In Einklang damit steht die Beobachtung, dass die stabile Repression von Smc1l2 und Stag3 die Aktivität von Histondeacetylasen benötigt. Außerdem wurde Evidenz für eine Funktion von DNA Methylierungen in der stabilen Smc1l2 und Stag3 Inhibition gewonnen. Somit kann folgendes Modell vorgeschlagen werden: Durch die Bindung von E2F6 werden Histondeacetylasen und/oder Histonmethyltransferasen an die Promotoren meiotischer Kohäsine rekrutiert. Der Nachweis des Polycomb Proteins RYBP auf dem Stag3 Promotor von E2f6+/+ Fibroblasten zeigt, dass eine dauerhafte, stabile und vererbbare Inhibition der Kohäsinexpression möglicherweise durch Polycomb Proteine vermittelt werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Funktion von E2F6 in der Inhibition zell- und differenzierungsspezifischer Gene identifiziert werden. Gleichzeitig wurde Evidenz für einen aktiven E2F6 Repressionsmechanismus erhalten, der durch Histonmodifikationen die Bindung von Polycomb Proteinen an E2F6 regulierte Promotoren ermöglicht

Das tumortherapeutische Potential optimierter Agonisten der Rezeptoren des Apoptose-induzierenden Liganden TRAIL

Trotz der Entwicklung neuer Wirkstoffen und verbesserter Therapien ist die Bekämpfung von Tumoren weiterhin eine große Herausforderung. Apo-2L oder „tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis ligand“ (TRAIL), TRAIL, ist ein Mitglied der TNF-Familie und ein vielversprechendes Protein für die Krebstherapie, weil es selektiv in transformierten, nicht aber in gesunden Zellen Apoptose induziert. Zudem scheint das TRAIL-System die Resistenz von vielen Tumoren gegenüber derzeitigen Behandlungs-Strategien, die im wesentlichen aus Chemotherapie und Bestrahlung bestehen, überwinden zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zuerst rekombinante multimerisierte Einzelkettenantikörperfragmente mit den Spezifitäten anti-TRAIL-R2 und anti-CD95 (APO-1/Fas) hergestellt und charakterisiert. Aus Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper gegen TRAIL-R2 und CD95 produzieren, wurden nach RNA-Isolierung und cDNA-Synthese die für die variablen schweren und leichten Antikörperketten (VH und VL) kodierenden Gene mittels PCR amplifiziert. Die Herstellung der Expressionsvektoren erfolgte durch C-terminale Fusion der VH- und VL-Expressionskassetten an die Multimerisierungsdomäne eines modifizierten Leuzin-Zippers. Nach Transformation von E.coli mit den Expressionsvektoren und Expression der rekombinanten Proteine wurde die Spezifität und Aktivität der scFv-anti-TRAIL-R2- und scFv-anti-APO-1-Fragmente nach erfolgreicher in vitro Rückfaltung untersucht. Funktionelle Bindung von scFv-anti-TRAIL-R2-Antikörperfragmenten konnte auf TRAIL-R2-exprimierenden Tumorzellen durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Die lytische Aktivität des Antikörperderivates auf verschiedenen Tumorzellen war nur minimal. Im Falle des scFv-anti-APO-1-Antikörperfragmentes konnte sowohl Bindung, als auch zytotoxische Aktivität auf CD95-exprimierenden Tumorzellen gezeigt werden. Das agonistische Potential war jedoch nicht höher als beim Ausgangsantikörper anti-APO-1. Zudem wurde in dieser Arbeit eine hochaktive rekombinante Form von TRAIL, IZ-TRAIL, entwickelt. Rekombinant in E.coli exprimiertes IZ-TRAIL konnte in großen Mengen durch sequentielle Affintitätschromatographie gereinigt werden. Hohe anti-tumorale Wirksamkeit von IZ-TRAIL als Einzeltherpeutikum sowie in Kombination mit Chemotherapeutika wurde auf zahlreichen Tumorzellen in vitro gezeigt. Trotz der hohen Wirksamkeit auf Tumorzellen, konnte keine Zytotoxizität in der Maus und auf frisch isolierten primären humanen Hepatozyten, auch in Kombination mit diversen Chemotherapeutika nachgewiesen werden. Mit IZ-TRAIL wurde eine TRAIL-Version entwickelt, die im Vergleich zu nicht getaggten TRAIL-Versionen eine hohe anti-tumorale Wirkung hat, und gleichzeitig für primäre Zellen nicht toxisch ist

Depletion des Myc-interagierenden Zinkfingerproteins 1 mittels RNA Interferenz und Die Rolle von Miz-1 in der zellulären DNA Schadensantwort auf UV-Licht

Die vorliegende Dissertationsarbeit beschäftigte sich zum einen methodisch mit dem Gen-Knock-out des mit Myc interagierenden Proteins Miz-1 mittels der kürzlich erschlossenen Technik der RNA Interferenz in Säugerzellen. Zum anderen wurde unter Nutzung der RNA Interferenz ein Zusammenhang aus dem Bereich zellulärer Schadenskontrollmechanismen, speziell der Regulation der UV-induzierten DNA-Schadensantwort durch das Myc interagierende Protein Miz-1 geklärt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Nutzung eines evolutionär konservierten Abwehrmechanismus der Zelle gegen Fremdgene, der RNA Interferenz. Der Knock-out mittels RNA Interferenz ersetzt zunehmend die konventionellen Gen-Knock-out-Technologien. Durch RNA Interferenz Versuche mit Kotransfektion eines Glühwürmchen-Luziferase-kodierenden Plasmids und eines sequenz-homologen RNA-Doppelstrangs konnte ein deutlicher Rückgang der Plasmid-induzierten Lumineszenz gegenüber den allein mit Reporter-Plasmid transfizierten oder mit Nonsense-RNA kotransfizierten Zellen erreicht werden. Mittels dieses spezifischen Knock-out eines Gens wurde die Eignung der Säugerzelllinien HaCaT, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie, HeLa, ebenfalls humaner Zervix-Karzinom-Zellen und MEF, primärer muriner Embryo-Fibroblasten zur RNA Interferenz dargelegt. Anschließend wurde die Depletion des Transkriptionsfaktors Miz-1 durchgeführt. Ähnlich wie in zahlreichen bisherigen RNA Interferenz-Versuchen in Säugerzellen konnte nur ein partieller Knock-out des Gens erreicht werden. Aber auch eine partielle Depletion eines Gens hat Auswirkungen auf den resultierenden Phänotyp. Die Möglichkeit eines partiellen Miz-1 Knock-out, auch als Knock-down bezeichnet, eröffnet umfangreiche Möglichkeiten der Funktionsanalyse des Gens und seiner Interaktionspartner sowie der Analyse Miz-1-abhängiger Signaltransduktionswege. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der zellulären Antwort auf UV-induzierte DNA-Schäden. Dabei wurde ein vom Tumorsuppressor p53 abhängiger sowie ein p53-unabhängiger Schadens-Kontrollpunkt untersucht und die jeweilige Bedeutung des Transkriptionsfaktors Miz-1 geprüft. Zur Analyse der p53-abhängigen zellulären Antwort auf UV-induzierte DNA-Schäden wurden ARF / Maus-Embryo-Fibroblasten verwandt, da Myc in UV bestrahlten Wildtyp-MEF-Zellen eigenständig über ARF Apoptose induziert. Durch p53 werden eine Reihe von Genen, unter anderem der CdK-Inhibitor p21cip1, aktiviert, die Zellzyklusarrest oder Apoptose einleiten. Wie die vorliegenden Untersuchungen zeigen, ist für die p21cip1-Expression in der UV-Antwort neben dem Tumorsuppressor p53 die Anwesenheit des Transkriptionsfaktors Miz-1 notwendig. Nach Depletion des Myc interagierenden Proteins mittels RNA Interferenz liegt eine gehemmte Expression des CdK-Inhibitors p21cip1 vor. Mit der Depletion von Miz-1 durch RNA Interferenz vergleichbar ist der funktionelle Ausfall der Aktivität von Miz-1 in Zellen mit deregulierter Expression von Myc. In MEF-Zellen verhindert eine Überexpression des Onkogens die UV-induzierte Aktivierung der Expression von p21cip1. Folge ist die verkürzte Dauer des Zellzyklusarrestes und ein rascher Wiedereintritt der geschädigten Zelle in den Zellzyklus. Anzunehmen ist also, dass die negative Regulation der DNA-Schadensantwort auf UV-Licht durch Myc in Miz-1 abhängiger Weise erfolgt. Anhand eines Zellsystems p53-defizienter humaner Keratinozyten konnte die p53-unabhängige Schadensantwort auf verschiedene DNA-schädigende Agenzien untersucht werden. Ein für HaCaT-Zellen ermittelter Signaltransduktionsweg nach DNA-Schädigung wurde zunächst reproduziert. Die UV-Bestrahlung der Keratinozyten löst eine transiente Repression des Topoisomerase-bindenden Proteins TopBP1 aus. Das aus dem inhibitorischen Komplex mit TopBP1 frei werdende Miz-1 veranlasst die transkriptionelle Aktivierung des CdK-Inhibitors p15INK4B. Ähnlich der Induktion der p21cip1-Expression ist das Resultat des UV-Schadens die Aktivierung eines CdK-Inhibitors mit folgendem Zellzyklusarrest. Die Zytostatika Zeozin und Hydroxy-Harnstoff zeigten keinen Einfluss auf die Expression von Myc, Miz, TopBP1 oder p15INK4B, den beteiligten Interaktionspartnern des Schadens-Kontrollpunktes der UV-Antwort der Keratinozyten-Zelle. Die Ergebnisse sprechen für die Schadens-Spezifität der p53-unabhängigen UV-Antwort. Der untersuchte Signaltransduktionsweg ist an der zellulären Antwort auf die Zytostatika-induzierten DNA-Defekte nicht beteiligt. Es ist möglich, dass der Miz 1/TopBP1-Komplex Bestandteil eines ausschließlich durch UV-Licht ausgelösten Schadens-Kontrollpunktes ist

Regulation der Genexpression von MYCN in humanen Neuoblastomzellen durch Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie

Seit fast 30 Jahren ist bekannt, dass die Amplifikation und Expression des Onkogens MYCN in Neuroblastomen mit einer sehr ungünstigen Prognose für die Patienten einhergeht. Dennoch liegen die Mechanismen der Genregulation von MYCN weiterhin größtenteils im Dunkeln. Die Präsenz potentieller Bindungsstellen für E2F-Proteine im Promotor des MYCN-Gens sowie Zellkulturexperimente lieferten Hinweise auf eine Rolle der Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie in der Regulation der N-myc-Expression. Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob E2F-Proteine notwendig sind, um eine primär hohe Expression von N-myc in Neuroblastomzellen mit Amplifikation des Onkogens aufrechtzuerhalten, und ob sie hinreichend sind, um die Transkription von MYCN in Zellen ohne endogene Expression von N-myc einzuleiten. Durch Überexpression des Tumorsuppressorproteins p16, welches zu einer Inaktivierung endogener E2F-Proteine führt, konnte die MYCN-mRNA-Menge in Neuroblastomzellen deutlich gesenkt werden. Vergleichbare Resultate wurden durch Expression von dominant negativem E2F-1 erzielt. Da in einigen Studien gezeigt werden konnte, dass Myc-Proteine ihrerseits E2F-Gene aktivieren können, nehmen wir an, in aggressiven Neuroblastomen könnte eine positive Rückkopplungsschleife zwischen E2F-Transkriptionsfaktoren auf der einen und N-myc auf der anderen Seite existieren, die die gesteigerte Aktivität des MYCN-Onkogens aufrechterhält. Stabil transfizierte E2F-ER-Fusionsproteine waren jedoch nicht in der Lage, das endogene MYCN-Gen in Neuroblastomzellen ohne Expression von N-myc anzuschalten. E2F-Proteine werden folglich für das volle Ausmaß der starken Expression von N-myc in Neuroblastomen benötigt, sind aber nicht ausreichend, um das Onkogen MYCN in Zellen ohne endogenes N-myc zu aktivieren. In der Zukunft könnte durch Verhinderung der Bindung von E2F-Proteinen an den MYCN-Promotor oder durch gentherapeutische Ansätze, die z.B. mittels viraler Infektion den Signalweg zwischen p16 und E2F rekonstruieren, die Expression von N-myc in Neuroblastomen gesenkt werden, so dass die Aggressivität der Tumore reduziert und die individuelle Prognose der Patienten verbessert werden könnte

Transduktion und Zellzyklusregulation durch das rekombinante Tat-p27(KIP1)-Fusionsprotein in Neuroblastomzellen

Das Neuroblastom ist eine der häufigsten Tumorerkrankung im Kindesalter. Das Tumorsuppressorprotein, p27(KIP1), ist ein prognostischer Faktor bei Neuroblastomerkrankungen und korreliert positiv mit einer guten Prognose der Erkrankung. Das Tat-Fusionsprotein ist ein erst kürzlich beschriebenes Konstrukt für die Proteintransduktion und stellt eine Alternative zur konventionellen Gentherapie dar. In der vorliegenden Arbeit wurde das Tat-p27(KIP1)-Fusionsprotein hergestellt und dieses in die Neuroblastomzellen substituiert und die darausfolgende Konsequenz bezüglich des Zellzyklus untersucht, um so die prognosebestimmende Wirkung des p27(KIP1)-Proteins bei Neuroblastomen besser verstehen zu können

"Charakterisierung transkriptioneller und nicht-transkriptioneller Funktionen der Faktoren Miz1 und c-Myc in der UVB-induzierten DNA-Schadensantwort" und "Die Inhibition der Miz1-Funktion durch den Tumorsuppressor Arf führt zum Verlust der Zelladhäsion und induziert Apoptose"

Die onkogene Wirkung von c-Myc, die zur Entstehung eines breiten Spektrums maligner Tumore führt, wurde bisher hauptsächlich auf die Aktivierung von Zielgenen in einem Komplex mit Max zurückgeführt. Allerdings weisen aktuelle Studien auch auf eine bedeutende Rolle der Interaktion von c-Myc mit dem Transkriptionsfaktor Miz1 hin, die in einer transkriptionellen Repression resultiert. Daher beschäftigt sich diese Arbeit mit der Interferenz des c-Myc/Miz1-Komplexes mit der UVB-induzierten DNA-Schadensantwort sowie der Induktion der Apoptose durch den Tumorsuppressor Arf als Antwort auf onkogene Stimuli in Form erhöhter c-Myc-Mengen. Zunächst wurde durch Einsatz von murinen, embryonalen Fibroblasten, die eine Deletion der POZ-Domäne von Miz1 aufweisen, sowie durch die shRNA-vermittelte Depletion von Miz1 die Notwendigkeit von Miz1 als Aktivator der Cdkn1a Expression analysiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass Miz1 in dem verwendeten Zellsystem keine essentielle Funktion als Transkriptionsaktivator des Zellzyklusregulators p21Cip1 einnimmt. In einem humanen Zellsystem konnte jedoch eine nicht-transkriptionelle Funktion von Miz1 in der ATR-abhängigen Signalkaskade identifiziert werden, die auf der Stabilisierung des Vermittlerproteins TopBP1 beruht und somit zur Aktivierung dieses Signalwegs führt. Diese Wirkungsweise von Miz1 basiert auf der Rekrutierung von TopBP1 zum Chromatin, was dieses vor der Ubiquitinierung durch die E3-Ligase HectH9 und dadurch vor dem proteasomalen Abbau schützt. Antagonisiert wird die stabilisierende Interaktion von Miz1 und TopBP1 durch c-Myc, dessen Überexpression die Dissoziation von TopBP1 vom Chromatin und dessen Abbau bewirkt. Dementsprechend blockieren erhöhte Mengen von c-Myc die Aktivierung der UVB-induzierten Signalkaskade und somit wahrscheinlich die Reparatur der vorliegenden Schäden. Darüber hinaus wurde die Bedeutung der Interferenz von Miz1, c-Myc und dem Tumorsuppressor Arf zum Schutz vor onkogener Transformation beschrieben. Diese potentiell tumorprotektive Wirkungsweise beruht auf der Ausbildung eines DNA-assoziierten, transkriptionell repressorischen c-Myc/Miz1/Arf-Komplexes. Die Inhibition der Transkription beinhaltet neben der Relokalisierung von Arf in das Nukleoplasma die Verdrängung des Koaktivators NPM von Miz1. Zudem konnte die Ausbildung von Heterochromatin in den Promotorbereichen der Zielgene nachgewiesen werden. Darüber hinaus induziert die Assoziation mit c-Myc und Arf die post-translationelle Modifikation von Miz1 durch das Ubiquitin-ähnliche Molekül SUMO. Da c-Myc die Sequenz eines hochkonservierten SUMO-Interaktionsmotifs (SIM) aufweist und in vitro SUMO-Spezies bindet, könnte sowohl die SUMOylierung von Miz1 als auch die Bindung des modifizierten Miz1-Proteins durch c-Myc an der Aufrechterhaltung des repressiven Chromatinstatus involviert sein. Neben dem Zellzyklusinhibitor P15INK4B reprimiert dieser Komplex eine Vielzahl von Genen, welche sowohl die Zell-Zell- als auch die Zell-Matrixadhäsion vermitteln. Daher führt die Expression von Miz1, c-Myc und Arf zum Verlust der Zelladhäsion und löst somit Anoikis aus. Da für die Ausbildung dieses repressiven Komplexes die Interaktion von Arf und Miz1 mit dem Transkriptionsfaktor c-Myc essentiell ist, liegt die Vermutung nahe, dass die Proteinmengen von c-Myc für den Wechsel von Seneszenz zu Apoptose entscheiden sind. Daher könnte diese Funktionsweise des c-Myc/Miz1-Komplexes eine Möglichkeit zur Eliminierung von Zellen mit onkogenen Mutationen darstellen

Die Regulation der N-Myc-Stabilität ist eine wichtige Funktion der Aurora-A-Kinase in MYCN- amplifizierten Neuroblastomen

Das Neuroblastom ist ein Tumor des Säuglings- und Kindesalters. Es entsteht aus Vorläuferzellen des sympathischen Nervensystems, den Neuroblasten. Das klinische Erscheinungsbild reicht von sehr langsam verdrängend wachsenden Tumoren, die das Potential einer vollständigen Rückbildung ohne Therapie besitzen, bis zu aggressiven invasiv wachsenden Tumoren, deren 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit bei Ausnutzung aller zur Verfügung stehenden Therapieoptionen lediglich 30% beträgt. Die großen Unterschiede im biologischen Verhalten der Tumore basieren auf molekulargenetischen Risikofaktoren. Einer dieser Risikofaktoren ist die Amplifikation des Protoonkogens MYCN. Das exprimierte Protein N-Myc ist ein Transkriptionsfaktor, der andere Gene aktivieren und das Wachstum der Zelle beeinflussen kann. Es sind viele Zielgene des N-Myc-Proteins bekannt. Diese Kenntnisse reichen jedoch nicht aus um die N-Myc-induzierte Tumorentstehung sowie das besonders aggressive Wachstum und die schlechte Prognose der MYCN-amplifizierten Tumore zu erklären. Um weitere Gene zu identifizieren, die für das Wachstum der MYCN-amplifizierten Tumore essentiell sind, wurde ein Screen durchgeführt. Dabei wurden jeweils 194 Gene in einer MYCN-amplifizierten Neuroblastomzelllinie und einer Zelllinie ohne MYCN-Amplifikation ausgeschaltet. Alle Gene, die in der MYCN-amplifizierten Zelllinie einen Wachstumsarrest auslösten, für die nicht amplifizierte Zelllinie hingegen verzichtbar waren, wurden gelistet. Die Bedingungen wurden von 17 Genen erfüllt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden mit welcher Effektivtät die Expression der einzelnen Gene im Screen herunterreguliert wurde. Dies ist notwendig um die Anzahl der tatsächlich untersuchten Gene abschätzen zu können. Unter den 17 entdeckten Genen befindet sich die Aurora-Kinase A. Wird Aurora-A inhibiert bleiben die MYCN-amplifizierten Zellen im Wachstum zurück. Um zu überprüfen, ob der beobachtete Effekt nicht nur zelllinienspezifisch ist, sondern generelle Gültigkeit besitzt und auf andere Zelllinien und Neuroblastome übertragbar ist, wurden verschiedene Zelllinien auf dieses Verhalten bei Aurora-A-Depletion überprüft. In vier MYCN-amplifizierten und vier nicht amplifizierten Zelllinien bestätigten sich die Beobachtungen. Darüber hinaus konnte in den acht Neuroblastomzelllinien durch Untersuchung der Proteinveränderungen in der Zelle bei Aurora-A-Depletion auf den möglichen Mechanismus, auf dem die Beobachtungen des Wachstumsarrests beruhen, geschlossen werden. Aurora-A stabilisiert N-Myc und ist somit maßgeblich am Wachstum der Zelle beteiligt. Im Gegenzug dazu führt die Aurora-A-Depletion zu erniedrigten N-Myc-Spiegeln in der Zelle und begünstigt somit den Wachstumsarrest. Aurora-A-Kinase konnte als wichtiger Regulator der N-Myc-Stabilität identifiziert und seine entscheidende Bedeutung bei der Entstehung der MYCN-amplifizierten Neuroblastome geklärt werden

Identifizierung von Kaiso Like 1 (Zbtb4) als negativem Regulator der P21CIP1-Expression, Interaktionspartner von Miz1 und Histondeacetylasen sowie Modulator der zellulären p53-Antwort

Kaiso Like 1 (Zbtb4) ist ein neu identifiziertes Protein, das zur Familie der BTB/POZ-Domänen-Zinkfinger-Proteine zählt. Aufgrund seiner Homologie zu dem Transkriptionsfaktor und POZ-Protein Kaiso wurde es Kaiso Like 1 benannt. Wegen seiner Gruppenzugehörigkeit zu den BTB-Proteinen wird es auch Zbtb4 genannt. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war über Kaiso Like 1 (KL1) einzig bekannt, dass die Expression seiner mRNA in Neuroblastomen, die mit einer schlechten Prognose einhergehen, gegenüber Neuroblastomen mit einer guten Prognose herunterreguliert ist. Eine Oncomine-Datenbankanalyse hat dieses Expressionsmuster für viele weitere solide Tumoren bestätigt. Ebenso hat sie ergeben, dass die mRNA-Expression von KL1 in soliden Tumoren im Vergleich zu Normalgewebe herunterreguliert ist. Ziel dieser Arbeit war es daher, KL1 näher zu charakterisieren, hierbei Interaktionspartner und Zielgene sowie eine mögliche biologische Funktion zu identifizieren. Zur Charakterisierung wurde KL1 im Zellkultursystem sowohl überexprimiert als auch depletiert. Eine starke Überexpression von KL1 induziert Apoptose in humanen Zelllinien, die durch eine FACS-Analyse nachgewiesen werden konnte. Zellen, die KL1 in geringen Mengen überexprimieren, sowie KL1-depletierte Zellen weisen jedoch unter normalen Zellkulturbedingungen keinen spezifischen Phänotyp im Vergleich zu Kontrollzellen auf. Um eine biologische Funktion von KL1 zu identifizieren, dessen mRNA-Expression in schlecht prognostischen Tumoren herunterreguliert ist, wurde KL1 in der Neuroblastomzelllinie SH-EP depletiert und die Zellen mit verschiedenen in der Neuroblastomtherapie eingesetzten Chemotherapeutika behandelt. KL1-depletierte Zellen überleben die Behandlung mit niedrig dosiertem Vincristin, während die Kontrollzellen absterben. Vincristin induziert keinen DNA-Schaden, sondern hemmt, niedrig dosiert, die Dynamik der Mikrotubuli. Dies führt zu einer Aktivierung von p53, welches daraufhin seine pro-apoptotischen Zielgene sowie P21CIP1 aktivieren kann, über das p53 den G1-Arrest im Zellzyklus vermittelt. In dieser Arbeit wurde die Ursache für die Resistenz KL1-depletierter Zellen herausgefunden: KL1 blockiert spezifisch den p53 induzierten G1-Arrest, indem es als Repressor die Transaktivierung seines neu identifizierten Zielgenes P21CIP1 hemmt. In KL1-depletierten Zellen entfällt diese Repression, so dass sich die p53-Antwort nach Behandlung mit niedrig dosiertem Vincristin von Apoptose in Richtung G1-Arrest mit anschließend niedriger Proliferationsrate verschiebt. Eine gleichzeitige Depletion von P21CIP1 hebt die Resistenz KL1-depletierter Zellen gegenüber Vincristin größtenteils wieder auf. Um zu zeigen, dass KL1 die p53-Antwort generell und nicht nur nach Behandlung mit Vincristin moduliert, wurden SH-EP-Zellen, die KL1 überexprimieren, sowie Kontrollzellen mit Nutlin-3, einem Stabilisator der p53-Aktivität, behandelt. Während die Kontrollzellen unter den gewählten Bedingungen mit einem G1-Arrest (nicht mit Apoptose) auf die Behandlung reagieren, durchlaufen SH-EPZellen, die KL1 überexprimieren, einen normalen Zellzyklus. Die KL1 vermittelte Repression der P21CIP1-Expression erfolgt dabei unabhängig von p53, wahrscheinlich durch Interaktion mit Miz1 und Histondeacetylase-Repressorkomplexen am P21CIP1-Promotor: In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Hemmung der Histondeacetylase-Aktivität zu einer Abnahme der KL1 vermittelten Repression der P21CIP1-Expression führt und KL1 die Miz1 vermittelte Transaktivierung des P21CIP1-Promotors in Reporter-Assays blockiert. Darüber hinaus wurde in Co-Immunopräzipitationsanalysen eine Interaktion zwischen den exogenen Proteinen KL1 und Miz1 unter anderem mit der Histondeacetylase 2 nachgewiesen. Ebenso gelang der Interaktionsnachweis von KL1 und endogenem Miz1. Eine In-vivo-Bindung von KL1 an den P21CIP1-Promotor und eine In-vitro-Bindung von KL1 an KL1-Bindungssequenzen des P21CIP1-Promotors sowie an Miz1-Bindungssequenzen, wenn Miz1 co-exprimiert wurde, konnte ebenso nachgewiesen werden. In dieser Doktorarbeit wurde KL1 über die Hemmung von P21CIP1 als ein weiterer Faktor in Neuroblastomzellen identifiziert, der die p53-Antwort kontrolliert. Andere Studien zeigen, dass p21Cip1 je nach zellulärem Kontext eine Funktion als Tumorsuppressor oder als Onkogen ausüben kann. KL1 als Repressor der P21CIP1-Expression könnte demnach die onkogene Funktion von p21Cip1 in soliden Tumoren hemmen. Darin könnte der Grund für die Herunterregulation der KL1-mRNA-Expression liegen. Als therapeutisches target eignet sich KL1 jedoch nicht generell. Die Herunterregulation seiner Expression führt nur spezifisch zu einer Resistenz gegenüber niedrig dosiertem Vincristin und nicht gegenüber anderen in der Neuroblastomtherapie eingesetzten Chemotherapeutika. Ursache hierfür ist, dass DNA schädigende Chemotherapeutika nicht nur einen p53 vermittelten G1-Arrest induzieren, der durch KL1 über Hemmung der P21CIP1-Expression blockiert werden kann, sondern auch einen G2-Arrest, der unabhängig von p21Cip1 ist

Die p300 Protein Acetyltransferaseaktivität supprimiert eine dem humanen Systemischen Lupus Erythematosus ähnliche Autoimmunerkrankung in Mäusen

p300, als eine von 15 beschriebenen Acetyltransferasen der Mammalia, besitzt zahlreiche Interaktionspartnern, die gleichzeitig als Substrate der Acetylierung fungieren. Unter diesen sind Proteine, die in der Hämatopoese eine essentielle Rolle spielen. Eine konditionelle Knock-In-Maus mit heterozygoter Expression eines Acetyltransferase-defizienten p300 (p300AS) in der Keimbahn ist embryonal letal, wohingegen heterozygote Knock-Out-Mäuse für p300 und embryonale Stammzellen, die homozygot für die Mutation waren, lebensfähig sind. Des Weiteren sind mehrere Mutationen der p300-Acetyltransferaseaktivität in Leukämien bekannt. Zusammenfassend lassen diese Daten eine Rolle der p300-Acetyltransferaseaktivität in der Hämatopoese der Mäuse vermuten. Daher wurde mit dieser Arbeit die Funktion der p300-Acetyltransferaseaktvität während der B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass Mäuse mit Expression eines Acetyltransferase-defizienten p300 ausschließlich in B-Zellen aufgrund der Entwicklung einer Autoimmunerkrankung frühzeitig sterben. Diese Erkrankung ist in ihrer Pathologie ähnlich dem humanen Systemischen Lupus Erythematosus (SLE). Die pathologischen Erscheinungen der Mäuse umfassen eine Splenomegalie, Glomerulonephritis, Vaskulitis, Einlagerungen von Immunglobulinkomplexen in verschiedenen Organen und die Produktion von Autoantikörpern gegen dsDNA und andere nukleäre Antigene. Das frühere Sterben der Weibchen gegenüber den Männchen ist ein weiteres Merkmal des humanen SLE, bei dem über 90% der Patienten Frauen sind. Die fehlende p300-Acetyltransferaseaktivität in den B-Zellen führt neben einer reduzierten Anzahl an transitionellen und Marginalzonen-B-Zellen in der Milz zu einem partiellen Verlust der B-Zell-Differenzierung in den Mäusen. Mäuse mit einer induzierten ubiquitären Expression des mutierten p300 entwickeln ebenfalls eine SLE-ähnliche Autoimmunerkrankung. Daraus lässt sich schließen, dass die p300-Acetyltransferaseaktivität notwendig für die Regulation der Selbsttoleranz der B-Zellen sowie deren Differenzierung ist. Ebenso zeigt dies, dass die Acetyltransferaseaktivität von p300 die Ausbildung einer SLE-ähnlichen Autoimmunerkrankung supprimiert. Neben diesem Phänotyp der B-Zellen konnte ich zeigen, dass die B-Zellen mit Expression des Acetyltransferase-defizienten p300 dennoch in der Lage sind, in vivo Immunglobuline zu bilden, welche insbesondere für die Isotypen IgG2b und IgM erhöht sind. FACS-Analysen zeigen, dass die erhöhten Mengen an Immunglobulinen mit einer höheren Anzahl an aktivierten B-Zellen in der Milz dieser Mäuse korrelieren. Eine Analyse der humoralen Immunantwort gegenüber dem T-Zell-abhängigen Antigen Ovalbumin verdeutlicht eine bereits erhöhte Anzahl an Ovalbumin-spezifischen Antikörpern vor der Immunisierung. Wohingegen 14 Tage nach der Immunisierung die Primärantwort der Mäuse mit Acetyltransferase-defizientem p300 ähnlich der von den Kontrollmäusen ist. Im Gegensatz dazu wird bei der Erinnerungsantwort eine schwächere Bildung von Ovalbumin-spezifischen Antikörpern detektiert. Da die Mäuse mit B-Zell-spezifischer Expression von Acetyltransferase-defizientem p300 nach Gabe des Antigens Ovalbumin eine B-Zell-Aktivierung zeigen, wird zusätzlich die Proliferation der B-Zellen ex vivo nach Aktivierung verschiedener Signalwege untersucht. Alleinig nach Induktion des BCR-Signalweges durch Zugabe von α-IgM zur Quervernetzung des BCR proliferieren die B-Zellen schwächer. Die reduzierte Anzahl proliferativer Zellen wird dabei nicht durch eine erhöhte Apoptose verursacht. Daher deutet dies auf eine Hemmung der Proliferation durch die fehlende Acetyltransferaseaktivität von p300 hin, welches unter anderem durch eine im cDNA-Microarray detektierte Deregulation des BCR-Signalweges verdeutlicht wird. Biochemische Analysen des Effektes von Acetyltransferase-defizientem p300 auf den Acetylierungsstatus der Proteine zeigen keine globalen oder promotorspezifischen Veränderungen der Histon H3K18-Acetylierung in B-Zellen mit reduzierter p300-Acetyltransferaseaktivität auf. Allerdings ist eine reduzierte Acetylierung bei größeren Proteinen als Histonen nachweisbar. Dies deutet darauf hin, dass vermutlich andere Proteine als Histone die kritischen Substrate der p300-Acetyltransferaseaktivität in vivo sind. Für weitere Analysen stellte ich eine B-Zelllinie her, in die durch homologe Rekombination das mutierte p300AS eingeführt wird. Diese B-Zelllinie synthetisiert nachweislich das mutierte p300AS, welches in vitro eine reduzierte Acetyltransferase-aktivität aufweist. Mit Hilfe der Zelllinie sind nun weitere Versuche, wie Proteomanalysen, zur Identifikation der Substrate, die auf die p300-Acetyltransferaseaktivität angewiesen sind, möglich

Untersuchungen zur Transaktivierung und Degradation des Nukleären Hormonrezeptors PPARγ

Nukleäre Hormonrezeptoren (NHRs) spielen eine bedeutende Rolle in einer großen Zahl physiologischer und pathologischer Vorgänge des menschlichen Organismus. Sie wirken als Transkriptionsfaktoren, deren Aktivität von Liganden reguliert wird. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) ist ein Mitglied der Familie der NHRs und hat unter anderem Einfluss auf die Adipogenese, die Regulation der systemischen Insulin-Sensitivität, den Fettstoffwechsel, die Tumor-Biologie und die Inflammation. PPARγ reguliert Gene, indem er als Heterodimer mit dem Retinoic X Rezeptor (RXR) an Promotorregionen bindet. Die in der Therapie des Diabetes Typ 2 als „Insulin-Sensitizer“ verwendeten Thiazolidinedione (TZDs), wie z.B. Rosiglitazon, sind hochpotente synthetische PPARγ-Liganden. Die Aktivierung von PPARγ durch Ligand führt aber auch zu einer Ubiquitinierung des Rezeptors mit nachfolgendem proteasomalen Abbau des Proteins. Aufgrund der verschiedenen Effekte von PPARγ wäre es von großer biologischer und therapeutischer Bedeutung, wenn es gelänge, die Aktivität dieses Transkriptionsfaktors selektiv zu beeinflussen. Dazu ist es notwendig, die Prozesse bei der Aktivierung von PPARγ genauer zu verstehen. In dieser Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob die ligandabhängige transkriptionelle Aktivität und Degradation miteinander gekoppelt sind. Für RXR wurden Punktmutanten beschrieben, deren Transaktivierung und Degradation unabhängig voneinander ablaufen. Ein Ziel dieser Arbeit war es, zu diesen RXR-Punktmutanten strukturgleiche, analoge PPARγ-Punktmutanten zu klonieren und zu charakterisieren. Es zeigte sich, dass bestimmte PPARγ-Punktmutanten eine reduzierte Affinität zu PPARγ-Ligand aufwiesen. Unter optimaler Ligandkonzentration wiesen alle PPARγ-Punktmutanten eine stark verringerte transkriptionelle Aktivität auf. In weiteren Versuchen zeigte sich, dass nur transkriptionell aktive PPARγ-Allele ligandabhängig abgebaut werden. Dagegen wurden die transkriptionell inaktiven PPARγ-Mutanten nicht abgebaut bzw. sogar stabilisiert. Zusammenfassend kann man daraus schließen, dass für PPARγ transkriptionelle Aktivität und Degradation notwendig miteinander gekoppelt sind. Weiterhin wurde in dieser Arbeit untersucht, auf welche Weise das Proteasom an der Regulation der transkriptionellen Aktivität von PPARγ beteiligt ist. Eine Reihe von Studien, die die transkriptionelle Aktivität von PPARγ mittels exogener Reporterkonstrukte maß, ergab, dass die Hemmung der Proteasomaktivität zu einer Steigerung der Transaktivierung von PPARγ führt. Demgegenüber konnte hier gezeigt werden, dass die ligandabhängige Expression von endogenen PPARγ-Zielgenen durch Proteasom-Inhibition gehemmt wird. Dies ist ein Hinweis darauf, dass anders als bisher vermutet die transkriptionelle Aktivierung der hier untersuchten endogenen Zielgene durch PPARγ die Aktivität des Proteasoms benötigt