Influence de stress environnementaux sur le comportement et le protéome de Listeria monocytogenes (Application aux ateliers de production fromagère)

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène ubiquiste responsable de toxi-infections alimentaires chez l'homme et l'animal. Le contact des denrées alimentaires avec un équipement de production souillé représente une source potentielle de contamination dont les conséquences dépendent de l'état physiologique des bactéries incriminées. Dans les industries alimentaires, l'alternance des périodes de production et des opérations de nettoyage occasionne des stress thermiques et de carence nutritionnelle pour les bactéries de l'environnement, majoritairement présentes sous forme de biofilm. Les objectifs de notre travail étaient d'une part, d'étudier l'impact de ces stress sur le comportement de L. monocytogenes en milieu simulant le tfomage (bouillon de Richard) et sur Camembert et d'autre part, identifier les protéines impliquées par les stress de carence et/ou d'adhésion par une approche protéomique. L'application d'un traitement thermique (56ʿC/30 min) a détruit plus de 78% des cellules de L. monocytogenes. Les cellules survivantes n'ont acquis aucune résistance croisée à l'acide et se développent ou survivent moins bien dans les conditions (pH, ToC) de la production du Camembert. Les cellules issues d'un biofilm ont présenté une croissance plus rapide à 4ʿC et une acidorésistance accrue à pH 5 témoignant d'une physiologie propre à l'état adhérent. La carence a retardé la croissance des cellules à pH 7. Elle a augmenté (à l2ʿC) ou diminué (à 4ʿC) leur résistance à pH 5. D'après les fonctions des protéines induites identifiées, les cellules planctoniques carencées semblent orientées vers le maintien d'une activité métabolique minimum et l'acquisition de résistances. Les cellules du biofilm semblent être dans une dynamique de synthèse protéique, de division cellulaire et d'adaptation. Cetté étude contribue à la compréhension des mécanismes de survie de L. monocytogenes dans l'environnement et de leurs conséquences en production alimentaire.COMPIEGNE-BU (601592101) / SudocSudocFranceF

Application des lipases pour la valorisation de l'acide docosahexaènoïque de la microalgue Isochrysis galbana

Les microalgues marines constituent une source de DHA (acide docosahexaènoique, C22 :6 3) encore peu valorisée. Cette étude porte sur l'enrichissement en DHA de phospholipides issus de la microalgue Isochrysis galbana par voie enzymatique. L'analyse des lipides microalgaux a montré que 75% du DHA total est contenu dans les phospholipides dont il représente 50% des acides gras. De plus, il a été montré que le DHA est principalement situé en position sn-2 au sein des phospholipides. Parmi 19 préparations de lipase, 3 ont été sélectionnées pour leur caractère discriminant envers le DHA au cours de l'hydrolyse des phospholipides, c'est-à-dire pour leur capacité à libérer efficacement tous les acides gras sauf le DHA. Il s'agit des lipases de Rhizopus oryzae et de Mucor javanicus d'Amano Enzyme Inc. (Royaume-Uni) et de la lipase de Rhizopus oryzae de DSM (Pays-Bas). Les meilleurs résultats ont été obtenus avec les 2 premières lipases : une proportion de DHA de 71% a été atteinte en 5 minutes de réaction et le rendement en DHA est alors de 98,9% et 92,1%, respectivement. Un temps de réaction de 3 heures permet d'atteindre une proportion maximale de DHA de 77%, au détriment du rendement en DHA. D'autre part, il a été démontré, grâce à une approche enzymatique originale, que le phénomène de migration du groupement acyle de la position sn-2 vers la position sn-1 a lieu de façon importante au cours de l'hydrolyse des phospholipides. On a pu déduire de ces résultats que le caractère discriminant envers le DHA d'une lipase dans nos conditions de réaction est dû à une typosélectivité contre cet acide gras et non à une régiosélectivité pour la position sn-1 des phospholipides. Enfin, au cours de cette étude, la présence d'une activité lipolytique endogène chez I. galbana, jusqu'alors uniquement soupçonnée, a été confirmée. Elle est principalement active contre les phospholipides et le DHA est l'acide gras majoritairement libéré lors de l'hydrolyse des lipides endogènes. Il pourrait donc s'agir d'une phospholipase de type A2.Marine microalgae represent a source of DHA (docosahexaenoic acid, C22 :6 3) which is not widely used. This study deals with enzymatic DHA enrichment of phospholipids from the microalga Isochrysis galbana. Analysis of microalgal lipids showed that 75 % of total DHA is carried by the phospholipids, representing 50% of phospholipid fatty acids. Moreover, it has been shown that DHA is mainly located at the sn-2 position of phospholipids. Among 19 lipase preparations tested, 3 have been selected according to their ability to discriminate against DHA during phospholipid hydrolysis, i.e. they liberate efficiently all fatty acids except DHA. They are Rhizopus oryzae and Mucor javanicus lipases from Amano Enzymes Inc., U.K. as well as Rhizopus oryzae lipase from DSM, Netherlands. The best results have been obtained with the first 2 lipases: a DHA ratio of 71% was reached after 5 minutes of reaction and DHA yields of 98.9% and 92.1% were obtained for these two lipases, respectively. A reaction time of 3 hours allows the maximal DHA ratio of 77%, which is detrimental to the DHA yield. In a second part, it has been demonstrated, thanks to an original enzymatic approach, that acyl migration from sn-2 position to sn-1 position occurred in significant amounts during phospholipid hydrolysis. These results lead to the conclusion that the lipase ability to discriminate against DHA under our reaction conditions is due to a typoselectivity against this fatty acid and not to a regioselectivity towards the sn-1 position of phospholipids. At last, this study clearly shows the presence of an endogenous lipolytic activity in Isochrysis galbana. It is mainly active on phospholipids and DHA is the fatty acid the most widely liberated during hydrolysis of endogenous lipids. Therefore, it can be suggested that this activity comes from a phospholipase A2.LE MANS-BU Sciences (721812109) / SudocSudocFranceF

Isolement et caractérisation de trois gènes codant une lipase et deux estérases hypothétiques chez la microalgue marine Isochrysis galbana (Prymnesiophyceae, Haptophyta)

Connues pour leur forte teneur en acides gras polyinsaturés 3, certaines espèces de microalgues suscitent actuellement l intérêt des chercheurs et des industriels. Les enzymes lipolytiques, qui sont impliquées dans la mobilisation et le stockage des acides gras, n ont pas encore été caractérisées d un point de vue structural et fonctionnel chez les algues. Ce mémoire décrit l isolement, l analyse et le clonage de 3 gènes codant une lipase et deux estérases hypothétiques chez la microalgue marine Isochrysis galbana. L analyse des marqueurs de séquences exprimées, édités dans la banque EST d Isochrysis galbana, a révélé l existence de gènes incomplets susceptibles de coder des enzymes lipolytiques. Après extraction des ARN totaux, purification et rétrotranscription des ARN poly(A)+, 3 ADNc pleine-longueur ont été obtenus par amplification rapide de leurs extrémités 5 et 3 . L analyse des séquences nucléotidiques a révélé la présence de 3 phases ouvertes de lecture codant 3 protéines de poids moléculaires théoriques équivalents à 49,06 kDa, 26,92 kDa et 24,88 kDa. Les études d alignement de séquences ont montré des similitudes avec des lipases et des estérases d organismes bactériens, fongiques, végétaux et animaux. Bien que de faibles taux d identité (20 à 30 %) aient été observés, les 3 séquences contiennent la triade catalytique Ser/Asp/His et le pentapeptide consensus Gly-X-Ser-X-Gly, 2 motifs hautement conservés chez les enzymes de la superfamille des hydrolases à repliement a/b. Pour confirmer la fonction lipolytique des protéines hypothétiques, une démarche expérimentale a été initiée : les gènes ont été clonés dans un vecteur d expression de levure.Known for their high 3 fatty acids contents, some microalgal species are currently receiving much attention from scientific and industrials. Lipolytic enzymes from microalgae involved in fatty acids mobilisation and storage have not been structurally and functionally characterised. This work describes isolation, analyses and cloning of 3 complete gene encoding one putative lipase and two putative esterases from the marine microalga Isochrysis galbana. The EST database of Isochrysis galbana was searched for cDNA sequences showing homology with lipolytic enzymes. Among the candidates genes identified, none of them was found to be full-length. Total RNA extraction, poly(A)+ RNA purification, reverse transcription, rapid amplifications of both 5 - and 3 - cDNA ends and nested PCR were performed to obtain 3 complete coding sequences. Nucleotide sequence analyses revealed 3 open reading frames encoding 3 proteins with a predicted molecular weight of approximately 49,06 kDa, 26,92 kDa and 24,88 kDa. Databases were searched for a global function expertise and results revealed similarities with lipases and esterases from various organisms such as bacteria, fungi, plants and animals. Although those three putative proteins shared low levels of amino acids identity (from 20 to 30 %), they all enclosed two highly conserved patterns, the catalytic triad Ser/Asp/His and the consensus pentapeptide Gly-X-Ser-X-Gly, found in enzymes of the a/b hydrolases superfamily. To confirm the predicted lipolytic function, an experimental procedure was introduced: genes were cloned in a yeast expression vector.LE MANS-BU Sciences (721812109) / SudocSudocFranceF

NUTRITION Acides gras polyinsaturés de microalgues : intérêts et développements actuels

Commercialisés comme compléments nutritionnels sous forme de capsules ou utilisés comme ingrédients pour la préparation de lait maternisé, les acides gras polyinsaturés (AGPI) de la série ôméga3 sont principalement obtenus à partir d’huiles de poisson. Du fait de leur richesse en AGPI, les microalgues constituent une source alternative à fort potentiel pour l’obtention de ces acides gras d’intérêt. Différents travaux, cherchant à améliorer la productivité des photobioréacteurs et les procédés de purification, ont largement contribué à réduire les coûts de production d’AGPI d’origine microalgale. Toutefois, pour rendre les microalgues compétitives par rapport aux huiles de poisson pour l’obtention d’AGPI, des travaux d’exploration métabolique, de biologie moléculaire et de génie enzymatique sont encore à mener

NUTRITION Acides gras polyinsaturés de microalgues : intérêts et développements actuels

Commercialisés comme compléments nutritionnels sous forme de capsules ou utilisés comme ingrédients pour la préparation de lait maternisé, les acides gras polyinsaturés (AGPI) de la série ôméga3 sont principalement obtenus à partir d’huiles de poisson. Du fait de leur richesse en AGPI, les microalgues constituent une source alternative à fort potentiel pour l’obtention de ces acides gras d’intérêt. Différents travaux, cherchant à améliorer la productivité des photobioréacteurs et les procédés de purification, ont largement contribué à réduire les coûts de production d’AGPI d’origine microalgale. Toutefois, pour rendre les microalgues compétitives par rapport aux huiles de poisson pour l’obtention d’AGPI, des travaux d’exploration métabolique, de biologie moléculaire et de génie enzymatique sont encore à mener

Les microalgues marines : source alternative d’acide eicosapentaènoïque (EPA) et d’acide docosahexaènoïque (DHA)

Les lipides de microalgues marines sont riches en acide eicosapentaènoïque (EPA, C20 :5) et en acide docosahexaènoïque (DHA, C22 :6), deux acides gras hautement insaturés de la série ω3 (AGHI-ω3), et représentent aujourd’hui une source alternative potentielle face aux huiles de poissons. Les microalgues synthétisent de l’EPA et\\ou du DHA dans des proportions relatives variables selon leur classe taxonomique. D’autre part, pour une même espèce, les teneurs en ces acides gras dépendent fortement des conditions de culture. De part leur métabolisme photoautotrophe, la production de biomasse microalgale à grande échelle nécessite la conception de bioréacteurs spécifiques, les photobioréacteurs, qui représentent encore aujourd’hui un défi technologique. La poursuite de travaux de recherche, dans des domaines très divers, reste nécessaire pour confirmer la viabilité économique des procédés industriels de production d’EPA et de DHA par les microalgues

Les microalgues marines : source alternative d’acide eicosapentaènoïque (EPA) et d’acide docosahexaènoïque (DHA)

Les lipides de microalgues marines sont riches en acide eicosapentaènoïque (EPA, C20 :5) et en acide docosahexaènoïque (DHA, C22 :6), deux acides gras hautement insaturés de la série ω3 (AGHI-ω3), et représentent aujourd’hui une source alternative potentielle face aux huiles de poissons. Les microalgues synthétisent de l’EPA et\\ou du DHA dans des proportions relatives variables selon leur classe taxonomique. D’autre part, pour une même espèce, les teneurs en ces acides gras dépendent fortement des conditions de culture. De part leur métabolisme photoautotrophe, la production de biomasse microalgale à grande échelle nécessite la conception de bioréacteurs spécifiques, les photobioréacteurs, qui représentent encore aujourd’hui un défi technologique. La poursuite de travaux de recherche, dans des domaines très divers, reste nécessaire pour confirmer la viabilité économique des procédés industriels de production d’EPA et de DHA par les microalgues

Les microalgues marines : source alternative d’acide eicosapentaènoïque (EPA) et d’acide docosahexaènoïque (DHA)

Les lipides de microalgues marines sont riches en acide eicosapentaènoïque (EPA, C20 :5) et en acide docosahexaènoïque (DHA, C22 :6), deux acides gras hautement insaturés de la série ω3 (AGHI-ω3), et représentent aujourd’hui une source alternative potentielle face aux huiles de poissons. Les microalgues synthétisent de l’EPA et\\ou du DHA dans des proportions relatives variables selon leur classe taxonomique. D’autre part, pour une même espèce, les teneurs en ces acides gras dépendent fortement des conditions de culture. De part leur métabolisme photoautotrophe, la production de biomasse microalgale à grande échelle nécessite la conception de bioréacteurs spécifiques, les photobioréacteurs, qui représentent encore aujourd’hui un défi technologique. La poursuite de travaux de recherche, dans des domaines très divers, reste nécessaire pour confirmer la viabilité économique des procédés industriels de production d’EPA et de DHA par les microalgues

Lipides et enzymes lipolytiques de la microalgue Isochrysis galbana

International audienceMarine microalgae are now well-known for their ability to produce omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids (PUFAs) such as docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA). Among these microalgae, Isochrysis galbana has received increasing interest especially because of its high DHA content and its common use in hatchery to feed fish larvae and clams. Moreover, lipolysis occurring from the biomass harvest stage suggests that I. galbana may contain lipolytic enzymes with potential interesting selectivities. For these reasons, the potential of this microalga for the production of valuable lipids and lipolytic enzymes was investigated. Lipid analysis revealed that DHA is mainly located at the sn-2 position of the phospholipids. Thus, I. galbana was considered as an interesting starting material for the lipase catalyzed production of 1-lyso-2-DHA-phospholipids which are considered as convenient vehicles for the conveyance of DHA to the brain. Lipids from I. galbana can also be used for the enzyme-catalyzed production of structured phospholipids containing one DHA and one medium chain fatty acid in order to combine interesting therapeutic and biological benefits. Starting from total RNA extract from I. galbana, coding sequences of putative lipolytic enzymes were obtained by RACE and Nested PCR. The heterologous expression of a sequence designated IgTeCe was implemented. An expression plasmid was constructed by ligating the coding sequence to a plasmid vector and then cloned and expressed in E. coli. Results showed the effective functionality of plasmid construction for the production of a recombinant protein with the expected molecular mass. Moreover, local alignment using BLASTP and biochemical evidences support the hypothesis that the expressed protein is a thioesterase. Keywords: microalgae / v-3 polyunsaturated fatty acids / phospholipids / lipolytic enzymes Résumé-Lipides et enzymes lipolytiques de la microalgue Isochrysis galbana. Les microalgues marines sont maintenant bien connues pour leur aptitude à produire des acides gras à longue chaîne de la série v-3 comme l'acide docosahexahénoïque (DHA) ou eicosapentaénoïque (EPA). Parmi ces microalgues, Isochrysis galbana connaît, ces dernières années, un intérêt croissant du fait d'un contenu lipidique riche en DHA et de son importante utilisation en écloserie pour nourrir les larves de poissons et les bivalves. D'autre part, la lipolyse souvent observée dès l'étape de collecte de la biomasse ainsi que la forte teneur en DHA suggère qu'I. galbana pourrait contenir des enzymes lipolytiques intéressantes en termes de sélectivité. Pour ces différentes raisons, le potentiel de cette microalgue pour la production de lipides d'intérêt et d'enzymes lipolytiques a été étudié. L'analyse des lipides d'I. galbana a tout d'abord révélé que le DHA était majoritairement greffé sur la position sn-2 des phospholipides. Dans ce contexte, les phospholipides d'I. galbana constituent une matière première intéressante pour la production, par voie enzymatique, de 1-lyso-2-DHA phospholipides, des composés intéressants pour optimiser le transport du DHA au niveau du cerveau. À partir des lipides d'I. galbana, on peut également envisager la production, toujours par voie enzymatique, de phospholipides structurés contenant du DHA et un acide gras à chaîne moyenne ce qui permet de combiner des intérêts thérapeutiques et biologiques intéressants. À partir des ARN totaux d'I. galbana, des séquences codant des enzymes lipolytiques putatives ont été obtenues par RACE et Nested PCR. L'expression hétérologue d'une séquence nommée IgTeCe a été initiée. Une construction plasmidique contenant la séquence codante a été clonée et exprimée avec E. coli. Les résultats ont montré que laLes microalgues marines sont maintenant bien connues pour leur aptitude à produire des acides gras à longue chaîne de la série ω-3 comme l’acide docosahexahénoïque (DHA) ou eicosapentaénoïque (EPA). Parmi ces microalgues, Isochrysis galbana connaît, ces dernières années, un intérèt croissant du fait d’un contenu lipidique riche en DHA et de son importante utilisation en écloserie pour nourrir les larves de poissons et les bivalves. D’autre part, la lipolyse souvent observée dès l’étape de collecte de la biomasse ainsi que la forte teneur en DHA suggère qu’I. galbana pourrait contenir des enzymes lipolytiques intéressantes en terme de sélectivité.Pour ces différentes raisons, le potentiel de cette microalgue pour la production de lipides d’intérêt et d’enzymes lipolytiques a été étudié.L’analyse des lipides d’I. galbana a tout d’abord revélé que le DHA était majoritairement greffé sur la position sn-2 des phopholipides. Dans ce contexte, les phospholipids d’I. galbana constituent une matière première intéressante pour la production, par voie enzymatique, de 1-lyso-2–DHA phospholipides, des composés intéressants pour optimiser le transport du DHA au niveau du cerveau. A partir des lipides d’I. galbana, on peut également envisager la production, toujours par voie enzymatique, de phospholipides structurés contenant du DHA et un acide gras à chaîne moyenne ce qui permet de combiner des intérêts thérapeutiques et biologiques intéressants.A partir des ARN totaux d’I. galbana, des séquences codant des enzymes lipolytiques putatives ont été obtenues par RACE et Nested PCR. L’expression hétérologue d’une sequence nommée IgTeCe a été initiée. Une construction plasmidique contenant la séquence codante a été clonée et exprimée avec E. coli. Les résultats ont montré que la construction plasmidique permettait bien d’obtenir une protéine recombinante avec la masse moléculaire attendue. D’autre part, l’outil d’alignement local de séquences, BLASTP, ainsi que des données biochimiques ont permis de confirmer l’hypothèse que la protéine obtenue était une thioestérase

Lipase-catalyzed production of lysophospholipids

Lysophospholipids, such as lysophosphatidic acid or lysophosphatidylcholine, are important bioactive lipids, involved in various normal and pathological cellular processes. They also have industrial and pharmaceutical uses such as emulsifiers or components of drug delivery systems. Lipases, which natural substrates are long chain triacylglycerols, are important biocatalysts for organic synthesis mainly due to their broad substrate specificity and their ability to display high catalytic activity in organic media. This paper describes the various lipase-catalyzed reactions implemented for the production of lysophospholipids. They include hydrolysis or alcoholysis of phospholipids and acylation of the glycerophosphoryl moiety. Special emphasis is made on our work dealing with the production of lysophospholipids rich in dososahexaenoic acid, an important dietary polyunsaturated fatty acid via the hydrolysis of phospholipids extracted from the microalga Isochrysis galbana