Phytochemical study of Coreopsis tinctoria and evaluation of its antidiabetic properties

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011Coreopsis tinctoria Nutt. is a small aromatic annual and widely distributed plant that belongs to the Asteraceae family. Its use in traditional medicine has been described as early as the XVII century in China, where its decoction has been used for diarrhoea. Other medicinal properties have been added by North American Indians and include treatment of internal pains, bleeding, to strengthen blood and as an emetic. In Portugal, an infusion of the flowering tops has been described to have antidiabetic proprieties, applied to diabetes type 2 treatment. There are some published phytochemical studies on the genus Coreopsis but the information on this species chemical composition, until recently, was scarce. Flavonoids of chalcone, aurone and flavanone structure have been described in C. tinctoria flowering tops although there was no available information on the chemical constitution of bioactive extracts. Flavonoids are polyphenols well known for their antioxidant and cytoprotective activity that have also been shown to act at several levels in the glucose metabolism, which may be of relevance in the prevention and treatment of diabetes and its complications. Thus the present study aimed to: i) search for new antidiabetic lead molecules able to reduce both glycemia and tissue damage; ii) chemically characterize the bioactive extracts, and; iii) study the antidiabetic profile of extracts and metabolites of C. tinctoria as this species lacked any kind of pharmacological and toxicological data. The aqueous extract of C. tinctoria flowering tops was prepared following the traditional recipe. Fractionation by chromatography followed, and three major compounds were isolated and identified by spectroscopic methodologies. Other thirteen phenolic compounds were identified by HPLC-DAD-MS/MS. Through this technique, reproducible methods for quantitative analysis of the main compounds in bioactive extracts were also developed. Further on, to evaluate whether C. tinctoria had a beneficial effect on diabetes some in vivo assays were performed. In order to test for acute antihyhyperglycemic activity, the aqueous extract was administered to normal (euglycemic) rats at different concentrations and blood glucose levels were monitored by an oral glucose tolerance test. None of concentrations tested have shown significant lowering blood glucose effect compared to control group. In order to understand other possible glucose lowering effects, a streptozotocininduced glucose-intolerant rat model was developed. C. tinctoria aqueous extract (500 mg/Kg) was then daily administrated during three weeks which resulted in significant recovery of glucose tolerance. The active extract was quantified in terms of its main compound, the chalcone marein. As means to determine whether flavonoids were the bioactive compounds, a flavonoid-rich AcOEt fraction (125 mg/Kg), with the same marein content as the bioactive aqueous extract, was prepared and administered to the glucose-intolerant model. Results indicated glucose tolerance regain after only two weeks of treatment, an effect that was maintained over the remaining experimental period. Moreover, lipase values normalized indicating re-establishment of pancreatic function. In addition, the oral treatment with either C. tinctoria aqueous extract or AcOEt fraction caused no hepatotoxicity. Regarding cytotoxicity, C. tinctoria extracts were tested in vitro, using a pancreatic mouse insulinoma cell line (MIN6). Cell viability tests were performed and no cytotoxic effects were observed at the concentrations tested (up to 3 mg/mL). Possible insulin-secretagogue action of the bioactive C. tinctoria extracts was evaluated in two ways: i) using MIN6 cells disposed as monolayers through static incubation method or; ii) in a more sensitive model, using MIN6 cells disposed in three dimensional structures (pseudoislets) using a perifusion technique. Both yielded data that seems to indicate that C. tinctoria extracts do not act increasing insulin secretion. C. tinctoria extracts and pure compounds (marein and flavanomarein), known to be good antioxidants, were then tested for their potential protective effects in MIN6 cells challenged with pro-oxidant tert-Butyl-Hydroperoxide (tBHP) or cytokines. Results indicate that C. tinctoria extracts and pure compounds are effective cytoprotectors, which seems to be due to inhibition of the apoptotic pathway, and not through a decrease on superoxide radical production. Overall, these results support the conclusion that phenolic compounds present in C. tinctoria flowering tops extracts promote recovery of pancreatic function and glucose intolerance possibly by an anti-apoptotic mechanism of injured pancreas, suggesting C. tinctoria traditional use in diabetes therapyCoreopsis tinctoria Nutt. é uma pequena planta aromática anual, amplamente distribuída, pertencente à família das Asteraceas. Trata-se de uma planta cujo primeiro registo de utilização na medicina tradicional, data do século XVII na China, onde a sua decocção tem sido aplicada para a diarreia. Outras aplicações medicinais foram entretanto desenvolvidas por outros povos, nomeadamente, pelos Índios da América do Norte para o tratamento de dores, hemorragias, para fortalecimento do sangue e como um emético. Em Portugal, a infusão dos ápices florais de Coreopsis tinctoria, também conhecida como Estrelas-do-Egipto, foi descrita como tendo propriedades antidiabéticas, passível de ser aplicada no tratamento da diabetes do tipo dois. Existem já alguns estudos publicados na área da fitoquímica, aplicados ao género Coreopsis. No entanto, até muito recentemente, o conhecimento da composição química da espécie Coreopsis tinctoria era escasso. Flavonóides com estrutura do tipo chalcona, aurona e flavanona foram já descritos nos ápices florais desta espécie, apesar de não existir nenhuma informação sobre a constituição química de extractos bioactivos. Os flavonóides são compostos fenólicos bem conhecidos pela sua actividade antioxidante e citoprotectora, tendo também demonstrado efeitos a vários níveis no metabolismo da glucose, o que pode ser relevante na prevenção e tratamento da diabetes e das complicações macro e micro vasculares associadas a esta patologia. Tendo em conta todos estes factores, os principais objectivos deste projecto foram: i) a pesquisa de novas moléculas com potencial antidiabético capazes de reduzir tanto a glicémia como a danificação de tecidos, ii) caracterizar quimicamente os extractos bioactivos, e, iii) desenvolver um estudo do perfil antidiabético dos extractos e metabolitos presentes na Coreopsis tinctoria, na medida em que sobre esta espécie não havia até então, nenhum tipo de dados farmacológicos nem informação relativa à sua possível toxicidade. O extracto aquoso dos ápices florais da Coreopsis tinctoria foi preparado de acordo com a utilização tradicional em Portugal. Seguiu-se o fraccionamento cromatográfico, do qual se obtiveram três compostos maioritários, que foram isolados e identificados recorrendo a metodologias espectroscópicas. Outros treze compostos fenólicos foram identificados por HPLC-DAD-MS/MS. Através desta técnica, foram também desenvolvidos métodos para a análise quantitativa dos principais compostos presentes nos extractos bioactivos. No seguimento dos objectivos deste projecto, de forma a avaliar os potenciais efeitos benéficos da infusão (extracto aquoso) dos ápices florais da Coreopsis tinctoria na diabetes, procedeu-se ao estudo farmacológico, desenvolvendo alguns ensaios in vivo. Para testar a actividade antihiperglicémica aguda, administraram-se diferentes concentrações do extracto aquoso a ratos normais (euglicémicos) e, seguidamente, monitorizaram-se os níveis de glucose no sangue através do teste oral de tolerância à glucose. Nenhuma das concentrações testadas revelou um efeito significativo de diminuição dos valores de glucose no sangue comparando com o grupo controlo. Para compreender a possibilidade de outros efeitos estarem envolvidos na capacidade desta planta afectar os níveis de glucose no sangue, foi desenvolvido, em ratos Wistar, um modelo de intolerância à glucose (40 mg/Kg de estreptozotocina), na medida em que esta é característica numa situação de pré-diabetes e pode constituir por si só um risco no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. O extracto aquoso (500 mg/Kg) foi então administrado diariamente e por sonda intragástrica durante três semanas a ratos Wistar intolerantes à glucose, tendo resultado na recuperação dos níveis de glicémia. O composto identificado como maioritário, a chalcona mareina, foi quantificado no extracto activo. Como forma de determinar se os flavonóides eram os compostos bioactivos no extracto aquoso, uma fracção de acetato de etilo, rica em flavonóides mas com igual conteúdo em mareina, foi preparada e administrada (125 mg/Kg) aos ratos Wistar intolerantes à glucose. Os resultados revelaram, logo ao fim de duas semanas de.tratamento, uma normalização das curvas de glicémia, efeito que se manteve até ao final do período experimental. Adicionalmente observou-se uma recuperação da função pancreática medida pelos níveis de lipase plasmática. É de salientar, que os animais tratados com ambos, extracto aquoso e fracção de Acetato de Etilo, não apresentaram sinais de hepatotoxicidade, após três semanas de tratamento. Relativamente à citotoxicidade, os referidos extractos foram testados in vitro usando uma linha celular pancreática derivada de insulinoma de murganho (MIN6). Testes de viabilidade celular foram efectuados não revelando efeitos de toxicidade nas concentrações testadas (até 3 mg/mL). Uma possível acção insulino-secretagoga dos extractos bioactivos da Coreopsis tinctoria foi investigada de duas formas: i) usando células MIN6 dispostas em monocamada, através de um método de incubação estática ou; ii) utilizando um modelo mais sensível, usando células MIN6 dispostas em estruturas tridimensionais, também designadas por “pseudo-ilhéus”, recorrendo a uma técnica de perfusão. Ambas aparentam indicar que os extractos bioactivos de Coreopsis tinctoria não estimulam a secreção insulínica. Os extractos da Coreopsis tinctoria assim como os seus constituintes maioritários, mareina e flavanomareina, conhecidos por apresentarem actividade antioxidante, foram testados com o objectivo de avaliar o seu potencial efeito protector em células MIN6 expostas ao pro-oxidante, terc-Butil-Hidroperóxido (tBHP,) ou a um conjunto de citocinas. Os resultados revelaram, que tanto os extractos da Coreopsis tinctoria, assim como a mareina e a flavanomareina são efectivamente protectores, o que parece ser devido a uma inibição da via apoptótica e não à diminuição da produção do radical superóxido. Em conclusão, estes resultados tendem a indicar, que os compostos fenólicos presentes nos extractos dos ápices florais da Coreopsis tinctoria, promovem a recuperação da função pancreática e consequentemente revertem a situação de intolerância à glucose possivelmente através de um mecanismo anti-apoptótico no tecido pancreático danificado, o que não contraria o uso tradicional da Coreopsis tinctoria na terapia da diabetes.Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT

Qualified immigration : the case of classical music professionals from Ukraine in Madeira Classic Orquest

No universo artístico da Região Autónoma da Madeira existe um significativo e experiente grupo de profissionais de música clássica oriundos de países da Europa Central e de Leste. Tomando como principal enfoque o papel daqueles que assumem, no seio da Orquestra Clássica da Madeira, maior representatividade relativamente ao país de origem - os ucranianos - procurámos, através de um estudo empírico caracterizar esta população e perceber, não só o seu papel na sociedade de acolhimento, como a sua aceitação por esta.In the artistic universe of Madeira there is a significant and experienced group of classical music professionals from countries of Central and Eastern Europe. Taking as its primary focus the role of those who assume, within the Madeira Classical Orchestra, greater representation of the country of origin - Ukrainians - we sought, through an empirical study, to characterise this population and understand not only their role in the host society, but also their acceptance by it

Curiosidades Matemáticas: à descoberta dos Fractais

No Ano Mundial da Matemática – ano 2000, o Departamento de Matemática da ESTV realizou algumas actividades com o intuito de comemorar este evento. Para tal propusemo-nos dinamizar a sessão: “À descoberta dos fractais” para alunos do 2º e 3º ciclos, enquadrada nas “tardes de matemática”. Escolhemos esta sessão por abordar um tema recente e pouco conhecido dos alunos: os objectos fractais, que surgem envoltos num ambiente “mágico” e contemporâneo dos computadore

Lung cancer in Portugal: an epidemiologic analysis of incidence, geographic variability, survival and associated factors as a basis for the implementation of public policies

ABSTRACT - Objective: To investigate lung cancer (LC) survival in Portugal and the key factors that can contribute to its improvement, and generate evidence to inform future health policies that can lead to better outcomes for patients and for the health system. Methods: Patient-level data from the regional oncologic registries allowed a nationwide coverage. Background context for LC burden, classification, risk factors, survival, treatment, early diagnosis and quality-of-life was provided. We characterized patients diagnosed with lung cancer, analyzed incidence rates (IR), spatial patterns, and conducted 5-year survival analysis addressing factors as sex, age, histology, stage, treatment and quality-of-care indicators. Finally, we carried-out an overview on current LC screening programs. Results: Male:female ratio 3:1. IR markedly increased with age. Most patients (>80%) had locally-advanced or metastatic disease. Highest IR found in Azores. Most relevant high incidence clusters in Oporto and Lisbon areas. Median overall survival (OS) in a 5-year follow-up study was 264 days and cumulative OS 13.6%. Male gender, increasing age>50, and stage identified as main predictors of decreased survival. Stage had the worst impact. Treatment rate decreased with increasing stage, particularly for surgery (75.2% stage I; 7.8% stage IV) highlighting early diagnosis importance for potentially curative treatment. Treatment showed protective effect on survival but timely treatment did not, likely due to confounding by severity. Evidence supports LC screening implementation targeting high-risk patients to improve outcomes. Conclusions: Our research contributed to identify critical incidence areas. LC survival is highly dependent on early diagnosis, adequate and timely treatment. A targeted LC screening program can potentially transform disease survival.RESUMO - Objetivo: Investigar a sobrevivência ao cancro do pulmão (CP) em Portugal, principais fatores que podem contribuir para a sua melhoria, e gerar evidência para informar futuras políticas de saúde que possam conduzir a melhores resultados para os doentes e para o sistema de saúde. Métodos: Dados individualizados dos doentes obtidos dos registos oncológicos regionais permitiram uma cobertura nacional. Foi efetuada contextualização da carga da doença, classificação, fatores de risco, sobrevivência, tratamento, diagnóstico precoce e qualidade-de-vida. Realizada caracterização dos doentes diagnosticados com CP, análise de taxas de incidência (TI), distribuição espacial, e análise de sobrevivência a 5-anos incorporando fatores como sexo, idade, histologia, estadio, tratamento e indicadores de qualidade. Finalmente, foi realizada uma revisão da situação atual dos programas de rastreio ao CP. Resultados: O rácio homem:mulher foi de 3:1. A TI aumentou expressivamente com o avançar da idade. A maioria dos doentes (> 80%) apresentou doença localmente avançada ou metastática. Maior TI observada nos Açores. Os clusters de alta incidência mais relevantes foram observados nas áreas do Porto e Lisboa. A mediana de sobrevivência a 5-anos foi de 264 dias e a sobrevivência global (SG) cumulativa 13,6%. Os maiores preditores de pior sobrevivência foram sexo masculino, idade crescente acima de 50 anos e estadio. O estadio revelou ter o pior impacto. A taxa de tratamento diminuiu com aumento do estadio, particularmente na cirurgia (75.2% estadio I; 7.8% estadio IV), evidenciando a importância do diagnóstico precoce num tratamento potencialmente curativo. O tratamento demonstrou efeito protetor na sobrevivência, mas o contrário ocorreu com o tratamento atempado, provavelmente devido ao confundimento devido à gravidade. A evidência apoia a implementação de rastreio ao CP, em doentes de alto-risco, para melhorar resultados. Conclusões: Esta investigação contribuiu para identificar áreas críticas de incidência. A sobrevivência à CP é altamente dependente do diagnóstico precoce e tratamento adequado e atempado. Um programa de rastreio ao CP tem potencial para transformar a sobrevivência à doença

INTEGRATING BIOFERTILIZERS AND PRECISION AGRICULTURE

This article presents a comprehensive analysis of the integration of biofertilisers and precision agriculture, with the aim of creating a virtuous circle of agricultural growth and sustainability, by Cristina Cruz and Teresa Dias of the Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboainfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Improving Small Cities Competitiveness through Greenway Planning and Design: Vila-Franca-de-Xira case study, Lisboa Metropolitan Area, Portugal

Greenway concept as a strategy to support landscape planning and design has been addressed in research studies and publications worldwide (Fabos and Ryan, 2006). However, to fully understand the significance of greenways as a mean to improve cities landscape, the analysis of the design and implementation levels are crucial in order to assess its efficiency towards life quality and acceptance by local populations. This paper aims to further research the role of greenways on medium/small cities in Portugal, as a mean to improve their competitiveness. Through the case study of greenway design and implementation in the city of Vila- Franca-de-Xira (VFX) in the North Region of Lisbon Metropolitan Area (figure 1), where the authors have been involved as designers, it was analyzed how the concept of greenway enables a better coordinate municipal urban planning, government funds capturing and allocation for public space improvement. The outcome here hypothesized is that, beyond greenway’s efficiency as a communication tool between planning professionals and politicians, they enable to introduce a positive dynamic towards the improvement of cities environmental and landscape quality. Addressing issues of public health, well-being, resources’ protection, and public attraction, greenways may well contribute to increase cities competitiveness in a metropolitan context

The shading sign: is it exclusive of endometriomas?

To investigate if the shading sign is an exclusive MRI feature of endometriomas or endometrioid tumors, and to analyze its different patterns. Three hundred and fourty six women with adnexal masses who underwent 1.5/3-T MRI were included in this retrospective, board-approved study. The shading sign was found in 56 patients, but five cases were excluded due to lack of imaging follow-up or histological correlation. The final sample included 51 women. The type of tumor and the pattern of shading were recorded for each case. Thirty endometriomas and five endometrioid carcinomas were found. The remaining 16 cases corresponded to other benign and malignant tumors. The overall sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were 73%, 93%, 59%, and 96%, respectively. Restricting the analysis to cystic lesions without solid or fat component, sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value were 73%, 96%, 94%, and 80%. Five shading patterns were identified: layering (15.7%), liquid-liquid level (11.8%), homogenous (45.1%), heterogeneous (11.8%), and focal/multifocal shading within a complex mass (19.6%). No significant correlation was found between these patterns and the type of tumor. The shading sign is not exclusive of endometriomas or endometrioid tumors. Homogenous shading was the most prevalent pattern in endometriomas and half of the cases with focal/multifocal shading within a complex mass were endometrioid carcinomas.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

My Sisters the Saints: a Spiritual Memoir : uma tradução comentada

Dissertação de Mestrado, Tradução e Assessoria Linguística, 12 de Setembro de 2016, Universidade dos Açores.Integrada no domínio dos estudos de tradução, esta dissertação de mestrado consiste numa tradução comentada dos dois capítulos iniciais da obra My Sisters the Saints: a Spiritual Memoir, de Colleen Carroll Campbell. A partir deste trabalho teórico-prático, haverá lugar a uma reflexão sobre as caraterísticas particulares da tradução literária, da tradução cultural e da tradução sacro-religiosa, enquanto os campos de estudo e de análise prática mais pertinentes face à essência desta obra. Será dada uma maior ênfase à tradução sacro-religiosa, pelo facto de as referências religiosas assumirem um papel preponderante no texto de partida, bem como pela especificidade das questões de tradução que estas levantam.ABSTRACT: As part of the researching field of Translation Studies, this Master’s dissertation consists on translating and commenting the first two chapters of My Sisters the Saints: a Spiritual Memoir, written by Colleen Carroll Campbell. From both theory and practice, attention will be given to the main characteristics of literary translation, cultural translation and religious translation, as the most relevant to the study and practical analysis of this book in particular. The emphasis shall be put on religious translation, not only due to the fact that religious references assume a major role in the source text, but also to the specific translating issues they bring out

Study of non-conventional Aspergilli and Penicillia Ochratoxin A producers

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019The continuous growth of the population is pushing the available natural resources to the limit, posing a threat to the balance of the planet. This increase in population means that more food is needed. Consequently, food safety is, nowadays, a matter of interest to the scientific community and world leaders. However, problems related to food/feed contamination have been frequently reported, including those related to fungi. Fungi are diverse, ubiquitous and their role and impact in food security is now an urgent concern. One thing that makes fungi so dangerous is their ability to resist the treatments during the food making process and their ability to produce harmful secondary metabolites like mycotoxins. Mycotoxins are fungal secondary metabolites that can cause severe health issues in either humans or domesticated animals when ingested, inhaled and/or absorbed. From all the mycotoxins reported, some are more studied due to the higher health risks. Ochratoxin A (OTA) is among those and is present in several food/feed products. Aspergillus and Penicillium species are commonly associated with food spoilage and both genera contain species that can produce this toxin. The major OTA producers are P. verrucosum, P. nordicum and A. carbonarius, but more than 20 species of Aspergillus can produce this toxin. However, recent studies reported the presence of OTA in food matrices where known OTA producers are not present. This triggered the scientists involved to try to find the origin of OTA. Based on previous evidence other species like P. crustosum and A. fumigatus are now being considered. Therefore, the main goal of this work was to search for potential OTA producers among P. crustosum and A. fumigatus strains, with different geographic origins, and try to find potential genetic differences at the sub-species level. A set of 28 Penicillium crustosum strains and 7 Aspergillus fumigatus strains, kindly supplied by Micoteca da Universidade do Minho (MUM), and 16 Penicillium crustosum strains, by Colección Chilena de Cultivos Tipo (CCCT), were studied. The Penicillium isolates are from four different countries: 16 from Italy, 16 from Chile, 6 from Portugal and 4 from Tunisia. The Aspergillus strains are all from Portugal, Spain or with unknown origin. Mycotoxin production was analysed by HPLC-FLD and results were compared with a standard sample. In addition, genes associated with OTA production [two ochratoxin polyketide synthase (Penicillium and Aspergillus related), ochratoxin non-ribosomal peptide synthetase and an ochratoxin transport protein] were tested. RAPD-PCR fingerprinting [M13 and (GACA)4] and beta-tubulin gene (BenA) sequencing were used to perform a wide molecular characterisation. Under the studied conditions, and with a HPLC-FLD detection limit of 7.6 ng/ml, preliminary results showed that OTA was not detected for all studied strains. However, regarding the genes associated with OTA production, there were 4 positive strains of P. crustosum for the 3 genes. Genetic differences, based on RAPD fingerprints, between P. crustosum isolates were found allowing the clustering of strains from the same geographic region, except for isolates from Europe. The low number of A. fumigatus strains did not allowed to draw conclusions, although they also presented genetic differences. Sequencing with BenA did not revealed any SNPs. Nevertheless, further studies with a broader array of conditions needs to be considered.O crescimento exponencial da população mundial está a levar ao limite os recursos naturais disponíveis representando um risco para o equilíbrio do planeta. O aumento da população tem como consequência o aumento da necessidade de mais alimentos. Consequentemente, a segurança alimentar é, hoje em dia, uma preocupação para a comunidade científica e para os líderes mundiais. Contudo, problemas relacionados com comida e rações animais contaminadas têm sido frequentemente reportados, incluindo aqueles com fungos. Os fungos são um grupo de organismos eucarióticos, diversos, ubíquos e têm um grande impacto na segurança alimentar. A capacidade de os fungos resistirem aos processos da indústria alimentar, como tratamentos térmicos, e a sua capacidade de produzirem metabolitos secundários prejudiciais, torna-os perigosos contaminantes. Um exemplo desses metabolitos produzidos são as micotoxinas. As micotoxinas quando ingeridas, inaladas e/ou absorvidas podem causar problemas severos de saúde a pessoas e animais. A preocupação com este assunto iniciou-se aquando da morte de cerca de 10000 perus no reino unido, que se deveu a uma contaminação com aflatoxinas. Aspergillus e Penicillium são dois grupos de fungos filamentosos que têm um grande impacto na contaminação alimentar particularmente pela capacidade de produzirem micotoxinas. As micotoxinas mais associadas a estes géneros são aflatoxinas, ocratoxina A, patulina e citrinina. A maior preocupação com estas toxinas é a sua toxicidade aguda e/ou crónica, que pode levar à morte ou a outras patologias. A maioria das micotoxinas são estáveis, resistentes ao calor e podem permanecer mesmo em produtos tratados (por exemplo, produtos pasteurizados). De todas as micotoxinas, a ocratoxina A (OTA) é uma das mais estudadas, devido à sua presença em vários produtos alimentares e também pelos problemas de saúde que pode causar. A OTA foi descoberta em 1965 no Aspergillus ochraceus. É considerada neurotóxica, nefrotóxica, carcinogénica, hepatotóxica e teratogénica, para diversas espécies. Está classificada com o grupo 2B - possivelmente carcinogénica para humanos. Está presente em diversos produtos alimentares como cereais, vinho, queijo e café. De entre os cereais, o centeio, o trigo e a cevada são os que apresentam os maiores níveis de contaminação. Isto representa um problema pois estes cereais são muito usados no fabrico de farinhas e rações destinadas à alimentação de animais. Consequentemente, os animais domésticos são os mais suscetíveis a ter reações adversas devido à presença da toxina, uma vez que estão expostas a ela por mais tempo e com maior frequência. Os maiores produtores de OTA são P. verrucosum, P. nordicum e A. carbonarius, no entanto cerca de mais 20 espécies de Aspergillus são capazes de a sintetizar. A identificação e a quantificação da OTA são comummente feitas por cromatografia líquida de alta eficiência com um detetor de fluorescência (HPLC-FLD). Além disso há genes que estão associados com a ocratoxina A e que podem ser usados como possíveis marcadores genéticos da capacidade de um fungo a produzir. Recentemente, um estudo identificou a presença de OTA em diversas amostras de queijos Italianos. Contudo, não foi possível identificar nenhum dos conhecidos produtores da toxina. Assim, surgiu a dúvida de qual seria a origem da OTA. Baseados em estudos anteriores, P. crustosum e A. fumigatus estão a ser considerados como possíveis novos produtores. Estes fungos são ubíquos e são diversas vezes encontrados em produtos alimentares. São produtores de toxinas, mas apenas foram descritos uma (A. fumigatus) ou duas (P. crustosum) vezes como produtores de OTA. O objetivo principal deste trabalho é procurar potenciais produtores de OTA entre um conjunto de estirpes de P. crustosum e de A. fumigatus (com diferentes origens geográficas) e tentar encontrar potenciais diferenças ao nível da subespécie. Um conjunto de 28 estirpes de P. crustosum e 7 estirpes de A. fumigatus fornecidas pela Micoteca da Universidade do Minho (MUM), e 16 estirpes de P. crustosum, fornecidas pela Colección Chilena de Cultivos Tipo (CCCT), foram estudadas. Os isolados de Penicillium provieram de quatro países e matrizes diferentes: 16 foram isolados de queijos italianos, 16 de merkén do Chile, 6 de diferentes origens em Portugal e 4 de maçãs da Tunísia. As estirpes de Aspergillus são, na sua maioria, de Portugal ou Espanha, no entanto algumas têm origem desconhecida. A produção de ocratoxina A foi avaliada por HPLC-FLD e os resultados foram comparados com um padrão de concentração conhecida. As estirpes de P. crustosum foram cultivadas em meio enriquecido com sal de forma a terem um stress externo que conduza à produção de micotoxinas. Genes relacionados com a produção de OTA (PKS, NRPS e um transportador) foram também procurados. Adicionalmente foi feito um estudo genético complementar. Apesar de todas as estirpes terem origem em coleções de culturas, o que à partida valida a sua identificação, o gene da beta tubulina foi amplificado. Uma vez que o estudo envolve uma panóplia de estirpes da mesma espécie, principalmente em P. crustosum, com origens geográficas diferentes, há uma possibilidade de nessas estirpes terem ocorrido processos de especiação e haver espécies crípticas por revelar. Espécies crípticas são espécies que são morfologicamente idênticas, no entanto apresentam diferenças genéticas. Para complementar este estudo foram feitas análises de perfis genómicos (fingerprinting) usando pequenos primers: M13 e (GACA)4. Nas condições testadas, tendo a HPLC um limite de deteção de 7,6 ng/ml, os resultados preliminares mostraram que não se detetou produção de OTA para nenhuma das 51 estirpes. Os cromatogramas obtidos de cada estirpe foram comparados com o cromatograma padrão, onde foi possível observar um pico aos 13 min. No entanto, em relação aos genes relacionados com a biossíntese de OTA os resultados foram mais promissores, exceto para o gene relacionado com a produção de OTA em Aspergillus (Acpks). Para esse gene apenas o controlo positivo foi amplificado e não em nenhuma das estirpes em estudo. Os restantes genes estavam relacionados com Penicillium [otapks (≈500 bp); otanps (≈700bp) e otatra (≈420 bp)]. Para estes genes, 8% estirpes amplificaram todos os genes (sendo todas do Chile), 16% amplificaram somente otapks; 10% otapks e otatra, 8% otanps e otatra; 45% apenas otatra; e 14% não amplificaram nenhum gene. O facto de haver espécies a amplificarem os três genes testados é um indicador que estas podem ter a capacidade de produzir OTA. Além disso a grande diversidade de padrões verificados mostra que as estirpes são distintas entre si. O estudo com os primers de fingerprinting de onde se obtiveram perfis genéticos e com os quais foram construídos dendrogramas mostraram a mesma distinção. Diferentes padrões foram obtidos podendo individualizar cada indivíduo. Além disso, fazendo uma análise aos dendrogramas foi possível verificar que as estirpes chilenas formam um cluster assim como as estirpes da Tunísia. Isto pode demonstrar que a distância geográfica poderá criar processos de especiação. Por outro lado, as estirpes Italianas e Portuguesas não formam nenhum cluster. Estes dois países encontram-se na Europa onde não há muitas restrições de fronteiras. Em relação a A. fumigatus, o baixo número de estirpes, e a falta de informação de algumas delas, não permitiu a formação de clusters, apenas se verificando que também apresentam perfis diferentes. Este foi um estudo preliminar em que não foi possível a quantificação de OTA nem em P. crustosum nem em A. fumigatus. No entanto, os resultados dos genes biossintéticos mostram que algumas das estirpes podem ter a capacidade de a produzir. Também foi possível verificar que RAPD é uma boa técnica de tipificação e que espécies afastadas geograficamente apresentam perfis genéticos diferentes. Não obstante, estudos com métodos adicionais e com diferentes condições precisam ser considerados