Phenotypic Prediction: Linking in vitro Virulence to the Genomics of 59 Salmonella enterica Strains

The increased availability of whole-genome-sequencing techniques generates a wealth of DNA data on numerous organisms, including foodborne pathogens such as Salmonella. However, how these data can be used to improve microbial risk assessment and understanding of Salmonella epidemiology remains a challenge. The aim of this study was to assess variability in in vitro virulence and genetic characteristics between and within different serovars. The phenotypic behavior of 59 strains of 32 different Salmonella enterica serovars from animal, human and food origin was assessed in an in vitro gastro-intestinal tract (GIT) system and they were analyzed for the presence of 233 putative virulence genes as markers for phenotypic prediction. The probability of in vitro infection, P(inf), defined as the fraction of infectious cells passing from inoculation to host cell invasion at the last stage of the GIT system, was interpreted as the in vitro virulence. Results showed that the (average) P(inf) of Salmonella serovars ranged from 5.3E-05 (S. Kedougou) to 5.2E-01 (S. Typhimurium). In general, a higher P(inf) on serovar level corresponded to higher reported human incidence from epidemiological reporting data. Of the 233 virulence genes investigated, only 101 showed variability in presence/absence among the strains. In vitro P(inf) was found to be positively associated with the presence of specific plasmid related virulence genes (mig-5, pef, rck, and spv). However, not all serovars with a relatively high P(inf), > 1E-02, could be linked with these specific genes. Moreover, some outbreak related strains (S. Heidelberg and S. Thompson) did not reveal this association with P(inf). No clear association with in vitro virulence P(inf) was identified when grouping serovars with the same virulence gene profile (virulence plasmid, Typhoid toxin, peg operon and stk operon). This study shows that the in vitro P(inf) variation among individual strains from the same serovar is larger than that found between serovars. Therefore, ranking P(inf) of S. enterica on serovar level alone, or in combination with a serovar specific virulence gene profile, cannot be recommended. The attribution of single biological phenomena to individual strains or serovars is not sufficient to improve the hazard characterization for S. enterica. Future microbial risk assessments, including virulence gene profiles, require a systematic approach linked to epidemiological studies rather than revealing differences in characteristics on serovar level alone

Assessing phenotypic virulence of Salmonella enterica across serovars and sources

INTRODUCTION: Whole genome sequencing (WGS) is increasingly used for characterizing foodborne pathogens and it has become a standard typing technique for surveillance and research purposes. WGS data can help assessing microbial risks and defining risk mitigating strategies for foodborne pathogens, including Salmonella enterica. METHODS: To test the hypothesis that (combinations of) different genes can predict the probability of infection [P(inf)] given exposure to a certain pathogen strain, we determined P(inf) based on invasion potential of 87 S. enterica strains belonging to 15 serovars isolated from animals, foodstuffs and human patients, in an in vitro gastrointestinal tract (GIT) model system. These genomes were sequenced with WGS and screened for genes potentially involved in virulence. A random forest (RF) model was applied to assess whether P(inf) of a strain could be predicted based on the presence/absence of those genes. Moreover, the association between P(inf) and biofilm formation in different experimental conditions was assessed. RESULTS AND DISCUSSION: P(inf) values ranged from 6.7E-05 to 5.2E-01, showing variability both among and within serovars. P(inf) values also varied between isolation sources, but no unambiguous pattern was observed in the tested serovars. Interestingly, serovars causing the highest number of human infections did not show better ability to invade cells in the GIT model system, with strains belonging to other serovars displaying even higher infectivity. The RF model did not identify any virulence factor as significant P(inf) predictors. Significant associations of P(inf) with biofilm formation were found in all the different conditions for a limited number of serovars, indicating that the two phenotypes are governed by different mechanisms and that the ability to form biofilm does not correlate with the ability to invade epithelial cells. Other omics techniques therefore seem more promising as alternatives to identify genes associated with P(inf), and different hypotheses, such as gene expression rather than presence/absence, could be tested to explain phenotypic virulence [P(inf)]

The effect of irradiation on spoilage organisms and shelf-life of bami and nasi goreng

Het doorstralen met 2,5 kGy resulteerde zowel met bami goreng als met nasi goreng in een reductie van het aeroob kiemgetal met 5 logeenheden. De Gram-negatieve flora nam sterker af dan de Gram-positieve. De overlevende flora bestond vooral uit Gram-positieve coccen. Tijdens bewaren bij 7 graden C nam het aeroob kiemgetal van doorstraalde nasi goreng niet, en van doorstraalde bami goreng slechts zeer langzaam toe. Er wordt geconcludeerd dat doorstraling leidt tot een verlenging van de houdbaarheid van bami en nasi.Abstract not availableHI

Genotypische stabiliteit van Campylobactr jejuni onder gecontroleerde kweekcondities

Campylobacter (C.) jejuni is de meest frequente veroorzaker van gastro-enteritis in Nederland. Onderzoek met verschillende genetische typeringstechnieken laat zien dat er zeer veel campylobactertypen bestaan. Pluimvee wordt beschouwd als een belangrijke bron van C. jejuni, maar veel van de stammen die worden ge6soleerd uit pluimvee worden niet teruggevonden in de humane populatie, terwijl van de stammen die zijn ge6soleerd uit humane pati6nten slechts 30% wordt teruggevonden bij pluimvee. Hieraan kunnen verschillende oorzaken ten grondslag liggen: (1) Mogelijk bestaan er nog andere bronnen van C. jejuni. Risicofactoren voor het oplopen van een infectie met Campylobacter zijn het houden van (jonge) huisdieren en het drinken van ongepasteuriseerde melk. Opvallend genoeg wordt het eten van kip niet altijd als risicofactor gezien; (2) Groei van campylobacters lijkt beperkt te zijn tot het maagdarmstelsel van warmbloedig dieren. Onder omstandigheden waar groei niet mogelijk is, blijft Campylobacter weliswaar vitaal, maar neemt de kweekbaarheid, en daarmee de aantoonbaarheid, af. Mogelijk is Campylobacter in deze vitale, maar niet meer kweekbare vorm toch nog in staat om een infectie te veroorzaken; (3) Pluimvee is besmet met verschillende typen C. jejuni waarvan er een of enkele domineren en dus worden aangetoond. Bij een voedselinfectie worden alle typen overgedragen, maar omdat in de mens andere typen gaan domineren, worden in de mens ook andere typen aangetoond; (4) Mogelijk treden er veranderingen op in het genotype van Campylobacter, waardoor het slechts lijkt alsof er sprake is van niet-verwante typen. In deze studie is C. jejuni gedurende 150 generaties gekweekt onder gecontroleerde omstandigheden en is van op geregelde tijdstippen genomen monsters met behulp van verschillende genetische technieken het genotype bepaald. Er zijn in deze periode en onder de gebruikte omstandigheden geen veranderingen in genotype waargenomen.Campylobacter (C.) jejuni is identified as the major cause of bacterial gastro-enteritis in the Netherlands. Although poultry is considered as the main source of C. jejuni, many strains found in poultry (identified by various genotyping techniques) cannot be traced in the human population and in the Netherlands, of all human isolates, only 30% has been detected in poultry. Variations in genotype due to mutations or exchange of DNA might underlie these observations. This study was undertaken to monitor changes in genotype of C. jejuni. We cultured C. jejuni for approximately 150 generations in nutrient rich medium in the absence of exchangeable DNA under various microaerobic conditions. Alterations in genotype were studied by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), amplified fragment length polymorphism (AFLP) and the multi locus sequence typing (MLST) technique. No rearrangements, inserts or deletions of large DNA fragments were detected. PFGE and AFLP patterns of cultures at start were indistinguishable from cultures 150 generations later. No mutations were observed in any of the restriction sites and no detectable mutations had occurred in the loci subjected to MLST analysis. In the absence of exchangeable DNA under constant culture conditions the genotype of C. jejuni appeared to be stable.RIV

Ziekte door voedsel besmet met Clostridium perfringens : eindrapport

Mensen die voedsel eten dat de bacterie Clostridium perfringens bevat, kunnen daar diarree van krijgen. Deze bacterie komt vooral voor in producten die vlees bevatten, zoals soepen en stoofschotels, maar ook in kruiden en specerijen. Mensen worden voornamelijk ziek na het eten van vleesbevattende producten die onder verkeerde omstandigheden zijn gekoeld voor opslag. Dat kan ook gebeuren als dit soort voedsel onvoldoende is opgewarmd nadat het is gekoeld. Dit zijn de belangrijkste conclusies uit onderzoek van het RIVM, dat in opdracht van de nieuwe Voedsel en Waren Autoriteit (nVWA) is uitgevoerd. Jaarlijks worden in Nederland ongeveer 160.000 mensen ziek nadat zij voedsel hebben geconsumeerd dat besmet is met de bacterie Clostridium perfringens. De nVWA wil meer inzicht krijgen welke combinaties van het voedseltype en het bereidingsproces tot ziekte kunnen leiden. Als mensen bereid voedsel willen bewaren, wordt aanbevolen het zo snel mogelijk na de bereiding af te laten koelen. Om voedsel voldoende te verhitten wordt aanbevolen een kerntemperatuurmeter te gebruiken. Om zeker te weten dat alle levensvatbare bacterien zijn gedood, kan als richtlijn worden gesteld dat de kern van voedsel minimaal gedurende 10 minuten 65 graden Celcius moet zijn. Het is lastiger te controleren of voedsel voldoende is afgekoeld. Bij onvoldoende verhitten of afkoelen produceert de bacterie in de dunne darm het eiwit enterotoxine Cpe. Dit eiwit komt vrij als de bacterie daar tijdens het verteringsproces overgaat in een spore (een vorm die tegen veel externe factoren, zoals koude en zuren, bestand is). Het eiwit tast het epitheel aan, waardoor ziekteverschijnselen ontstaan.Release of the enterotoxin Cpe by Clostridium perfringens in the small intestine after the consumption of contaminated food may lead to diarrhoea. Potentially pathogenic bacteria seem to occur only in selected food commodities. Moreover, specific food preparation processes seem to be more involved in the onset of disease. These are the main conclusions from research carried out by the RIVM by the order of the new Food and Consumer Product Safety Authority (nVWA). Food contaminated with C. perfringens leads to approximately 160,000 disease cases annually in the Netherlands. The nVWA aims to obtain more insight in the most harmful combination food-commodity - preparation-process with respect to C. perfringens. C. perfringens is frequently isolated from meat-containing food commodities such as soups and stews, and from herbs and spices. A minority of the isolated strains carry the gene encoding the enterotoxin Cpe, and are thus potentially pathogenic. Strains isolated from meat-containing food commodities carry the Cpe-gene more often than strains isolated from herbs and spices. Outbreak investigation reports show that inadequate cooling and/or inadequate reheating is often the main cause for the onset of disease. Most important food commodities involved in outbreaks are meat containing dishes such as soups and stews. Cooling of food is a crucial but also a difficult step to control in the preparation cascade, especially in the private household. Reheating after cooling and before consumption is easier to control. Hence, more elaborate investigations into reheating have been carried out.VW

Characterisation of the acid sensitivity of Salmonella typhimurium phage type DT104

Het aantal gevallen van salmonellosis in Nederland veroorzaakt door Salmonella typhimurium faagtype DT104 is toegenomen van 10 in 1985 tot 163 in 1997 (10% van alle gevallen van salmonellosis). De stam lijkt zijn oorsprong te hebben in het Verenigd Koninkrijk. Daar wordt inmiddels 20% van alle gevallen van salmonellosis veroorzaakt door deze stam. S. typhimurium DT104 is multiresistent en komt voor in veel productiedieren. Het veroorzaakt ernstige ziekteverschijnselen bij koeien en varkens. Humane infecties met dit faagtype lijken ernstigere gevolgen te hebben dan infecties met non-DT104 stammen. De resultaten van een case-control studie in Engeland lieten zien dat een ongewoon hoog percentage van geinfecteerden moest worden opgenomen in een ziekenhuis. Met S. typhimurium DT104 besmet voedsel komt via de mond en maag terecht in de dunne darm. Hier vindt invasie plaats van epitheelcellen. Faagtype DT104 is echter niet invasiever dan andere S. typhimurium. De ernstigere gevolgen van een infectie met deze stam zijn mogelijk het resultaat van een verhoogde resistentie tegen het zure milieu in de maag, waardoor de dosis die uiteindelijk in de dunne darm terecht komt, hoger is, en/of zijn het resultaat van een verhoogde virulentie, als gevolg van een verblijf in de maag. De resultaten in dit rapport laten zien dat isolaten van S. typhimurium DT104 ongevoeliger zijn voor milieus met een lage pH dan andere salmonella's.Reports in the UK on human isolates of Salmonella typhimurium indicate that the number of isolates had increased from 87 in 1989 to over 3600 in 1996. They were all shown to be resistant to at least five antibiotics. In the Netherlands the number of cases of acute gastro-intestinal disease caused by S. typhimurium DT104 increased from 10 in 1985 to 163 in 1997. S. typhimurium DT104 is present in all types of animals used for production. It causes severe disease in cattle and pigs. Human infections due to this foodborne type of salmonella seem to be more severe than infections due to other types of S. typhimurium. Following oral ingestion and passage through the stomach, S. typhimurium invades epithelial cells of the small intestine. S. typhimurium DT104, however, is not shown to be more invasive than other salmonellas. The more severe symptoms associated with an infection with S. typhimurium DT104 might be dose-related. If S. typhimurium DT104 is shown to be more acid-resistant, the number of cells surviving the stomach is higher. The results presented in this report clearly show that some isolates of Salmonella typhimurium phage type DT104 are resistant to low-pH environments.IGW

Characterisation of the acid sensitivity of Salmonella typhimurium phage type DT104

Reports in the UK on human isolates of Salmonella typhimurium indicate that the number of isolates had increased from 87 in 1989 to over 3600 in 1996. They were all shown to be resistant to at least five antibiotics. In the Netherlands the number of cases of acute gastro-intestinal disease caused by S. typhimurium DT104 increased from 10 in 1985 to 163 in 1997. S. typhimurium DT104 is present in all types of animals used for production. It causes severe disease in cattle and pigs. Human infections due to this foodborne type of salmonella seem to be more severe than infections due to other types of S. typhimurium. Following oral ingestion and passage through the stomach, S. typhimurium invades epithelial cells of the small intestine. S. typhimurium DT104, however, is not shown to be more invasive than other salmonellas. The more severe symptoms associated with an infection with S. typhimurium DT104 might be dose-related. If S. typhimurium DT104 is shown to be more acid-resistant, the number of cells surviving the stomach is higher. The results presented in this report clearly show that some isolates of Salmonella typhimurium phage type DT104 are resistant to low-pH environments.Het aantal gevallen van salmonellosis in Nederland veroorzaakt door Salmonella typhimurium faagtype DT104 is toegenomen van 10 in 1985 tot 163 in 1997 (10% van alle gevallen van salmonellosis). De stam lijkt zijn oorsprong te hebben in het Verenigd Koninkrijk. Daar wordt inmiddels 20% van alle gevallen van salmonellosis veroorzaakt door deze stam. S. typhimurium DT104 is multiresistent en komt voor in veel productiedieren. Het veroorzaakt ernstige ziekteverschijnselen bij koeien en varkens. Humane infecties met dit faagtype lijken ernstigere gevolgen te hebben dan infecties met non-DT104 stammen. De resultaten van een case-control studie in Engeland lieten zien dat een ongewoon hoog percentage van geinfecteerden moest worden opgenomen in een ziekenhuis. Met S. typhimurium DT104 besmet voedsel komt via de mond en maag terecht in de dunne darm. Hier vindt invasie plaats van epitheelcellen. Faagtype DT104 is echter niet invasiever dan andere S. typhimurium. De ernstigere gevolgen van een infectie met deze stam zijn mogelijk het resultaat van een verhoogde resistentie tegen het zure milieu in de maag, waardoor de dosis die uiteindelijk in de dunne darm terecht komt, hoger is, en/of zijn het resultaat van een verhoogde virulentie, als gevolg van een verblijf in de maag. De resultaten in dit rapport laten zien dat isolaten van S. typhimurium DT104 ongevoeliger zijn voor milieus met een lage pH dan andere salmonella's

Quantification of Salmonella Survival and Infection in an In vitro Model of the Human Intestinal Tract as Proxy for Foodborne Pathogens.

Different techniques are available for assessing differences in virulence of bacterial foodborne pathogens. The use of animal models or human volunteers is not expedient for various reasons; the use of epidemiological data is often hampered by lack of crucial data. In this paper, we describe a static, sequential gastrointestinal tract (GIT) model system in which foodborne pathogens are exposed to simulated gastric and intestinal contents of the human digestive tract, including the interaction of pathogens with the intestinal epithelium. The system can be employed with any foodborne bacterial pathogens. Five strains of Salmonella Heidelberg and one strain of Salmonella Typhimurium were used to assess the robustness of the system. Four S. Heidelberg strains originated from an outbreak, the fifth S. Heidelberg strain and the S. Typhimurium strain originated from routine meat inspections. Data from plate counts, collected for determining the numbers of surviving bacteria in each stage, were used to quantify both the experimental uncertainty and biological variability of pathogen survival throughout the system. For this, a hierarchical Bayesian framework using Markov chain Monte Carlo (MCMC) was employed. The model system is able to distinguish serovars/strains for in vitro infectivity when accounting for within strain biological variability and experimental uncertainty

Phenotypic Prediction: Linking Virulence to the Genomics of 59 Strains.

The increased availability of whole-genome-sequencing techniques generates a wealth of DNA data on numerous organisms, including foodborne pathogens such a