Unveiling the catalytic mechanism of a processive metalloaminopeptidase

Funding: C.M.C. is funded by the Wellcome Trust (210486/Z/18/Z and [204821/Z/16/Z] to the University of StAndrews). M.C.S.is funded by a PhD studentship from the University of St Andrews. B.E.B. acknowledges equipment funding by BBSRC (BB/R013780/1).Intracellular leucine aminopeptidases (PepA) are metalloproteases from the family M17. These enzymes catalyze peptide bond cleavage, removing N-terminal residues from peptide and protein substrates, with consequences for protein homeostasis and quality control. While general mechanistic studies using model substrates have been conducted on PepA enzymes from various organisms, specific information about their substrate preferences and promiscuity, choice of metal, activation mechanisms, and the steps that limit steady-state turnover remain unexplored. Here, we dissected the catalytic and chemical mechanisms of PaPepA: a leucine aminopeptidase from Pseudomonas aeruginosa. Cleavage assays using peptides and small-molecule substrate mimics allowed us to propose a mechanism for catalysis. Steady-state and pre-steady-state kinetics, pH rate profiles, solvent kinetic isotope effects, and biophysical techniques were used to evaluate metal binding and activation. This revealed that metal binding to a tight affinity site is insufficient for enzyme activity; binding to a weaker affinity site is essential for catalysis. Progress curves for peptide hydrolysis and crystal structures of free and inhibitor-bound PaPepA revealed that PaPepA cleaves peptide substrates in a processive manner. We propose three distinct modes for activity regulation: tight packing of PaPepA in a hexameric assembly controls substrate length and reaction processivity; the product leucine acts as an inhibitor, and the high concentration of metal ions required for activation limits catalytic turnover. Our work uncovers catalysis by a metalloaminopeptidase, revealing the intricacies of metal activation and substrate selection. This will pave the way for a deeper understanding of metalloenzymes and processive peptidases/proteases.Publisher PDFPeer reviewe

Considerações para implementação de ferramentas multiplataforma para monitramento de sistemas virtualizados

A virtualização através do uso de máquinas virtuais sobre máquinas físicas, para executar diferentes sistemas em diferentes domínios de aplicação tem sido uma abordagem comumente adotada em diferentes contextos. A possibilidade de se abstrair plataformas, infraestrutura ou software como um serviço passou a ser uma técnica válida para executar sistemas usando Computação na Nuvem (Cloud Computing) onde a virtualização é uma das principais tecnologias para efetivar sua utilização. O uso de ambientes virtualizados é determinante, entretanto, em muitos casos, estas tecnologias são escolhidas sem levar em conta o desempenho ou outros atributos não funcionais, tais como a garantia de qualidade de serviço (QoS), resiliência, confiabilidade, tolerância a falhas e escalabilidade, para citar algumas. O objetivo deste trabalho foca nas considerações principais para concepção de uma ferramenta completa de monitoramento e inspeção de sistemas virtualizados. A ideia é poder estimar as melhores configurações de software e hardware para plataformas virtualizadas sem que ocorra degradação de desempenho. Para demonstrar a efetividade da técnica foi implementada como exemplo uma ferramenta de propósito específico de monitoramento chamada VM-MON, descrita no presente trabalho

Solução numérica de descritores markovianos a partir de re-estruturações de termos tensoriais

Os formalismos estruturados foram definidos ao longo dos anos com o objetivo de aumentar o nível de abstração e oferecer uma alternativa de modelagem mais sofisticada do que a proporcionada pelas tradicionais Cadeias de Markov. Exemplos de formalismos estruturados que utilizam álgebra tensorial para o armazenamento de seus descritores são as Redes de Autômatos Estocásticos, as Redes de Petri Estocásticas Generalizadas Superpostas e as Álgebras de Processo. Tais descrições utilizam primitivas de modelagem entre seus componentes capturando sua semântica operacional e permitindo a sua análise ao retornarem índices quantitativos de desempenho quando são resolvidos numericamente. Os mecanismos atuais de solução usam propriedades da Álgebra Tensorial (clássica ou generalizada) para multiplicar termos tensoriais de eventos entre os estados dos modelos (i. e. , um descritor Markoviano) por um vetor de probabilidade, que contém a solução estacionária ou transiente. Esta operação é chamada de Multiplicação Vetor-Descritor (MVD) e é realizada de três maneiras básicas: de forma esparsa (ineficiente em memória, eficiente em tempo), utilizando o Algoritmo Shuffle (eficiente em memória, ineficiente em tempo para algumas classes de modelos) ou através do Algoritmo Split, que é uma combinação das duas primeiras abordagens. A principal contribuição deste último foi a proposição de um método híbrido onde incrementa-se a memória (de forma razoável) para acelerar o cálculo efetuado por iteração. Entretanto, o principal desafio do Algoritmo Split é relativo à determinação de cortes de cada termo tensorial e em como re-estruturá-lo para reduzir o custo computacional por iteração, acelerando a convergência de modelos estruturados.Este trabalho aborda estes problemas, baseando-se em três eixos: i) na discussão das primitivas de modelagem para composição de sistemas através de formas mais abstratas de descrição, ii) nas diferentes formas de tratamento de termos tensoriais de descritores Markovianos para execução mais otimizada da MVD a partir de re-estruturações das ordens originais, e iii) na execução do Algoritmo Split com taxas constantes ou funcionais demonstrando os resultados obtidos para diversas classes de modelos. Para os casos observados, foi demonstrado através de experimentos que o melhor ganho, balanceando-se tempo e memória, é verificado quando as matrizes dos termos tensoriais são reordenadas, tratando as do tipo identidade na parte estruturada e avaliando-se os elementos funcionais uma única vez na parte esparsa. Ao avaliar as funções somente uma vez em todo o processo de MVD, converte-se os descritores generalizados para clássicos em tempo de execução e promove-se ganhos consideráveis em tempo para determinadas classes de modelos. Observou-se também que as atividades de sincronização ou comunicação entre os módulos ou partições envolvidas bem como o total de parâmetros das dependências funcionais realizam um papel crucial no desempenho obtido. A presente tese é finalizada identificando as classes de modelos mais adequadas para a utilização do Algoritmo Split, propondo formas de re-estruturação de descritores Markovianos que privilegiem a esparsidade e a existência de matrizes do tipo identidade para balancear os custos em memória e tempo de execução.Several formalisms have been defined throughout the years aiming the enhancement of the abstraction level which offer a more sophisticated modeling alternative than traditional Markov Chains. Examples of formalisms that use tensor algebra for descriptor storage are Stochastic Automata Networks, Superposed Generalized Stochastic Petri Nets, and Process Algebras. These descriptions employ modeling primitives among their components by capturing their operational semantics, and allow analysis by returning quantitative performance indexes when subjected to numerical solution. Solution mechanisms use both classic and generalized Tensor Algebra properties to multiply tensor terms of events among the states of the models (i. e. , a Markovian descriptor) by a probability vector, using stationary or transient measurements. This operation is called Vector-Descriptor Multiplication (VDM), and can be performed by three different methods: sparsely (memory inefficient, time efficient), using the Shuffle Algorithm (memory efficient, time inefficient, depending on the model) or through the Split Algorithm, a combination between the two former approaches. The main contribution of the Split approach was the proposition of a hybrid method where memory increments (in a reasonable fashion) are used to accelerate the calculations per iteration. On the other hand, the main challenge of the Split Algorithm is the determination of each division point (e. g. the cut parameter), and how the tensor terms must be restructured to reduce computational costs per iteration, allowing quicker convergence for structured models.The present work addresses these problems in three distinct ways: i) by discussing the modeling primitives for system composition through more abstract ways of description, ii) by treating each tensor term of Markovian descriptors in different manners for more optimized VDM solution restructuring the original orders, iii) by executing the Algorithm Split having both constant or functional rates, demonstrating the results for a variety of models. The experiments discussed here demonstrate that the best gain considering time and memory is verified when the matrices of the tensor terms are reordered, treating the identity ones in the structured part and evaluating functional elements just once in the sparse part. When the functions were evaluated only once in all VDM process, a conversion of generalized to classic descriptor took place in execution time, with considerable gain in time for some classes of models. In addition, it was observed that synchronization or communication activities between each module or system partition and the total number of functional parameters play a crucial role in the overall performance. The present thesis is finalized with the identification of the most suitable class of models for the utilization of the Split Algorithm, and the proposition of a restructuration of Markovian that privileges sparsity and identity matrices to balance memory costs and execution time

Unveiling the catalytic mechanism of a processive metalloaminopeptidase

Intracellular leucine aminopeptidases (PepA) are metalloproteases from the family M17. These enzymes catalyze peptide bond cleavage, removing N-terminal residues from peptide and protein substrates, with consequences for protein homeostasis and quality control. While general mechanistic studies using model substrates have been conducted on PepA enzymes from various organisms, specific information about their substrate preferences and promiscuity, choice of metal, activation mechanisms, and the steps that limit steady-state turnover remain unexplored. Here, we dissected the catalytic and chemical mechanisms of PaPepA: a leucine aminopeptidase from Pseudomonas aeruginosa. Cleavage assays using peptides and small-molecule substrate mimics allowed us to propose a mechanism for catalysis. Steady-state and pre-steady-state kinetics, pH rate profiles, solvent kinetic isotope effects, and biophysical techniques were used to evaluate metal binding and activation. This revealed that metal binding to a tight affinity site is insufficient for enzyme activity; binding to a weaker affinity site is essential for catalysis. Progress curves for peptide hydrolysis and crystal structures of free and inhibitor-bound PaPepA revealed that PaPepA cleaves peptide substrates in a processive manner. We propose three distinct modes for activity regulation: tight packing of PaPepA in a hexameric assembly controls substrate length and reaction processivity; the product leucine acts as an inhibitor, and the high concentration of metal ions required for activation limits catalytic turnover. Our work uncovers catalysis by a metalloaminopeptidase, revealing the intricacies of metal activation and substrate selection. This will pave the way for a deeper understanding of metalloenzymes and processive peptidases/proteases