Bioprivileged Fluorinated Ionic Liquids in the Purification of Proteins: Towards Enhanced Tunability of Aqueous Biphasic Systems

Proteins are high value biomolecules with application in several fields, therefore the study of novel extraction methods using more biocompatible techniques is in large extent. Aqueous Biphasic Systems are increasingly being studied for that purpose, due to presenting two aqueous phases, usually protein-friendly. Fluorinated Ionic Liquids (FILs) are an emerging category of Ionic Liquids due to their unique properties, namely self-aggregation behavior, and already showing protein benign behavior. In this work, Lysozyme was used as model protein, and used to be partitioned by systems composed by IL and FIL, besides several salting-out agents, specifically inorganic salt, carbohydrates and a dihydrogen phosphate choline ([N1112OH][H2PO4]). These studies revealed favored partition to FIL-aqueous rich phase comparing with IL-rich phase. Lysozyme activity was tested for each component and after partition protocol, and maintained for most cases. Turbidimetry was used to infer the presence of some interactions between the protein and some systems elements; Tryptophan Intrinsic Fluorescence studies were carried to verify some conformation changes in the presence of IL, FIL and N1112OH][H2PO4]. Then, nano-Differential Scanning Calorimetry (nano-DSC) was used to confer the maintenance of thermal stability of Lysozyme, and determination of melting temperature (Tm). These studies have revealed the presence of some interaction between IL/FIL and protein, besides different conformational changes in Lysozyme provoked by these compounds compared to reference. Also, was observed a decrease on Tm with increasing IL and FIL concentration, however at partition conditions, FIL presented more Tm conservation than IL. This work permitted a higher insight on FIL application in ABS for protein extraction, and reveled their promising assets for this end; however more studies relatively to Lysozyme structure and thermodynamic parameters in the presence of IL/FIL are needed.As proteínas são biomoléculas de elevado valor e aplicabilidade em diversas áres, desta forma o estudo de novas formas para a sua extração usado metodologias mais biocompatíveis é cada vez mais aprofundado. Os Sistemas Aquosos Bifásicos são cada vez mais estudados para este efeito, por apresentarem duas fases aquosas, tornando-os sistemas de extração mais biocompatíveis. Os Líquidos Iónicos Fluorados (FIL) são uma categoria de Líquidos Iónicos (IL) emergente devido às suas características únicas, nomeadamente a sua capacidade de fazerem “self-aggregations” e demonstrarem propriedades compatíveis com as proteínas. Neste trabalho, a Lisozima foi usada como modelo e usada para estudo da partição em sistemas aquosos bifásicos compostos por IL, para além de uma variedade de agentes de “salting-out”, especificamente sais inorgânicos, carbohidratos e colina dihidrogenofostato ([N1112OH][H2PO4]). Estes estudos revelaram uma partição maioritária para as fases ricas em FIL, em comparação com as fases ricas em IL. A atividade enzimática foi também testada para cada componente e após o procedimento de partição, e mantida para a maioria dos casos. Turbidimetria foi usada para aferir a presença de interações entre a proteína e alguns compostos usados na partição; Fluorescência Intrínseca do Triptofano foi usado para verificar algumas alterações conformacionais na presença de IL, FIL e [N1112OH][H2PO4]. Em seguida, nano-Calorimetria de Varrimento Diferencial (nano-DSC) foi usada para conferir a manutenção da estabilidade térmica da Lisozima provocada por estes componentes e determinação da Temperatura de Fusão (Tm). Estes estudos revelaram a presença de interações entre o IL/FIL e a proteína, para além de diferentes alterações na conformação provocados por estes compostos, comparando com a referência em água. Foi também verificada uma diminuição de Tm com o aumento da concentração de IL e FIL, contudo às condições de partição, o FIL apresentava maior conservação da Tm. Este trabalho permitiu uma maior análise da aplicação de FILs em ABS para extração das proteínas, e revelou características únicas para este fim; contudo são necessários mais estudos relativamente à estrutura da Lisozima e aos parâmetros termodinâmicos na presença de IL e FIL