Octocoral biodiversity in Portugal: a barcoding approach coupling long-range PCR and long-read sequencing to assemble mitochondrial genomes

As florestas de corais de zonas mais profundas ou de águas temperadas são caracterizadas por comunidades de elevada diversidade comummente denominadas por “florestas animais” pois são dominadas por espécies filtradoras não fotossintéticas que formam habitats tridimensionalmente complexos. Octocorallia é uma vasta e diversificada subclasse de antozoários que incluem os corais moles e gorgónias (Alcyonacea), os corais azuis (Helioporacea) e as penas marinhas (Pennatulacea). Estas espécies também apresentam um grande valor ecológico pois atuam como engenheiros do ecossistema com a capacidade de manter um habitat fornecendo abrigo e alimento para várias espécies de peixe, incluindo espécies com elevado interesse para a pesca comercial. Infelizmente os impactos antropogénicos persistem devido ao crescimento populacional exponencial e ao desenvolvimento da indústria global criando uma enorme pressão sobre estes ecossistemas marinhos. Felizmente, o nosso conhecimento tem crescido acerca da gravidade de como os impactos estão a afetar a integridade dos ecossistemas em zonas mais profundas. Tais impactos antropogénicos incluem poluição como derrames de petróleo, acidificação dos oceanos e atividade intensas de pesca. Corais, como as gorgónias, têm um crescimento lento e alta longevidade tornando-os mais vulneráveis a distúrbios no ecossistema pois apresentam uma baixa taxa de recuperação natural. Devido à sua importância ecológica, existe um grande interesse na comunidade científica de desenvolver estudos e implementar medidas de conservação e restauração destes habitats. A perda da biodiversidade, causada por impactos antropogénicos, tem sido um motivo preocupante globalmente. O desenvolvimento de ferramentas genéticas inovadores que facilitam na identificação de espécies, especialmente de espécies que são morfologicamente muito semelhantes, mas geneticamente diferentes, têm vindo a complementar os métodos de monitoração de biodiversidade existentes. A next-generation sequencing (NGS) éuma plataforma recente de sequenciação que fornece elevadas leituras de sequenciação numa única execução, pois fornecem informação rápida e massiva por sequenciação com esforços e custos mínimos em comparação com as técnicas tradicionais de sequenciação de Sanger. Esta técnica promove o aperfeiçoamento e complementação dos métodos tradicionais, mas apresenta algumas limitações. O primeiro indica que a região que é amplificada por PCR e sequenciada está limitada a um tamanho pequeno do genoma mitocondrial total como um fragmento do COI (marcador genético tradicional). O segundo indica que, para alguns grupos de invertebrados, estes marcadores genéticos mitocondriais não possuem polimorfismo suficiente para distinguir espécies próximas. Por fim, o barcoding de ADN requer uma biblioteca de referência completa e com qualidade. Estas bibliotecas contêm dados genéticos que são fundamentais para estudos ecológicos e também são ferramentas valiosas para a avaliação da biodiversidade como “eDNA metabarcoding” que posteriormente podem ser incorporados em estratégias de gestão e conservação. Alguns grupos de corais exigem um sistema de classificação baseado em informação genética que complemente a classificação através de morfológica. A utilização de genomas mitocondriais completos também tem sido uma ferramenta emergente e eficaz em taxonomia e estudos filogenéticos, pois são bastante úteis para avaliar relações filogenéticas ao nível de espécies porque têm uma taxa evolutiva muito mais rápida do que o genoma nuclear. Pois requer mais que um gene, ou preferencialmente, o mitogenoma completo para resolver relações evolutivas entre espécies. O genoma mitocondrial em antozoários, em particular na subclasse Octocorallia, exibe uma taxa de evolução molecular muito lenta em comparação com outros grupos taxonómicos. Como tal, o barcoding de ADN através da sequenciação de apenas um gene mitocondrial (normalmente o tradicional COI) é inadequado para distinguir muitas espécies de corais. A Oxford Nanopore Techniques (ONT) é uma técnica de sequenciação de terceira geração capaz de produzir longas fáceis e rápidas leituras de sequenciação. Uma tecnologia ideal para a construção de mitogenomas devido à sua capacidade de realizar leituras longas e repetitivas de sequenciação com uma contiguidade muito maior que garante a integridade da informação genética e construção completa do mitogenoma. Enquanto que os métodos tradicionais de sequenciação de mitogenomas completo, como o primer-walk (i.e., sequenciação de Sanger) sequenciam apenas um único fragmento de ADN de cada vez a um custo muito mais elevado. Para além disso, os octocorais exibem cinco ordens de genes diferentes em que podem ter arranjos de ordem genética diferentes ou existe um bloco de cinco ou mais genes que foram invertidos, ou seja, a codificação da cadeia é revertida. O objetivo geral desta tese foi desenvolver uma abordagem de sequenciação, construção e anotação de mitogenomas completos de diferentes grupos de corais com aplicação universal e que permita sequenciação em larga escala. O estudo é focado em espécies de octocorais maioritariamente presentes na costa portuguesa e alguns representantes de Scleractinians de Cabo Verde e de Espanha. Como tal, os objetivos específicos foram: 1) desenvolver primers específicos para corais para amplificar o mitogenoma completo usando dados de referências que estão disponíveis publicamente; 2) expandir as bibliotecas de referencia disponíveis através de sequenciação, assembly e anotação dos mitogenomas de espécies que existem em Portugal; 3) confirmar as ordens de genes das espécies-alvo e ver se estão em conformidade com o que foi descrito na literatura; 4) Fazer uma reconstrução filogenética com base nos dados da sequenciação do mitogenoma para inferir a localização filogenética e a afinidade genética das espécies-alvo dentro de Octocorallia, incluindo espécies que não foram identificadas de forma conclusiva com base na morfologia. A abordagem desenvolvida consistiu em desenhar primers universais que permitiram a amplificação do mitogenoma por PCR de longo alcance (produtos de PCR > 8000 pb), seguido de sequenciação com tecnologia de terceira geração, ou seja, dados de “long reads” obtidos com Oxford Nanopore Technologies. Uma vez que o genoma mitocondrial é circular, procurou-se desenhar primers em duas regiões opostas e equidistantes de maneira a amplificar o mitogenoma em duas reações de PCR, uma para cada metade da molécula. Um total de 17 mitogenomas de octocorais foram construídos com sucesso através de de novo assembly. Os mitogenomas circulares codificam 14 genes codificadores de proteínas (Nad1-6, Nad4L, cox1-3, Cytb, mtMutS, Atp6 e Atp8), dois genes de RNA ribossómico (r12S e r16S) e um RNA de transferência (trnM). Das cinco ordens de genes existentes em octocorais, foram sequenciadas espécies que representavam três tipos de organização do mitogenoma: Isidella elongata exibindo a ordem de genes B, Corallium rubrum exibindo a ordem de genes C e as restantes espécies exibiram a ordem de genes A, embora não tenhamos conseguido reconstruir o mitogenoma da Isidella elongata devido a um erro na combinação de primers durante a amplificação. A reconstrução filogenética com base em 16 genes mitocondriais permitiu inferir a localização filogenética e a afinidade genética das espécies-alvo dentro de Octocorallia, incluindo espécies que não foram identificadas de forma conclusiva com base na morfologia. Posicionamos e identificamos, pelo menos ao nível de genérico, todos os 17 mitogenomas reconstruídos na árvore filogenética de Octocorallia e recuperamos três ramos principais que correspondem a estudos filogenéticos anteriores e um ramo que aparenta ser basal ao ramo Holaxonia-Alcyoniina. Esta abordagem com sequenciação de terceira geração com a Oxford Nanopore Technology permitiu a sequenciação de “long-read” fornecendo sequenciação em larga escala de muitas amostras numa única execução de sequenciação. Essa abordagem que inclui PCR de longo alcance e sequenciação de “long-read” poderá ter a desvantagem de introduzir erros durante a amplificação (PCR), mas com elevada cobertura de sequenciação é possível escapar a esta limitação. A amplificação por PCR aumenta o número de cópias do mitogenoma do extrato de ADN purificado em multiplex juntamente com várias amostras agrupadas com barcoding. Esse processo reduz a proporção de ADN genómico (não mitocondrial) nos extratos de ADN e permite sequenciar de uma maneira bastante mais direcionada no qual permite agrupar várias amostras na mesmo processo de sequenciação. Esta abordagem possibilitou construir bibliotecas de referência completas cobrindo todos os mitogenomas, no qual melhorou assim as bibliotecas de referência disponíveis que posteriormente poderão auxiliar na avaliação da biodiversidade de corais com base no metabarcoding de eDNA (ADN ambiental). Mas o mais importante foi que esta abordagem pode ser altamente aplicável para sequenciar o mitogenoma completo de amostras ambientais (eDNA) por meio de metabarcoding. Desta forma, esta abordagem, juntamente com o eDNA, é valiosa para catalogar a biodiversidade e auxiliar na avaliação da biodiversidade e possíveis medidas de conservação.Coral communities found either in tropical or deeper locations or in temperate waters can be classified as “marine animal forests” as they are dominated by habitat-forming suspension feeders, creating three-dimensional forest-like structures. Octocorallia is a wide and diverse subclass of Anthozoa that includes soft corals and gorgonians (Alcyonacea), blue corals (Helioporacea), and sea feathers (Pennatulacea). Their ecological importance, slow growth, and susceptibility to degradation caused by anthropogenic impacts make them vulnerable marine ecosystems. This leads to an interest of the scientific community to develop studies and implement conservation and restoration measures. Yet for many of these organisms, their identity is uncertain or debatable. The development of genetic tools that facilitate the identification of species, especially species that are morphologically identical but genetically different, has been complementing existing biodiversity monitoring methods. DNA barcoding allows high throughput multispecies identification but using sequencing of just one mitochondrial gene (typically the COI) is inadequate to distinguish many coral species. This study aims to develop an approach to barcode the mitochondrial genomes of octocorals by coupling long-range PCR with a 3rd generation sequencing platform (i.e., long-read sequencing) by designing coral-specific primers to amplify the mitogenomes, expanding the available reference library, confirming the gene orders arrangements of the target species and their placement in the Octocorallia phylogeny tree. We successfully identified and placed, at least at the genus level, all 17 reconstructed mitogenomes in the Octocorallia phylogenetic tree and we were able to identify three of the five existing gene orders within octocorals. This approach complemented and expanded the reference libraries that are applicable for eDNA metabarcoding to catalog biodiversity and assist in biodiversity assessment and possible conservation measures

Amino-alcohol organic-inorganic hybrid sol-gel materials based on an epoxy bicyclic silane: synthesis and characterization

Organic-inorganic hybrids (OIHs) are a type of material that can be obtained using the sol-gel process and has the advantages of organic and inorganic moieties in a single material. Polyetheramines have been widely used in the preparation of this type of material, particularly in combination with epoxy-based alkoxysilanes. Nevertheless, epoxyciclohexylethyltrimethoxysilane (ECHETMS) is a promising alkoxysilane with an epoxy terminal group that is quite unexplored. In this work, four novel OIH materials were synthesized using the sol-gel method. The OIHs were based on Jeffamines® of different molecular weights (D-230, D-400, ED-600, and ED-900), together with ECHETMS. The materials were characterized using multinuclear solid state NMR, FTIR, BET, UV/Vis spectroscopy, EIS, and TGA. The influence of the Jeffamine molecular weight and the suitability of these materials to act as a supporting matrix for heteroaromatic probes were assessed and discussed. The materials show interesting properties in order to be applied in a wide range of sensing applications.This research was funded by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) and FEDER (European Fund for Regional Development)-COMPETE-QRENEU for financial support through the Chemistry Research Centre of the University of Minho (Ref. CQ/UM (UID/QUI/00686/2019 and UID/QUI/00686/2020), project “SolSensors—Development of Advanced Fiber Optic Sensors for Monitoring the Durability of Concrete Structures”, reference POCI-01-0145-FEDER-031220, and a PhD grant to R.P.C.L. Sousa (SFRH/BD/145639/2019). The NMR spectrometer Bruker Avance III 400 is part of the National NMR Network (PTNMR) and are partially supported by Infrastructure Project No 022161 (co-financed by FEDER through COMPETE 2020, POCI and PORL and FCT through PIDDAC)

Observation of long-range, near-side angular correlations in proton-proton collisions at the LHC

This is the pre-print version of the Published Article, which can be accessed from the link below - Copyright @ 2010 Springer VerlagResults on two-particle angular correlations for charged particles emitted in proton-proton collisions at center-of-mass energies of 0.9, 2.36, and 7 TeV are presented, using data collected with the CMS detector over a broad range of pseudorapidity (eta) and azimuthal angle (phi). Short-range correlations in Delta(eta), which are studied in minimum bias events, are characterized using a simple "independent cluster" parametrization in order to quantify their strength (cluster size) and their extent in eta (cluster decay width). Long-range azimuthal correlations are studied differentially as a function of charged particle multiplicity and particle transverse momentum using a 980 inverse nb data set at 7 TeV. In high multiplicity events, a pronounced structure emerges in the two-dimensional correlation function for particle pairs with intermediate transverse momentum of 1-3 GeV/c, 2.0< |Delta(eta)| <4.8 and Delta(phi) near 0. This is the first observation of such a long-range, near-side feature in two-particle correlation functions in pp or p p-bar collisions

Observation of a new Xi(b) baryon

The first observation of a new b baryon via its strong decay into Xi(b)^- pi^+ (plus charge conjugates) is reported. The measurement uses a data sample of pp collisions at sqrt(s) = 7 TeV collected by the CMS experiment at the LHC, corresponding to an integrated luminosity of 5.3 inverse femtobarns. The known Xi(b)^- baryon is reconstructed via the decay chain Xi(b)^- to J/psi Xi^- to mu^+ mu^- Lambda^0 pi^-, with Lambda^0 to p pi^-. A peak is observed in the distribution of the difference between the mass of the Xi(b)^- pi^+ system and the sum of the masses of the Xi(b)^- and pi^+, with a significance exceeding five standard deviations. The mass difference of the peak is 14.84 +/- 0.74 (stat.) +/- 0.28 (syst.) MeV. The new state most likely corresponds to the J^P=3/2^+ companion of the Xi(b).Comment: Submitted to Physical Review Letter

Measurement of the charge ratio of atmospheric muons with the CMS detector

This is the pre-print version of this Article. The official published version can be accessed from the link below - Copyright @ 2010 ElsevierWe present a measurement of the ratio of positive to negative muon fluxes from cosmic ray interactions in the atmosphere, using data collected by the CMS detector both at ground level and in the underground experimental cavern at the CERN LHC. Muons were detected in the momentum range from 5 GeV/c to 1 TeV/c. The surface flux ratio is measured to be 1.2766 \pm 0.0032(stat.) \pm 0.0032 (syst.), independent of the muon momentum, below 100 GeV/c. This is the most precise measurement to date. At higher momenta the data are consistent with an increase of the charge ratio, in agreement with cosmic ray shower models and compatible with previous measurements by deep-underground experiments

Measurements of inclusive W and Z cross sections in pp collisions at root s=7 TeV

This is the pre-print version of the Published Article, which can be accessed from the link below - Copyright @ 2011 Springer VerlagMeasurements of inclusive W and Z boson production cross sections in pp collisions at sqrt(s)=7 TeV are presented, based on 2.9 inverse picobarns of data recorded by the CMS detector at the LHC. The measurements, performed in the electron and muon decay channels, are combined to give sigma(pp to WX) times B(W to muon or electron + neutrino) = 9.95 \pm 0.07(stat.) \pm 0.28(syst.) \pm 1.09(lumi.) nb and sigma(pp to ZX) times B(Z to oppositely charged muon or electron pairs) = 0.931 \pm 0.026(stat.) \pm 0.023(syst.) \pm 0.102(lumi.) nb. Theoretical predictions, calculated at the next-to-next-to-leading order in QCD using recent parton distribution functions, are in agreement with the measured cross sections. Ratios of cross sections, which incur an experimental systematic uncertainty of less than 4%, are also reported

Observation of long-range, near-side angular correlations in proton-proton collisions at the LHC

Results on two-particle angular correlations for charged particles emitted in proton-proton collisions at center-of-mass energies of 0.9, 2.36, and 7TeV are presented, using data collected with the CMS detector over a broad range of pseudorapidity (eta) and azimuthal angle (phi). Short-range correlations in Delta(eta), which are studied in minimum bias events, are characterized using a simple "independent cluster" parametrization in order to quantify their strength (cluster size) and their extent in eta (cluster decay width). Long-range azimuthal correlations are studied differentially as a function of charged particle multiplicity and particle transverse momentum using a 980 nb(-1) data set at 7TeV. In high multiplicity events, a pronounced structure emerges in the two-dimensional correlation function for particle pairs with intermediate p(T) of 1-3 GeV/c, 2.

Measurement of dijet angular distributions and search for quark compositeness in pp collisions at √s=7TeV

Dijet angular distributions are measured over a wide range of dijet invariant masses in pp collisions at root s = 7 TeV, at the CERN LHC. The event sample, recorded with the CMS detector, corresponds to an integrated luminosity of 36 pb(-1). The data are found to be in good agreement with the predictions of perturbative QCD, and yield no evidence of quark compositeness. With a modified frequentist approach, a lower limit on the contact interaction scale for left-handed quarks of Lambda(+) = 5.6 TeV (Lambda(-) = 6.7 TeV) for destructive (constructive) interference is obtained at the 95% confidence level

Mortality from gastrointestinal congenital anomalies at 264 hospitals in 74 low-income, middle-income, and high-income countries: a multicentre, international, prospective cohort study

Summary Background Congenital anomalies are the fifth leading cause of mortality in children younger than 5 years globally. Many gastrointestinal congenital anomalies are fatal without timely access to neonatal surgical care, but few studies have been done on these conditions in low-income and middle-income countries (LMICs). We compared outcomes of the seven most common gastrointestinal congenital anomalies in low-income, middle-income, and high-income countries globally, and identified factors associated with mortality. Methods We did a multicentre, international prospective cohort study of patients younger than 16 years, presenting to hospital for the first time with oesophageal atresia, congenital diaphragmatic hernia, intestinal atresia, gastroschisis, exomphalos, anorectal malformation, and Hirschsprung’s disease. Recruitment was of consecutive patients for a minimum of 1 month between October, 2018, and April, 2019. We collected data on patient demographics, clinical status, interventions, and outcomes using the REDCap platform. Patients were followed up for 30 days after primary intervention, or 30 days after admission if they did not receive an intervention. The primary outcome was all-cause, in-hospital mortality for all conditions combined and each condition individually, stratified by country income status. We did a complete case analysis. Findings We included 3849 patients with 3975 study conditions (560 with oesophageal atresia, 448 with congenital diaphragmatic hernia, 681 with intestinal atresia, 453 with gastroschisis, 325 with exomphalos, 991 with anorectal malformation, and 517 with Hirschsprung’s disease) from 264 hospitals (89 in high-income countries, 166 in middleincome countries, and nine in low-income countries) in 74 countries. Of the 3849 patients, 2231 (58·0%) were male. Median gestational age at birth was 38 weeks (IQR 36–39) and median bodyweight at presentation was 2·8 kg (2·3–3·3). Mortality among all patients was 37 (39·8%) of 93 in low-income countries, 583 (20·4%) of 2860 in middle-income countries, and 50 (5·6%) of 896 in high-income countries (p<0·0001 between all country income groups). Gastroschisis had the greatest difference in mortality between country income strata (nine [90·0%] of ten in lowincome countries, 97 [31·9%] of 304 in middle-income countries, and two [1·4%] of 139 in high-income countries; p≤0·0001 between all country income groups). Factors significantly associated with higher mortality for all patients combined included country income status (low-income vs high-income countries, risk ratio 2·78 [95% CI 1·88–4·11], p<0·0001; middle-income vs high-income countries, 2·11 [1·59–2·79], p<0·0001), sepsis at presentation (1·20 [1·04–1·40], p=0·016), higher American Society of Anesthesiologists (ASA) score at primary intervention (ASA 4–5 vs ASA 1–2, 1·82 [1·40–2·35], p<0·0001; ASA 3 vs ASA 1–2, 1·58, [1·30–1·92], p<0·0001]), surgical safety checklist not used (1·39 [1·02–1·90], p=0·035), and ventilation or parenteral nutrition unavailable when needed (ventilation 1·96, [1·41–2·71], p=0·0001; parenteral nutrition 1·35, [1·05–1·74], p=0·018). Administration of parenteral nutrition (0·61, [0·47–0·79], p=0·0002) and use of a peripherally inserted central catheter (0·65 [0·50–0·86], p=0·0024) or percutaneous central line (0·69 [0·48–1·00], p=0·049) were associated with lower mortality. Interpretation Unacceptable differences in mortality exist for gastrointestinal congenital anomalies between lowincome, middle-income, and high-income countries. Improving access to quality neonatal surgical care in LMICs will be vital to achieve Sustainable Development Goal 3.2 of ending preventable deaths in neonates and children younger than 5 years by 2030