Optimization of recombinant laccase production by Yarrowia lipolytica in a medium containing glucose as carbon source with Taguchi method

Introduction:Laccases (EC 1.10.3.2; benzenediol: oxygen oxidoreductase) are copper-containing oxidases that use molecular oxygen to oxidize various aromatic and non-aromatic compounds. Laccase is applied in delignification of lignocellulosic compounds for production of bioethanol, bioremediation of industrial wastewaters especially textile, food industries, and making biosensors. Materials and methods: The Taguchi experimental design method was used for optimization of laccase production in recombinant strain Yarrowia lipolytica YL4. A L-16 Taguchi orthogonal array was used to optimize the carbon and nitrogen sources along with vitamin in four levels. Results: The results showed that glucose, ammonium chloride, yeast extract and thiamine have significant effects on the production of laccase, respectively. The laccase activity reached to 1.52 U/mL after optimization of medium which is 7.6-fold higher than un-optimized medium. Discussion and conclusion: According to the analysis of results, the Taguchi experimental design method is a successful approach to increase laccase and recombinant proteins production in Y. lipolytica

Des enzymes de champignon au service de la dépollution des eaux

Des enzymes de champignon au service de la dépollution des eaux. Salon Pollute

Conception et développement d'une cathode utilisant la laccase de Trametes versicolor

L objectif de ce projet est de développer une biocathode enzymatique en utilisant une laccase qui catalyse la réduction de dioxygène en eau. La laccase de T. Versicolor produite au laboratoire a été choisie sur la base de sa bonne stabilité et son potentiel redox élevé. Cette laccase a été immobilisée par liaison covalente (EDC/NHS) ou par adsorption sur la surface d'une électrode de carbone fonctionnalisée. L'activité de laccase en présence d'ABTS et le courant de réduction d O2 ont été évalués. Le transfert direct d'électrons (TED) a eu lieu entre l'électrode et la laccase immobilisée. Pour fonctionnaliser les surfaces des électrodes de carbone deux approches ont été étudiées. Dans une première approche, les surfaces ont été électrochimiquement fonctionnalisées par réduction de sel de diazonium pour générer des groupements amines ou carboxyliques. La laccase a été ensuite immobilisée par une liaison covalente sur des surfaces fonctionnalisées par des groupements carboxyliques et le courant a atteint une densité de 25,1+-6,1 A cm-2. L oxydation de cette laccase a permis d'atteindre une densité de courant de 166,8+-21,4 A cm-2. Une autre stratégie de fonctionnalisation des électrodes qui consiste en traitement des surfaces par plasma a été étudiée. Le procédé plasma est innovant, simple et rapide. Différentes paramètres du plasma ont été étudiés. Selon le type de plasma (air, O2 et N2), des groupements carboxyliques, carbonyles et amines/amides ont été générés. La réduction d O2 a également été effectuée par TED. Une densité de courant de l ordre de 108 A cm-2, a été obtenue pour la laccase immobilisée d une façon covalente sur des surfaces traitées par plasma N2.The aim of this project is to manufacture an enzymatic biocathode using a laccase that catalyzes the reduction of oxygen to water. In-house produced and purified Laccase from T. versicolor has been selected due to its stability and high redox potential. The laccase was immobilized by covalent bonding (NHS/EDC method) or by adsorption on the functionalized surface of an electrode. The laccase activity in presence of ABTS and the current output without a mediator were evaluated. The direct electron transfer (DET) was achieved between the electrode and the immobilized laccase. To functionalize the carbon electrode surfaces, two functionalization approaches have been investigated. Firstly, the electrodes surfaces were electrochemically functionalized with amine or carboxylic groups using diazonium salt. The laccase was then covalently immobilised on carboxylic functionalised surfaces. Dioxygen reduction was performed by DET and a current density of 25,1+-6,1 A cm-2 was obtained. Using an oxidized laccase improved the biocathode performance and allowed to reach a current density of 166,8+-21,4 A cm-2. Secondly, for the first time the plasma treatment approach as an innovative, simple and rapid strategy for the chemical functionalization of graphite carbon electrodes was studied. Different plasma parameters were investigated. Depending on the plasma type (air, O2 and N2), carboxylic, carbonyl and amine/amide functionalities were generated. Dioxygen reduction was also performed by DET. The highest current density of 108 A cm-2 was recorded for covalently immobilized laccase on N2 plasma treated surfacesPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Mutagénèse site-dirigée dans la Laccase du Trametes versicolor et étude de la réactivité

Les Laccases sont des enzymes appartenant à la famille des oxydases multi-cuivre que l'on trouve dans de nombreuses plantes et champignons. Elles catalysent l'oxydation à un électron de substrats aromatiques riches en électrons (phénols ou amines), couplée à la réduction à quatre électrons du dioxygène en eau. Des mutations ponctuelles de la laccase du champignon Trametes versicolor nous ont permis, d'une part, d'acquérir de nouvelles informations sur les interactions entre le substrat et le site actif de l enzyme et, d'autre part, d oxyder un plus large spectre de composés. Notre étude montre que l'efficacité d'oxydation de la laccase ne dépend pas uniquement du potentiel d'oxydo-réduction du substrat. Elle dépend aussi de la facilité d'approche du substrat de l'His458 qui transfère ensuite les électrons au site Cu(T1). L'utilisation de la mutagenèse dirigée pour remplacer l'unique résidu polaire du site actif de la laccase, un acide aspartique en position 206, ainsi que la détermination de la réactivité d'une série homologue de phénols para susbtitués à deux valeurs de pH ont apporté des éléments expérimentaux sans ambiguïté quant à la stabilisation électrostatique impliquant ce résidu anionique (Asp206). Un autre type de mutation a concerné une série de phénylalanines qui limite l accessibilité de la poche catalytique. Plusieurs résidus phénylalanines ont été mutés en résidus alanine plus petits, soit successivement, soit par couple. Nous nous attendions à une augmentation de l'efficacité de l'oxydation des substrats encombrants. Malheureusement les mutants n'ont pas tous montré une réactivité supérieure à celle de l'enzyme non mutée envers la série choisie de phénolsLaccases are a family of multi-copper oxidases, found in many plants and fungi. They catalyse single electron oxidation of electron-rich aromatic substrates, usually phenols or amines, coupled to the four-electron reduction of dioxygen to water. Single-point mutations in Trametes versicolor Laccase have enabled us to acquire novel information about the profitable interactions of the substrate in the enzymatic pocket and to design and express mutated enzymes hopefully apt to oxidize a larger spectrum of substrates. Our study shows that the oxidation efficiency of laccase does not uniquely respond to the redox potential of a putative substrate. It also reflects the ease of approach of the substrate to T1 Cu through its His458 electron relay. The use of site-directed mutagenesis to replace the unique polar residue in laccase active site (Asp206) with Glu, Ala and Asn residues, along with the determination of the enzymatic reactivity at two different pH values, has given unambiguous experimental support to the electrostatic stabilization brought about by this anionic 206-residue. The use of an homologous series of X-substituted phenols has enabled us to shed light on this facet of the oxidation reactivity. The other mutation concerned a series of phenylalanines which confers size-discriminating ability to the enzyme. Upon mutating these phenylalanine residues in single and double mutations with smaller alanine residues we expected an increase in the oxidation efficiency of the mutants towards bulky substrates. Unfortunately not all the Phe mutants turned out to be more reactive than the non-mutated TvL towards a series of model phenols endowed with increasing size.PARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceItalyFRI

Biotransformation fongique des xénobiotiques : du sol au gène

Biotransformation fongique des xénobiotiques : du sol au gène. Rencontres des microbiologistes de l'INR

Enhanced production of laccase in the fungus <em>Trametes versicolor</em> by the addition of xenobiotics

International audienc

Les applications environnementales de la génomique fonctionnelle fongique

Les applications environnementales de la génomique fonctionnelle fongique. 3èmes rencontres des microbiologistes de l'INR