Effect of hormones of the female reproductive tract on ram sperm functionality

La presencia de hormonas en el tracto reproductor femenino y su papel en la regulación de la reproducción ha sido tema de estudio en múltiples especies. Entre ellas se encuentran las hormonas esteroideas, como la progesterona y el estradiol, y otras como la melatonina. Las hormonas esteroideas, ejercen su mecanismo de acción mediante la regulación de la expresión génica tras su unión a receptores nucleares, también llamados clásicos. Sin embargo, estas hormonas también pueden ejercer sus efectos de manera no genómica en diferentes tipos celulares, provocando respuestas rápidas a través de receptores presentes en la membrana o en el citoplasma. En espermatozoides de diferentes especies se han descrito y localizado este tipo de receptores para progesterona y 17-β estradiol, así como acciones no genómicas sobre procesos que tienen lugar en el tracto reproductor femenino como la capacitación, hiperactivación, quimiotaxis y la reacción acrosómica. Sin embargo, hasta el día de hoy, no han sido descritos los receptores para estas hormonas en espermatozoides ovinos, por lo que este hito constituyó el primer objetivo de esta tesis. Nuestros estudios mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta e inmunocitoquímica pusieron en evidencia, por primera vez, la localización del receptor de progesterona (PR) en en la zona ecuatorial y la pieza intermedia del espermatozoide ovino. Los análisis de western-blot de los extractos proteicos de los espermatozoides para el PR permitieron identificar un receptor con un peso molecular diferente al receptor clásico descrito en humano, por lo que se trataría de una isoforma del receptor clásico o de un receptor de membrana específico para la especie ovina. Así mismo, también se evidenció, por primera vez, la presencia de los receptores de estrógenos, ERα y ERβ en el espermatozoide ovino, localizándose en la zona post-acrosomal y en la región apical respectivamente, y correspondiendo su peso molecular a los de los receptores nucleares clásicos. Además, nuestros resultados demostraron una correlación positiva entre la presencia del receptor ERβ y el porcentaje de espermatozoides no capacitados evaluados por la tinción con clorotetraciclina. El porcentaje de células marcadas (ERβ+) disminuyó significativamente tras la capacitación in vitro, y prácticamente desapareció tras la inducción de la reacción acrosómica con lisofosfatidilcolina (LPC). Sin embargo, la localización de los receptores PR y ERα no cambió durante la capacitación ni tras la reacción acrosómica (Artículo 1). Una vez demostrada la presencia de los receptores para progesterona y estrógenos en el espermatozoide de morueco, nos planteamos, como segundo objetivo, determinar la implicación de ambas hormonas esteroideas, progesterona y 17-β estradiol, en la funcionalidad del espermatozoide ovino. Se llevaron a cabo experimentos con diferentes concentraciones de hormonas en un medio con y sin sustancias elevadoras del cAMP (cocktail) que promueven la capacitación in vitro en la especie ovina. Ambas hormonas provocaron un aumento del porcentaje de espermatozoides reaccionados (AR) tras 3 horas de incubación, pero únicamente la progesterona a baja (100 pM) y media (10 nM) concentración en un medio cocktail provocó un aumento en la fosforilación de proteínas en residuos de tirosina (TyrPP). Ambas hormonas a baja concentración también provocaron una disminución de la motilidad total cuando se añadieron a los espermatozoides en un medio cocktail. Por lo tanto, nuestros resultados ponen de manifiesto por primera vez el papel de la progesterona y 17-β estradiol sobre la funcionalidad espermática ovina y la capacidad de inducir la reacción acrosómica en el espermatozoide ovino (Artículo 1). Una vez determinados los efectos de la progesterona y 17-β estradiol en la funcionalidad del espermatozoide ovino, nos planteamos estudiar, como tercer objetivo, si dichos efectos estaban mediados por su unión a los receptores, PR, ERα y ERβ, que habíamos evidenciado. Para ello, incubamos espermatozoides ovinos en condiciones capacitantes, en presencia o ausencia de agonistas y antagonistas de PR y ER. La incubación con los agonistas provocaron un aumento del porcentaje de espermatozoides reaccionados (AR), en algún caso superior al inducido por la hormona, mientras que los antagonistas inhibieron el efecto inductor de la progesterona y el 17-β estradiol sobre la reacción acrosómica. Además, la incubación con los agonistas, tanto de PR como de ER, provocó un descenso de la motilidad progresiva mientras que la incubación con los antagonistas (previa a la adición de las hormonas) provocó un aumento significativo de este parámetro. Estos resultados confirman que tanto la progesterona como el 17-β estradiol son capaces de inducir la reacción acrosómica en espermatozoides ovinos, y que esta acción está mediada por su unión a sus receptores (Artículo 2). El cuarto objetivo de esta tesis fue profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de la progesterona y el 17-β estradiol en el espermatozoide ovino, analizando los mecanismos moleculares subyacentes al proceso de capacitación y reacción acrosómica. Para ello, evaluamos la distribución de TyrPP tras la capacitación in vitro mediante IIF. Ambas hormonas provocaron cambios diferentes en la localización de las TyrPP en los espermatozoides. La progesterona dio lugar a la desaparición de TyrPP del acrosoma, provocando un descenso de la subpoblación con marcaje en acrosoma, zona ecuatorial y flagelo, que correlacionaba con espermatozoides capacitados, y un aumento de la subpoblación con marcaje en la zona ecuatorial y flagelo, correlacionada con los espermatozoides reaccionados, mientras que este efecto no se observó en los espermatozoides incubados con estradiol. Además, la progesterona provocó un aumento en los niveles de calcio intracelular y una movilización de este ion hacia el acrosoma, así como un aumento en los niveles de especies oxígeno reactivas (ROS) y una rotura significativa del acrosoma (evidenciada mediante el uso de lectinas). Sin embargo, el 17-β estradiol no dio lugar a ninguno de estos cambios. La vía cAMP-PKA no parece estar involucrada en los efectos de ninguna de estas hormonas esteroideas en el espermatozoide ovino. Finalmente, ni la progesterona ni el estradiol provocaron un aumento en los parámetros cinéticos relacionados con la hiperactivación espermática (Artículo 3). Así, nuestros resultados demostraron que, aunque la progesterona y el 17-β estradiol promueven mecanismos conducentes a la inducción de la reacción acrosómica en los espermatozoides ovinos, estos mecanismos son diferentes. Por último, quisimos profundizar en el efecto de otra hormona presente en el tracto reproductor femenino, la melatonina, sobre la funcionalidad espermática ovina. Esta hormona es secretada por la hipófisis y controla la estacionalidad reproductiva a través también del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal, pero también se secreta en otros tejidos y es capaz de ejercer efectos directos sobre las células, incluyendo los espermatozoides. En estudios previos, nuestro grupo identificó los receptores de melatonina, MT1 Y MT2 , en la membrana plasmática del espermatozoide ovino y demostró que, entre otras acciones, esta hormona provocaba efectos opuestos en función de su concentración, sobre la capacitación espermática ovina. Por ello, el último objetivo de esta tesis se centró en investigar los mecanismos moleculares por los que la melatonina ejerce su acción dual capacitante/descapacitante sobre el espermatozoide ovino. Se comprobó que la melatonina a alta concentración (1 μM) daba lugar a la inhibición del proceso de capacitación y de reacción acrosómica mediante la disminución de los niveles de fosfotirosinas y de ROS. Por otro lado, tras un estudio de análisis de componentes principales (PCA), se pudo comprobar que la melatonina a concentraciones bajas (100 pM y 10 nM) promueve la hiperactivación. Sin embargo, no se pudo confirmar el papel de la vía cAMP-PKA en estos procesos, ya que aunque la melatonina a concentración alta fue capaz de modificar los niveles de cAMP, no provocó cambios en la actividad de la enzima PKA durante la capacitación espermática ovina (Artículo 4 + Anexo I). En conclusión, los resultados de esta tesis doctoral demuestran el papel de las hormonas esteroideas, progesterona y 17-β estradiol, en la inducción de la reacción acrosómica, y el papel dual capacitante/descapacitante de la melatonina en el espermatozoide ovino, lo que abre nuevas posibilidades para el uso de las mismas, o bien agonistas o antagonistas de sus receptores, para la formulación de diluyentes o medios empleados en inseminación artificial o para el mantenimiento de las dosis seminales. Así mismo, también abre nuevas perspectivas en la investigación del mecanismo de acción de estas hormonas a través otras vías distintas a la vía cAMP-PKA y que podrían estar implicadas en la funcionalidad del espermatozoide ovino. <br /

Estudio de las vías de degradación enzimática de la melatonina en el tracto reproductor masculino de la especie ovina

La melatonina es una de las moléculas más antiguas y biológicamente activas. Se encuentra en una amplia variedad de organismos, siendo su principal función la defensa antioxidante. La melatonina es sintetizada en la glándula pineal durante la noche, y es degradada por diversos órganos como el hígado, cerebro o retina. Estudios previos han determinado la presencia de las enzimas de síntesis de melatonina en el testículo ovino (serotonin-N-acetiltransferasa (AANAT) y N-acetilserotonin-O-metiltransferasa (ASMT)) y altas concentraciones de melatonina en el plasma seminal ovino. Sin embargo, las posibles vías de degradación de esta hormona en el tracto reproductor del macho no han sido estudiadas previamente. Con el fin de determinar si la melatonina es degradada en el aparato reproductor del morueco, se realizaron diversos estudios de las principales vías de degradación enzimática de la hormona en los tejidos del tracto genital (testículo, epidídimo y glándulas accesorias) mediante RT-PCR, q-PCR y Western-Blot. Las enzimas que se estudiaron fueron: Mieloperoxidasa (MPO), Indoleamina-2,3-dioxigenasa 1 (IDO1) y 2 (IDO2). Se demostró la expresión génica mediante RT-PCR de las tres enzimas en todos los tejidos estudiados, mientras que la q-PCR permitió comprobar que la expresión génica de la enzima MPO es predominante sobre IDO1 e IDO2 en casi todos los tejidos, siendo el testículo y glándulas bulbouretrales los tejidos que presentan los mayores niveles de expresión. Mediante Western-Blot, se demostró la traducción de la proteína MPO en las glándulas bulbouretrales, aunque en el caso de IDO, los resultados obtenidos no fueron concluyentes. En conclusión, nuestros resultados indican la existencia de una ruta de degradación enzimática de la melatonina en el tracto genital. Dado que los metabolitos producidos en la degradación de esta hormona son compuestos antioxidantes, su producción en el aparato reproductor podría tener una implicación directa en la defensa de los espermatozoides ante las especies reactivas de oxígeno

In vitro approach points to a chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa

Sperm orientation mechanisms, such as chemotaxis, are essential for the sperm to reach the oocyte and fertilize it. Melatonin is secreted by the cumulus cells and is also present in the follicular fluid in mammals. The presence of membrane receptors for melatonin in ram spermatozoa, and its proven involvement in the sperm functionality, may suggest a possible role in the guided movement towards the oocyte. Hence, the objective of the present work is to study the in vitro potential chemotactic action of melatonin on ram spermatozoa, analysing the influence of the season (breeding and non-breeding) and the sperm capacitation state. The first experimental approach consisted in the inclusion of melatonin in the upper layer of a swim-up selection method. During the non-breeding season, the presence of melatonin at 100 pM and 1 μM concentrations significantly increased the cell recovery rate, and induced changes in the sperm location of the MT2 melatonin receptor, compared with the standard swim-up. Moreover, the selected sperm population with 100 pM melatonin presented a higher percentage of capacitated spermatozoa. The greater recovery rate obtained with melatonin could be due to the stimulation of sperm movement in random directions, i.e., a chemokinetic effect, or due to a guided movement (chemotaxis) towards the gradient of the melatonin. To elucidate this issue, together with the study of the influence of the sperm capacitation status, we performed a second experimental approach which consisted in the use of chemotaxis chambers and an open-source software (Open-CASA) that analyses the sperm trajectories towards the hormone gradient and calculates a chemotaxis index (SL index). There was a significant difference between the SL index in the presence of 1 μM melatonin and the control without hormone. This effect was only observed in capacitated spermatozoa with cAMP-elevating agents (Cap-CK samples) obtained during the non-breeding season. These results would point to an in vitro chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa, although chemokinesis cannot be ruled out. Nonetheless, the inclusion of this hormone in the swim-up procedure could enhance the sperm recovery rate

Melatonin non-linearly modulates bull spermatozoa motility and physiology in capacitating and non-capacitating conditions

Bull spermatozoa physiology may be modulated by melatonin. We washed ejaculated spermatozoa free of melatonin and incubated them (4 h, 38 °C) with 0-pM, 1-pM, 100-pM, 10-nM and 1-µM melatonin in TALP-HEPES (non-capacitating) and TALP-HEPES-heparin (capacitating). This range of concentrations encompassed the effects mediated by melatonin receptors (pM), intracellular targets (nM–µM) or antioxidant activity (µM). Treatment effects were assessed as motility changes by computer-assisted sperm analysis (CASA) of motility and physiological changes by flow cytometry. Melatonin effects were more evident in capacitating conditions, with 100 pM reducing motility and velocity (VCL) while increasing a “slow” subpopulation. All concentrations decreased apoptotic spermatozoa and stimulated mitochondrial activity in viable spermatozoa, with 100 pM–1 µM increasing acrosomal damage, 10 nM–1 µM increasing intracellular calcium and 1 pM reducing the response to a calcium-ionophore challenge. In non-capacitating media, 1 µM increased hyperactivation-related variables and decreased apoptotic spermatozoa; 100 pM–1 µM increased membrane disorders (related to capacitation); all concentrations decreased mitochondrial ROS production. Melatonin concentrations had a modal effect on bull spermatozoa, suggesting a capacitation-modulating role and protective effect at physiological concentrations (pM). Some effects may be of practical use, considering artificial reproductive techniques

Efecto del fluido folicular en la quimiotaxis espermática ovina en función del momento del ciclo estral.

El fluido folicular conforma el entorno bioquímico en el que se desarrolla el ovocito previo a su ovulación. Contiene hormonas, iones, metabolitos y factores de crecimiento entre otros muchos compuestos, cuya concentración varía a lo largo del ciclo reproductivo estral. Alguno de estos compuestos podría estar involucrado en la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides, mediante la cual serían guiados hacia el ovocito para que se produzca la fecundación. Otro requisito fundamental para la fecundación es la capacitación, conjunto de cambios moleculares y bioquímicos que sufre el espermatozoide y le confieren capacidad fecundante.En estudios realizados en ratón y humano, se ha descrito que el fluido folicular ejerce una acción quimioatrayente para los espermatozoides, pero hasta el momento no existe ningún estudio en la especie ovina. Por ello, el objetivo central de este trabajo consistió en estudiar la capacidad quimiotáctica del fluido folicular de la oveja sobre los espermatozoides ovinos. Teniendo en cuenta la composición variable de dicho fluido a lo largo del ciclo estral, se ensayaron fluidos foliculares obtenidos de dos momentos distintos del ciclo: en fase folicular temprana (proestro) y luteal temprana (metaestro), ambos a concentraciones de 2% y 10% (v/v). Dado que algunos estudios apuntan a que sólo los espermatozoides capacitados son capaces de responder ante un agente quimiotáctico, en este estudio se usaron tanto espermatozoides sin capacitar, como capacitados in vitro en presencia o ausencia de agentes elevadores de AMPc (cocktail y control, respectivamente). Tras la valoración previa del estado de los espermatozoides (motilidad, viabilidad y estado de capacitación), se realizaron los ensayos de quimiotaxis utilizando cámaras IBIDI® µ-Slide Chemotaxis, y se analizaron mediante el software de acceso libre OpenCASA, que proporciona un valor de índice quimiotáctico.Los resultados obtenidos demuestran que el fluido folicular, tanto obtenido en fase folicular como luteal temprana, ejerce una acción quimiotáctica a ambas concentraciones ensayadas, atrayendo hacia sí, de una manera significativa, únicamente a los espermatozoides capacitados in vitro. Se puede afirmar por ello, que el fluido folicular actúa como quimioatrayente espermático en la especie ovina.Follicular fluid is the biochemical environment in which oocytes develop before ovulation. It contains hormones, ions, metabolites, growth factors and some other compounds which concentration vary along the oestral reproductive cycle. Some of these compounds may be involved in spermatic chemotactic response, which guides spermatozoa towards the oocyte for producing fertilization. Other main requierement for fertilization is capacitation, in which spermatozoa suffer molecular and biochemical changes necessary for acquire fertilizing ability.Follicular fluid has a chemotactic effect on mouse and human spermatozoa, but, so far, this effect has not been demonstrated in ram sperm. Thus, the main objective of this work was to evaluate the follicular fluid chemotactic effect on ram spermatozoa.The composition of follicular fluid varies along the reproductive cycle. Thus, we evaluated ewe follicular fluid obtained from two different stages of oestruscycle, early follicular phase (proestrus) and early luteal phase (metaestrus), both at 2% and 10% (v/v) concentrations. Previous studies had concluded that only capacitated spermatozoa show response towards chemotactic compounds, so in this study were used not only swim-up selected spermatozoa (non-capacitated), but also capacitated spermatozoa in vitro in the presence or absence of cAMP rising factors (named cocktail and control, respectively). After sperm evaluation (motility, viability and capacitation), chemotactic assays were performed in IBIDI® µ-Slide Chemotaxis chambers, and the results were analyzed by the OpenCASA software, that can calculate the chemotactic index.Our results demonstrate that both follicular fluids, obtained in early follicular phase and early luteal phase, produce a chemotactic response at both concentrations tested, only on in vitro capacitated spermatozoa. In conclusion, follicular fluid is a spermatic chemoattractant in sheep.<br /

Influencia de los polimorfismos de MTNR1A en el efecto crioprotector de la melatonina en dosis seminales ovinas

La refrigeración y la congelación del semen provoca una serie de efectos perjudiciales para los espermatozoides conocidos como cold-shock, que podrían ser evitados parcialmente empleando agentes crioprotectores, entre ellos, la melatonina. Esta hormona puede llevar a cabo alguno de sus efectos uniéndose a sus receptores de membrana, MT1 y MT2. El gen del receptor de melatonina 1A (MNTR1A) presenta varios polimorfismos, pero se desconoce si podrían influir en el efecto de la melatonina durante la criopreservación de dosis seminales ovinas.Así, el objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia de los polimorfismos de MTNR1A en el efecto crioprotector de la melatonina en espermatozoides ovinos. Para ello, muestras seminales de seis moruecos adultos, previamente genotipados para el polimorfismo RsaI del gen MTNR1A (2 C/C, 2 C/T y 2 T/T), se refrigeraron y congelaron sin y con melatonina 1 mM y 1 μM. Antes y después de este proceso se evaluó la motilidad, integridad de membrana, estado de capacitación y marcadores apoptóticos de los espermatozoides.<br /

Efecto de la melatonina sobre la Ca2+/Calmodulina proteín-kinasa II de los espermatozoides ovinos

La melatonina es una hormona que se sintetiza principalmente en la glándula pineal y que regula muchos procesos fisiológicos, como la reproducción estacional. A nivel celular es capaz de aumentar los niveles de calcio intracelular en células somáticas y unirse a la proteína calmodulina. Esto inhibe la formación del complejo calcio/calmodulina, que regula la actividad de la enzima calcio/calmodulina proteín-quinasa II (CaMKII). Dado que tanto el aumento de los niveles de calcio como la actividad de CaMKII están implicados en la capacitación espermática (conjunto de cambios que debe sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina podría modular la capacitación espermática ovina a través de la enzima CaMKII. Así, los objetivos de este estudio fueron investigar el efecto de la melatonina sobre los niveles y distribución del calcio intracelular, identificar la presencia de la proteína CaMKII en el espermatozoide ovino y evaluar los cambios en la concentración de la misma en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 °C y 5% de CO2) en medio TALP (control), y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 µM). Tras la incubación se evaluó la motilidad, viabilidad, y estado de capacitación de las muestras. Los cambios en la concentración y distribución de calcio intracelular se evaluaron mediante citometría de flujo con las sondas Fluo-4 AM y Rhod-5N AM. Finalmente, la identificación y cuantificación de CaMKII se realizó mediante Western Blot en proteínas espermáticas extraídas tras la capacitación in vitro. Los resultados obtenidos indican que la melatonina a una concentración 1 µM es capaz de aumentar el porcentaje de espermatozoides vivos con altos niveles de calcio tras tres horas de incubación en condiciones capacitantes, sin afectar negativamente a la funcionalidad espermática. Además, la presencia de melatonina en el medio parece aumentar los niveles de CaMKII y de una de sus isoformas (CaMKIIα) en el espermatozoide de morueco. En conclusión, este trabajo sugiere que la melatonina podría regular el proceso de capacitación espermática aumentando los niveles de la enzima CaMKII, aunque las implicaciones que puede tener esto en su activación o actividad todavía no están esclarecidas

Efecto de la melatonina sobre la capacitación espermática en la especie ovina

La melatonina es una hormona importante en la regulación de la reproducción, por lo que el descubrimiento de la presencia de los receptores de esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino permite especular sobre su importancia en la funcionalidad espermática. Se sabe que, en ciertas células somáticas, ejerce sus acciones a través de diversas vías moleculares, algunas implicadas en la regulación de procesos fisiológicos del espermatozoide, como la capacitación. Esta capacitación es el conjunto de cambios moleculares y fisiológicos que sufre el espermatozoide y que le confieren capacidad fecundante. Por otro lado, es sabido que la melatonina tiene la capacidad de reducir el estrés oxidativo inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS) y que durante la capacitación in vitro se produce un incremento de los niveles de ROS. Basándonos en estos datos, en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina jugaría un papel crucial en la capacitación espermática. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina sobre distintos parámetros relacionados con la funcionalidad espermática en muestras sometidas a capacitación in vitro. Los parámetros analizados fueron la motilidad y la viabilidad celular y otros especialmente vinculados con la capacitación, como la hiperactivación, la distribución y la cantidad de calcio intracelular, los niveles de ROS, la cantidad de AMPc y los niveles de fosforilación en residuos de tirosina de las proteínas espermáticas. Los resultados obtenidos en este trabajo indicaron que ninguna de las concentraciones de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 μM) modificaron significativamente el porcentaje de espermatozoides mótiles o con membrana plasmática íntegra con respecto a las muestras capacitadas sin melatonina. Sin embargo, la presencia de 1 μM de melatonina en el medio de capacitación dio lugar a un menor porcentaje de espermatozoides capacitados (p<0,001) junto con menores niveles de ROS y calcio intracelular y además menor grado de fosforilación en residuos de tirosinas. En conclusión, en este estudio se demostró que la melatonina tiene efectos directos sobre la capacitación del espermatozoide ovino

Relación de la melatonina con el metabolismo del óxido nítrico en espermatozoides ovinos

En la especie ovina la reproducción tiene un carácter estacional muy marcado regulado por la secreción de melatonina. Esta molécula tiene, además, una gran capacidad antioxidante y es capaz de reducir, entre otras especies reactivas, los niveles de óxido nítrico (NO). El NO se genera vía oxidación de L-arginina por la actividad de la óxido nítrico sintasa o sintetasa (NOS). Existen tres isoformas de esta enzima: la neuronal (nNOS), la endotelial (eNOS) y la inducible (iNOS). En espermatozoides humanos se han identificado las tres isoformas de NOS y se ha demostrado que su actividad se incrementa a lo largo del proceso de capacitación in vitro. En espermatozoides ovinos, cuya capacitación in vitro resulta mucho más complicada que en otras especies, no existen estudios que hayan identificado alguna de las isoformas de NOS. Por tanto, el objetivo de este Trabajo de Fin de Master es estudiar la acción de la melatonina a diferentes concentraciones fisiológicas, sobre los niveles de NO en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes, identificar si las tres isoformas descritas de NOS están presentes en espermatozoides ovinos y evaluar el efecto de la melatonina sobre estas isoformas de NOS. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 °C y 5% de C02) en medio TALP (control), con alto cAMP (cocktail) y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 µM) añadidas al medio cocktail, y se evaluaron los niveles de NO mediante citometría de flujo. Para determinar si este efecto estaba mediado por la acción de la óxido nítrico sintasa, previamente se identificaron en espermatozoides ovinos las tres isoformas de la enzima descritas para otras especies, tras poner a punto los protocolos de western blot y de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Finalmente se evaluaron los cambios en la distribución de estas isoformas de NOS mediante IFI tras incubación de los espermatozoides en presencia de melatonina. Los resultados obtenidos indican que la melatonina, a concentración 1 µM, es capaz de reducir significativamente los niveles de NO, los cuales se ven incrementados durante la capacitación espermática. Además se han identificado, por primera vez en el espermatozoide ovino, las tres isoformas de NOS, mediante western blot e inmunofluorescencia indirecta. La IFI también reveló tres inmunotipos espermáticos para cada una de las isoformas de NOS, cuyos porcentajes se modificaron durante la capacitación y el tratamiento con melatonina. Así, la localización en el borde apical de las isoformas eNOS e iNOS disminuye con la capacitación y la melatonina, a concentración 1 µM y 100 pM, modifica el efecto producido por los agentes capacitantes sobre el porcentaje de los inmunotipos de la nNOS e iNOS, revirtiéndolo en la primera y aumentándolo en la segunda. Por tanto, la melatonina durante la capacitación de los espermatozoides ovinos parece ejercer un papel antioxidante reduciendo los niveles de NO, posiblemente generado por las isoformas identificadas de la NOS. Además, el tratamiento con melatonina parece modificar la localización de alguna de las isoformas de la NOS en el espermatozoide ovino