Estudio del potencial de bioconjugados Quantum Dots para el marcaje específico de dianas involucradas en Esclerosis Lateral Amiotrófica

La investigación biomédica se encuentra en continuo avance y requiere la implantación de técnicas novedosas y prometedoras que permitan esclarecer mecanismos de enfermedades y seleccionar medicamentos eficaces para las mismas. El fin de estas técnicas es poder aplicar un tratamiento individualizado a cada paciente, es decir, implantar la medicina personalizada y para ello son necesarios biomarcadores y sensores efectivos. La técnica Multicolor Multicycle Molecular profiling (M3P), la cual se quiere aplicar en patologías de gran complejidad molecular como la esclerosis lateral amiotrofia (ELA), entre otras, utiliza Quantum Dots (QDs), nanopartículas con características fotoluminiscentes únicas y ventajosas sobre los fluoróforos tradicionales y con gran potencial como herramienta puntera en el campo de la biomedicina. En este trabajo se muestran los resultados obtenidos tras la realización de distintos inmunoensayos de QDs para estudiar su efectividad de marcaje de proteínas, la penetrabilidad en el núcleo y en consecuencia su potencial para seleccionar fármacos eficaces para patologías complejas como la EL

TTBK1 and CK1 inhibitors restore TDP-43 pathology and avoid disease propagation in lymphoblast from Alzheimer’s disease patients

IntroductionTDP-43 proteinopathy in Alzheimer’s disease (AD) patients is recently emerging as a relevant pathomolecular event that may have been overlooked. Recent results in immortalized lymphocytes from AD patients have shown not only an increase of post-translational modifications in TDP-43, such as hyperphosphorylation and fragmentation, but also its prionic behaviour and cell-to-cell disease transmission. With the main goal to advance therapeutic interventions, we present in this work different kinase inhibitors with potential to restore this pathological mechanism.MethodologyWe have used immortalized lymphocytes from healthy controls and AD severe patients to evaluate the correction of TDP-43 pathology after the treatment with previously synthetized TTBK1 and CK1 inhibitors. Moreover we used the conditioned mediums of these cells to perform different disease propagation experiments.ResultsTDP-43 pathology observed in lymphoblasts from severe AD patients is reduced after the treatment with TTBK1 and CK1 inhibitors (decreasing phosphorylation and increasing nuclear localisation), Furthermore, the significant increase in TDP-43 phosphorylation, cytoplasmic accumulation and aberrant F-actin protrusions (TNT-like structures) observed in control cells growing in CM from AD lymphoblasts were abolished when the CM from AD lymphoblasts treated with previously reported TTBK1 and CK1 inhibitors were used. In addition, the cytosolic transport mediated by molecular motors of the receptor cells was altered with the induced TDP-43 pathology, but it was not produced with the abovementioned pretreated CMs.ConclusionTTBK1 and CK1 inhibitors, specially VNG1.47 and IGS2.7 compounds, restore TDP-43 pathology and avoid cell-to-cell propagation in immortalized lymphocytes from AD patients, being excellent candidates for the future therapy of this prevalent and devastating disease

CdSe Quantum Dots in Human Models Derived from ALS Patients: Characterization, Nuclear Penetration Studies and Multiplexing

CdSe quantum dots (QDs) are valuable tools for deciphering molecular mechanisms in cells. Their conjugation with antibodies offers a unique staining source with optimal characteristics, including increased photostability and narrow emission spectra, allowing for improved multiplexing capabilities using a single excitation source. In combination with pathology models derived from patients, they have great potential to contribute to quantitative molecular profiling and promote personalized medicine. However, the commercial availability of diverse CdSe QDs is still limited and characterization techniques must be performed to these materials or the conjugates developed in the lab to assure a proper function and reproducibility. Furthermore, while there is significant data of QDs experiments in cell lines, the literature with primary human cells is scarce, and QD behavior in these systems may be different. Rigorous characterization data of commercially available QDs and their conjugates with biomolecules of interest is needed in order to establish their potential for target labelling and expand their use among research labs. Here we compare the characterization and labelling performance of different QD conjugates in SH-SY5Y cell line, fibroblasts and immortalized lymphocytes derived from amyotrophic lateral sclerosis patients

Biosensores para determinar la eficacia farmacológica en enfermedades neurodegenerativas

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Medicina, leída el 24-03-2023Neurodegenerative diseases (NDs) are characterised by a progressive neuronal death that leads to cognitive or motor deficits as well as behaviour alterations. Most common NDs are Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Different mechanisms underlying these diseases have been described, although the aetiology of these diseases remains an essential question hampering the development of effective treatments. To overcome the lack of available treatments to cure NDs, the development of novel biosensors is crucial to deepen our understanding of these pathologies and efficiently evaluate drug candidates. Biosensors are devices that detect a specific analyte or molecule using biological elements. Among the different types of biosensors, fluorescence-based biosensors are one of the most attractive because of their great sensibility and capability of live imaging. Usually, these biosensors are based on fluorescent proteins or organic fluorophores, however recently novel fluorophores based on nanoparticles, Quantum dots (QDs) have been developed with improved photophysical properties. QDs are generally formed by a Cd/Se core coated typically with a Zn/S layer. Due to their large surface, they have been conjugated with different biomolecules of interest becoming novel versatile tools...Las enfermedades neurodegenerativas (ENs) se caracterizan por una muerte neuronal que produce déficits cognitivos o motores así como alteraciones en el comportamiento. Las ENs más prevalentes son la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Aunque se han descrito mecanismos comunes entre las distintas ENs, se desconoce la causa que desencadena estas enfermedades, lo que dificulta el desarrollo de terapias efectivas. Para ello, el desarrollo de nuevos biosensores es crucial para comprender mejor estas patologías y evaluar candidatos a fármaco de manera eficaz. Los biosensores son dispositivos que permiten detectar un analito o molécula de interés utilizando elementos biológicos. Entre los biosensores más relevantes se encuentran los que están basados en fluorescencia debido a su alta sensibilidad y capacidad de monitorizar procesos in vivo. Generalmente, estos biosensores están basados en proteínas fluorescentes o fluoróforos orgánicos aunque recientemente se han desarrollado nanopartículas fluorescentes, denominadas Quantum dots (QDs) que presentan unas propiedades ópticas optimizadas. Los QDs están generalmente compuestos por un núcleo de Cd/Se y típicamente recubiertos de una capa de Zn/S. Debido a su gran superficie pueden ser conjugados con distintas biomoléculas de interés, convirtiéndolos en herramientas con gran versatilidad...Fac. de MedicinaTRUEunpu

Biosensores específicos basados en quantum dots en la detección de proteínas patológicas en ELA

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la muerte de las motoneuronas (MN) lo cual produce una parálisis progresiva. El mecanismo subyacente a dicha muerte selectiva de las motoneuronas todavía no se ha caracterizado, convirtiéndose en una diana crucial para el desarrollo de fármacos innovadores y efectivos. Con el objetivo de caracterizar la patología molecular, se propone realizar un análisis de perfil molecular a nivel de célula única. Como herramienta para analizar diferentes dianas moleculares, se han utilizado quantum dots (QDs) conjugados con anticuerpos monoclonales. Los QD son nanopartículas formadas por un núcleo de CdSe y una cubierta de ZnS que ofrecen propiedades fotoluminiscentes únicas. Presentan una alta fotoestabilidad, altos coeficientes de extinción, amplios espectros de absorción pero estrechos de emisión lo cual permite una detección más sensible así como ensayos multiplex. Conjugando los QD con distintos anticuerpos monoclonales se propone implementar un inmunoensayo basado en QD que permita estudiar a nivel de célula única distintas proteínas diana implicadas en la patología molecular del ELA como la proteína nuclear TDP-43. Se ha visto que las MN afectadas presentan agregados de p-TDP-43 en el citosol que inducen por distintos mecanismos la apoptosis de las MN. Es por ello que resulta crucial determinar la etiología de estas inclusiones y caracterizarlas molecularmente. En este trabajo se muestran los primeros resultados de la implementación del inmunoensayo basado en QD en células SH-SY5Y. Posteriormente, el objetivo final es aplicar este inmunoensayo en modelos de MN humanos para determinar cambios en las proteínas clave tras el tratamiento con candidatos terapéuticos ayudando a su selecció

Pardeamiento de la grasa para combatir la obesidad

La obesidad, definida como una acumulación excesiva de grasa corporal, se ha llegado a definir como la pandemia del siglo XXI. Tradicionalmente se ha atribuido al desequilibrio entre la ingesta y el gasto de energía o a la ausencia de actividad física pero hoy en día se sabe que existe una relación con otras enfermedades y que el factor genético es responsable, de al menos, un 33% de los casos. La fisiopatología de la obesidad cursa con una inflamación crónica y la implicación de distintas vías de señalización entre las que destaca la vía Notch. Además, se distinguen dos tipos de grasa (grasa blanca y grasa parda) tanto por su histología como por la expresión de distintos marcadores (UCP-1 específico de la grasa parda). Mientras que la grasa blanca actúa como reservorio de energía, la grasa parda tiene una función de termogénesis. Es por ello que se ha elegido el pardeamiento de la grasa (o transformación de grasa blanca en grasa parda mediado por la vía Notch) como proceso para la búsqueda de un posible tratamiento contra la obesidad. Con este objetivo se propone la realización de un ensayo de High Throughput Screening o HTS libre de células basado en la tecnología AlpaLISA para el cribado de una biblioteca de más de 2 millones de compuestos que nos permita identificar posibles compuestos candidatos capaces de inhibir la actividad de la y-secretasa (diana farmacológica elegida). Con el objetivo de aumentar la eficacia y disminuir la toxicidad de los compuestos candidatos generados, se desarrollaron distintos estudios tanto in vitro como in vivo y se propuso un mecanismo de vehiculización basado en nanopartículas compuestas por PLGA (poly lactide-co glycolide) con un marcador específico de tejido adiposo para la óptima acción del fármac