Desiccation tolerance and lichenization: a case study with the aeroterrestrial microalga Trebouxia sp. (Chlorophyta)

Coccoid algae in the Trebouxia genus are the most common photobionts of chlorolichens but are only sporadically found in soil or bark outside of a lichen. They all appear to be desiccation tolerant, i.e. they can survive drying to water contents of below 10 %. However, little is known about their longevity in the dry state and to which extent lichenization can influence it. Here, we studied the longevity in the dry state of the lichenized alga (LT) Trebouxia sp. in the lichen Parmotrema perlatum, in comparison with axenically grown cultures (CT) isolated from the same lichen. We report on chlorophyll fluorescence emission and reactive oxygen species (ROS) production before desiccation, after 15\u201345 days in the dry state under different combinations of light and air humidity and after recovery for 1 or 3 days in fully hydrated conditions. Both the CT and the LT were able to withstand desiccation under high light (120 lmol photons m-2 s-1 for 14 h per day), but upon recovery after 45 days in the dry state the performance of the CT was better than that of the LT. By contrast, the quenching of excess light energy was more efficient in the LT, at high relative humidities especially. ROS production in the LT was influenced mostly by light exposure, whereas the CT showed an oxidative burst independent of the light conditions. Although lichenization provides benefits that are essential for the survival of the photobiont in high-light habitats, Trebouxia sp. can withstand protracted periods of photo-oxidative stress even outside of a lichen thallus

How to build a lichen: from metabolite release to symbiotic interplay

Exposing their vegetative bodies to the light, lichens are outstanding amongst other fungal symbioses. Not requiring a pre-established host, 'lichenized fungi' build an entirely new structure together with microbial photosynthetic partners that neither can form alone. The signals involved in the transition of a fungus and a compatible photosynthetic partner from a free-living to a symbiotic state culminating in thallus formation, termed 'lichenization', and in the maintenance of the symbiosis, are poorly understood. Here, we synthesise the puzzle pieces of the scarce knowledge available into an updated concept of signalling involved in lichenization, comprising five main stages: (1) the 'pre-contact stage', (2) the 'contact stage', (3) 'envelopment' of algal cells by the fungus, (4) their 'incorporation' into a pre-thallus and (5) 'differentiation' into a complex thallus. Considering the involvement of extracellularly released metabolites in each phase, we propose that compounds such as fungal lectins and algal cyclic peptides elicit early contact between the symbionts-to-be, whereas phytohormone signalling, antioxidant protection and carbon exchange through sugars and sugar alcohols are of continued importance throughout all stages. In the fully formed lichen thallus, secondary lichen metabolites and mineral nutrition are suggested to stabilize the functionalities of the thallus, including the associated microbiota

Seasonal variations of PAHs content and distribution patterns in a mixed land use area: A case study in NE Italy with the transplanted lichen Pseudevernia furfuracea

The seasonal differences of the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) content in lichen transplants were investigated in an area of ca. 40 square kilometers in NE Italy characterized by different land use. Two sets of samples of the epiphytic lichen Pseudevernia furfuracea were collected in a pristine area of the Carnic Alps and transplanted to 40 exposure sites for a period of two months, respectively in late winter and in summer. Results revealed a pronounced difference between the two seasons in terms of PAH content and distribution patterns. After the summer exposure the PAH concentrations in the transplants were more than one order of magnitude lower than after the winter exposure (ranging from 48.22 to 272.73 ng g 121 dw and from 289.73 to 1575.85 ng g 121 dw in the summer and winter samples respectively). Also the main emission sources changed, mostly due to the drastic reduction in the emissions by wood burning for domestic heating and to the different meteorological conditions. In summer PAHs degradation was enhanced by intense UV radiation, high temperatures, and presence of ozone. The implications of these findings for the biomonitoring of PAHs pollution are addressed

Interactions of airborne graphene oxides with the sexual reproduction of a model plant: When production impurities matter

The increasing use of graphene-related materials (GRMs) in everyday-life products raises concerns for their possible release into the environment and consequent impact on organisms. GRMs have widely varying effects on plants and, according to recent evidences, graphene oxide (GO) has the potential to interfere with the sexual reproduction owing to its acidic properties and production residues. Here, stigmas of the model plant Cucurbita pepo (summer squash) were subjected to simulated dry depositions of GO and GO purified from production residues (PGO). Stigmas were then hand-pollinated and GRM deposition was checked by ESEM and confocal microscopy. Analysis of stigma integrity, pH homeostasis and pollen-stigma interactions did not reveal negative effects. Fruit and seed production were not affected, but GO depositions of 22.1 ± 7.2 ng mm-2 affected the normal development of seeds, decreasing seed dimensions, seed germination and germination speed. The elemental analysis revealed that GO has significant quantities of production residues, such as strong acids and oxidants, while PGO has only traces, which justifies the differences observed in the effects caused by the two materials. Our results show that GO depositions of up to 11.1 ± 3.6 ng mm-2, which fall within the variation range of total dry particulate matter depositions reported in the literature, are safe for reproduction of C. pepo. This is the first "safety" limit ever recorded for depositions of "out-of-the-box" GO concerning the reproduction of a seed plant. If confirmed for wind-pollinated species, it might be considered for policymaking of GRMs emissions in the air

Graphene oxide impairs the pollen performance of Nicotiana tabacum and Corylus avellana suggesting potential negative effects on the sexual reproduction of seed plants

The production of graphene based materials (GBMs) is steadily increasing but the effects of the possible release of GBMs in the environment are far from being understood. Graphene oxide (GO) is among the most active GBMs and it causes widely varying effects on the vegetative body of seed plants. However, nothing is known yet about its potential effects on the reproductive process. This study addresses the effects of GO on pollen germination and pollen tube elongation in the model species Nicotiana tabacum and in the non-model species Corylus avellana. In vitro germination experiments were conducted without or with GO (control and treated samples, respectively) at concentrations of 25, 50 and 100 μg mL−1. Pollen germination and tube elongation were affected at GO concentrations ≥50 μg mL−1, decreasing by 20% and 19% in N. tabacum and by 68% and 58% in C. avellana, respectively. GO did not affect the viability of N. tabacum pollen, but doubled the frequency of bent tubes. Microscopy observations of pollen tubes exposed to a cellpermeant, dual-excitation ratiometric pH indicator revealed that GO affected the intracellular pH homeostasis. Further germination experiments on C. avellana conducted by inverting the pH conditions of the control and treated (100 μg GO mL−1) samples demonstrated that the main factor influencing the pollen performance is the acidic properties of GO. This might affect the reproductive process of numerous seed plants thus being relevant from an environmental point of view

New features of desiccation tolerance in the lichen photobiont Trebouxia gelatinosa are revealed by a transcriptomic approach.

Trebouxia is the most common lichen-forming genus of aero-terrestrial green algae and all its species are desiccation tolerant (DT). The molecular bases of this remarkable adaptation are, however, still largely unknown. We applied a transcriptomic approach to a common member of the genus, T. gelatinosa, to investigate the alteration of gene expression occurring after dehydration and subsequent rehydration in comparison to cells kept constantly hydrated. We sequenced, de novo assembled and annotated the transcriptome of axenically cultured T. gelatinosa by using Illumina sequencing technology. We tracked the expression profiles of over 13,000 protein-coding transcripts. During the dehydration/rehydration cycle c. 92 % of the total protein-coding transcripts displayed a stable expression, suggesting that the desiccation tolerance of T. gelatinosa mostly relies on constitutive mechanisms. Dehydration and rehydration affected mainly the gene expression for components of the photosynthetic apparatus, the ROS-scavenging system, Heat Shock Proteins, aquaporins, expansins, and desiccation related proteins (DRPs), which are highly diversified in T. gelatinosa, whereas Late Embryogenesis Abundant Proteins were not affected. Only some of these phenomena were previously observed in other DT green algae, bryophytes and resurrection plants, other traits being distinctive of T. gelatinosa, and perhaps related to its symbiotic lifestyle. Finally, the phylogenetic inference extended to DRPs of other chlorophytes, embryophytes and bacteria clearly pointed out that DRPs of chlorophytes are not orthologous to those of embryophytes: some of them were likely acquired through horizontal gene transfer from extremophile bacteria which live in symbiosis within the lichen thallus

Graphene oxide degradation by a white-rot fungus occurs in spite of lignin peroxidase inhibition

This study investigated the degradation of graphene oxide (GO) by the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Axenic fungal suspensions were inoculated in malt extract glucose medium enriched with various concentrations of GO and allowed to grow for several months. Biomass, pH, H2O2 content and activity of laccase (Lac) and lignin peroxidase (LiP) in the culture media were monitored, along with the physicochemical changes of GO over time followed by TEM, Raman, XPS and TGA. Lower concentrations of GO exhibited a stronger stimulating effect on P. chrysosporium growth and the production of Lac and H2O2 compared to higher concentrations, probably due to an excessive parallel increase in GO degradation by-products. The fungus significantly altered the structure of GO, with increase in the Raman D band, although GO neutralized LiP activity, possibly by unspecific adsorption. The activity of isolated LiP, but not of Lac, was suppressed in the presence of GO. Moreover, Lac caused modifications in the GO lattice as evidenced by a significant increase in the ratio between the intensity of the D and G bands of the Raman spectra. This enzyme emerges as a key player in the biodegradation of GRMs within terrestrial ecosystems, as its release extends beyond fungi to several other microorganisms

Safety Assessment of Graphene-Based Materials: Focus on Human Health and the Environment

Graphene and its derivatives are heralded as 'miracle' materials with manifold applications in different sectors of society from electronics to energy storage to medicine. The increasing exploitation of graphene-based materials (GBMs) necessitates a comprehensive evaluation of the potential impact of these materials on human health and the environment. Here we discuss synthesis and characterization of GBMs as well as human and environmental hazard assessment of GBMs using in vitro and in vivo model systems with the aim to understand the properties that underlie the biological effects of these materials; not all GBMs are alike, and it is essential that we disentangle the structure-activity relationships for this class of materials

Meccanismi di risposta di simbionti lichenici allo stress foto-ossidativo

2012/2013I licheni, una simbiosi mutualistica tra un fungo (il micobionte), generalmente un ascomicete, e una o più popolazioni di alghe e/o cianobatteri (il fotobionte) sono considerati forme di vita estremofile in quanto da disidratati possono resistere a condizioni ambientali molto difficili come elevati irraggiamenti solari, scarsa disponibilità d'acqua e di nutrienti e dosi elevate di inquinanti aerodiffusi. Tali fattori di stress tuttavia inducono una sovrapproduzione a livello cellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che se eccede le difese antiossidanti genera stress ossidativo. L'accumulo delle ROS è un fenomeno molto pericoloso perché porta al danneggiamento di importanti macromolecole come lipidi, proteine e DNA ed in casi estremi può condurre anche alla morte cellulare. Sebbene gli effetti dello stress foto-ossidativo nei licheni siano già stati studiati, in questo dottorato di ricerca si è voluto approfondire alcuni aspetti ancora poco chiari relativi alla resistenza dei fotobionti a questo stress e alla resistenza dei licheni allo stress ossidativo indotto dalla presenza di elevate concentrazioni di inquinanti fotochimici come l'ozono (O3). Sul primo filone di ricerca sono stati condotti due studi. Nel primo ci si è focalizzati sugli effetti dello stress foto-ossidativo su parametri fisiologici di vitalità (ChlaF) e di produzione di ROS in un fotobionte lichenico e nella sua controparte lichenizzata. Ciò è stato ottenuto sottoponendo colture axeniche del fotobionte Trebouxia sp. e lobi del lichene Parmotrema perlatum da cui è stato isolato il fotobionte, a diverse combinazioni di umidità relativa e intensità luminose per periodi di tempo crescenti. L'obiettivo di questo studio è stato quello di approfondire le conoscenze sui benefici indotti dalla lichenizzazione nella resistenza al disseccamento e al concomitante stress foto-ossidativo. Il secondo studio invece, strettamente connesso al primo, è focalizzato sulla variazione di espressione genica dell'intero trascrittoma del fotobionte Trebouxia gelatinosa, isolato dal lichene Flavoparmelia caperata (L.) Hale, indotta da eventi di disidratazione e reidratazione. Con questo studio si è voluto individuare ed analizzare i meccanismi molecolari alla base della tolleranza di questo organismo al disseccamento e al concomitante stress fotoossidativo. Sul secondo filone di ricerca invece è stato condotto uno studio sulle risposte fisiologiche, citologiche e biochimiche del lichene Flavoparmelia caperata (L.) Hale sottoposto a fumigazioni con O3 e mantenuto a diversi regimi di idratazione e di umidità relativa ambientale. L'obiettivo di questo studio è stato quello di verificare se la tolleranza di questo lichene allo stress ossidativo derivante dall'esposizione all'O3 dipende da una strategia O3-avoidant, imputabile alla sua inattività metabolica durante le ore della giornata in cui si verifica il picco dell'O3, oppure da una O3-tolerant, dovuta invece alla presenza di un cospicuo ed efficace corredo di difese antiossidanti. Il primo studio ha dimostrato che il fotobionte algale al di fuori della simbiosi è in grado di resistere a livelli elevati di stress foto-ossidativo anche per periodi molto lunghi. Tuttavia è stato confermato che la simbiosi adduce benefici importanti come l'aumento della capacità di estinzione dell'energia accumulata dalle clorofille attraverso meccanismi non fotochimici e un ridotto effetto ossidativo indotto dal disseccamento. Questi risultati ci hanno permesso di sfatare l'ormai consolidata idea che i fotobionti algali, in particolare quelli del genere Trebouxia, siano particolarmente delicati e incapaci di tollerare autonomamente (al di fuori della simbiosi) fattori di stress abiotici come quelli che intervengono durante il disseccamento. Dai risultati del secondo studio è emerso che il fotobionte T. gelatinosa per far fronte alle importanti alterazioni dovute alla perdita d'acqua, si affida soprattutto a meccanismi che intervengono durante la fase di reidratazione. I più importanti coinvolgono molecole di riparazione “chaperone”, e. g. “Heath Shock Proteins”, e proteine della famiglia “Desiccation Related Proteins”, la cui funzione è ancora sconosciuta, ma visto l'elevato numero, la loro diversità intraspecifica e la sensibilità ai cambi di contenuto idrico, sembrano giocare un ruolo molto importante. Paradossalmente invece non sono state osservate alterazioni nell'espressione di geni collegati alle difese antiossidanti, che è sempre rimasta a livelli costitutivi. Ciò è stato interpretato come una strategia che permette all'organismo di avere sempre a disposizione mRNA per la neo-sintesi di nuovi enzimi coinvolti nelle difese antiossidanti. Infine nell'ultimo studio è stata riconfermata l'elevata resistenza del lichene F. caperata allo stress ossidativo derivato dall'esposizione all'O3 in quanto alla concentrazione utilizzata, ovvero il massimo registrato nell'ambiente alle nostre latitudini, non è stato osservato alcun effetto sulla vitalità nonostante sia stata osservata una notevole produzione di ROS. L'effetto ossidativo dell'O3 infatti è stato controbilanciato dalle difese antiossidanti le quali si sono mostrate altamente sensibili all'esposizione ed efficaci anche a bassi contenuti idrici. Lo stress ossidativo derivante da fattori abiotici di origine naturali e antropica dunque sembra essere gestito efficacemente sia dai licheni che dai loro fotobionti isolati, grazie ad efficienti difese antiossidanti e all'intervento di meccanismi di riparazione del danno.XXVI Ciclo198

LICHENI E BIOACCUMULO: VERSO UNA NORMA EUROPEA

L'applicazione delle metodologie di biomonitoraggio delle deposizioni di elementi in traccia mediante licheni \ue8 sempre pi\uf9 diffusa sia a livello nazionale che internazionale. In Italia tali metodologie, pur non essendo previste esplicitamente dalla legislazione vigente, sono saltuariamente introdotte in procedimenti di VIA e AIA su indicazione di enti locali o territoriali e in passato sono state utilizzate anche in alcuni delicati casi di contenzioso ambientale. A loro supporto esiste una vasta letteratura scientifica, e delle linee guida, mentre mancano dei protocolli riconosciuti dagli enti di normazione. Questa situazione ha suggerito la necessit\ue0 di intraprendere un iter di normazione per sviluppare protocolli che uniformino le fasi di progettazione ed esecuzione delle campagne di biomonitoraggio, gli strumenti per l\u2019interpretazione dei dati e che tutelino coloro che li applicano. Questo intervento si prefigge di descrivere lo stato dell\u2019arte sul bioaccumulo in licheni autoctoni e trapianti, evidenziando i limiti e i punti di forza delle nostre conoscenze scientifiche e delle metodologie attualmente applicate. Si ritiene che questa fase di analisi critica, che richiede l\u2019apporto di tutti coloro i quali hanno acquisito esperienze in questo settore, sia da completarsi necessariamente prima o almeno contemporaneamente all\u2019inizio del confronto con gli specialisti individuati dall\u2019ente europeo di normazione (CEN) per l\u2019esame del testo in corso di definizione