Assay of enzymes of clinical and biological significance by an interference free coline biosensor

Choline (Ch) is widely distributed in nature since it is an important source of methyl groups, an essential component of certain lipids and, in the nervous tissue of most organisms, a precursor of acetylcholine, which is a major neurotransmitter. Ch can be selectively determined by detection of H2O2 generated by the choline oxidase (ChO) catalyzed reaction. Several amperometric methods, based on the this reaction, have been developed in order to detect choline or species which determine choline release such as cholinesterase (ChE), acetylcholine (AChE), phospholipase D (PLD) and choline containing phospholipids. Measurement of serum ChE is important to assess liver function and monitor excessive exposure to organophosphorus insecticides[1]. It is also useful in predicting susceptibility to prolonged apnea after the administration of succinylcholine[2]. There are many methods for the measurement of cholinesterase activity including manometric, titrimetric and photometric procedures. The reference procedure for ChE assay is the Ellman colorimetric method[3] in which haemoglobin and glutathione present in erythrocytes act as interfering substances. PLD is widespread in plants as well as in some microorganisms and mammalian tissues and can have multiple effects and significance on cellular functions, such as receptor signal transduction[4] and an important role in postharvest metabolism of plant tissue. Methods published[5] for PLD activity assay have mainly involved the determination of choline by bromothymol blu or by synthetic substrates of PLD. Titrimetric or pH-stat techniques have been described as well as radioassay procedure which is the fastest and most sensitive method but it requires the use of expensive and potentially health hazardous radiolabeled phospholipids. The fundamental role covered by ChE and PLD in clinical and biological fields justifies the increasing interest in developing assay methodologies able to assure sensitivity, accuracy without requiring expensive instrumentation or long procedure time. In this context amperometric biosensors based on ChO play a surely innovative and quite promising role. The techniques reported for immobilizing ChO on the electrode surface are quite laborious. Covalent immobilization on nylon net[6], often coupled to multimembranes assembly[7] in order to preserve the electrode from interference and fouling, besides being complex and time consuming, can cause a certain slowing down of the sensor response. On the contrary a fast response time is an essential requirement for the on line monitoring of analytes in real samples. The aim of the present study was to develop a choline amperometric biosensor easier to realize moreover assuring high enzyme stability, fast response time, anti-interferent and anti-fouling properties. This goal has been reached in our laboratory immobilizing choline oxidase by co-crosslinking on a platinum electrode previously modified by an overoxidized polypyrrole film. Such an immobilization procedure, already reported in the case of a bienzymic sensor based on choline oxidase and acetylcholinesterase co-immobilization on a platinum electrode[8,9], allowed to obtain an immobilized enzyme-layer characterized by high biocomponent stability and good mechanical properties. Moreover the employment of a bilayer made of co-crosslinked choline oxidase and overoxidised polypyrrole assures notable permselectivity[10] allowing the rejection of interferents usually present in real matrices. Such a Ch biosensor, being interference free, has been employed to assay ChE and PLD in real matrices. In order to optimize the sensor response towards the enzyme to be assayed, the influence of experimental variables such as pH of buffer solution, rotation rate of the electrode and the substrate concentration has been studied. The present method, upon optimization, allowed wide linear range up to 0.600 UI/ml in the case of serum ChE (referred to acetylcholine as enzyme substrate) and to 0.33 UI/ml in the case of PLD. Moreover it revealed suitable for assay ChE in serum samples and PLD in plant crude extracts at activities value respectively down to 5x10-4 UI/ml and to 8x10-5 UI/ml. [1] E. Silk, J. King, M. Whittaker, Ann. Clin. Biochem. 16 (1979) 57 [2] A. Dietz, HM Rubinstein, T. Lubrano, Clin. Chem. 19 (1973) 1309 [3] G. L. Ellman et al. Biochem.Pharmacol. 7 (1961) 88-95 [4] J. H. Exton J. Biol. Chem. 272 (1997) 15579 [5] A. J. Morris, A. M. Frohman, J. Engebrecht, Analytical Biochemistry 252 (1997) 1 [6] E. Vrbovà, I. Kroupovà, O. Valentovà, Z. Novotnnà, J. Kas, Analytica Chimica Acta 280 (1993) 43 [7] G. Palleschi, M. Lavagnini, D. Moscone, R. Pilloton, D. D’Ottavio, M. E. Evangelisti Biosensors & Bioelectronics 5 (1990) 27 [8] A. Guerrieri, G.E. De Benedetto, F.Palmisano, P.G. Zambonin, Analyst 120 (1995) 2731 [9] A. Guerrieri, F. Palmisano, Anal. Chem. 73 (2001) 2875 [10] A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Biosensors & Bioelectronics 13 (1) (1998) 10

Electrophoretic protein deposition: a new enzyme immobilization method for the development of amperometric biosensors

Electrodeposition is an enzyme immobilization method based on the well-known electrophoretic phenomena of proteins under the influence of an electrical field. In the original method, the enzyme is mixed to a collagen dispersion at a pH value different from their isoelectric points to form macromolecular complexes which migrate to, and deposit on, an electrode surface held at an appropriate electric potential. In spite of the interest of such a method, quite similar to the enzyme entrapment in electrosynthesized polymers, the so-called "electrochemical immobilization", up to now few papers have been devoted on this subject. These studies do not deal with the understanding of both chemical and electrochemical processes involved in protein electrodeposition, which are particularly significant for the proper development of biosensors. For example, a study of a suitable electrochemical technique, able to control the protein deposition while minimizing the undesirable but collateral faradaic processes (i.e. O2 evolution), cannot be found in the relevant literature. More important, the realization of an useful biosensor, free of interference and fouling problems (which arise in real matrices analysis) has not yet been achieved with this approach. The electrodeposition method, herewith called "electrophoretic protein deposition" (EPD), has been investigated in our laboratory with the aim to develop a novel approach in amperometric biosensor realization. The influence of some chemical and electrochemical parameters on the protein deposition has been studied with several electrochemical methodologies. Galvanodynamic and potentiodynamic techniques have been compared in terms of membrane quality, thickness and spatial control of protein deposition. An electrochemical quartz crystal microbalance study permitted further insights about the growth of proteic deposit on the electrode surface. The enzyme electrodes so obtained have been further characterized to realize the feasibility of EPD procedure for the development of an useful biosensor. In this respect, the realization of amperometric biosensors using the hybrid approach has been drawn out to this novel enzyme immobilization procedure. In particular, EPD of co-crosslinked bovine serum albumin/glucose oxidase membranes coupled with electrosynthesized non-conducting films of poly-2-naphthol or poly-o-aminophenol permitted the realization of glucose biosensors with anti-interference and anti-fouling performances so interesting to assure a future employment for real sample analysis

A Crosstalk- and Interferent-Free Dual Electrode Amperometric Biosensor for the Simultaneous Determination of Choline and Phosphocholine

Choline (Ch) and phosphocholine (PCh) levels in tissues are associated to tissue growth and so to carcinogenesis. Till now, only highly sophisticated and expensive techniques like those based on NMR spectroscopy or GC/LC- high resolution mass spectrometry permitted Ch and PCh analysis but very few of them were capable of a simultaneous determination of these analytes. Thus, a never reported before amperometric biosensor for PCh analysis based on choline oxidase and alkaline phosphatase co-immobilized onto a Pt electrode by co-crosslinking has been developed. Coupling the developed biosensor with a parallel sensor but specific to Ch, a crosstalk-free dual electrode biosensor was also developed, permitting the simultaneous determination of Ch and PCh in flow injection analysis. This novel sensing device performed remarkably in terms of sensitivity, linear range, and limit of detection so to exceed in most cases the more complex analytical instrumentations. Further, electrode modification by overoxidized polypyrrole permitted the development of a fouling- and interferent-free dual electrode biosensor which appeared promising for the simultaneous determination of Ch and PCh in a real sample

Comportamento elettrochimico di polimeri compositi poli(anilina)/poli(stirensolfonato) a pH neutri: influenza dello spessore del film

A differenza della maggior parte dei polimeri conduttori, per i quali si osserva una sola transizione conduttore/isolante, la poli(anilina) (PANI) passa, per ossidazione elettrochimica in soluzione acquosa acida, dallo stato isolante (leucoemeraldina) allo stato conduttore (emeraldina) e nuovamente ad uno stato isolante (pernigranilina). In più le sue proprietà conduttrici dipendono anche dalla protonazione del polimero cosicché è possibile osservare anche una transizione conduttore/isolante a seguito della deprotonazione dell'emeraldina. E' evidente che quest'ultimo comportamento limita significativamente l'impiego del PANI in un ristretto intervallo di pH acidi. Tale limitazione è in parte superabile con la realizzazione di film compositi di PANI, ottenuti per polimerizzazione elettrochimica in presenza di polianioni quali il poli(vinilsolfonato) o il poli(stirensolfonato) (PSS). L'anione polimerico infatti, essendo intrappolato all'interno della matrice polimerica, non può essere scambiato con gli anioni presenti in soluzione il che assicura quindi un apprezzabile grado di protonazione del PANI anche in soluzioni con bassa concentrazione protonica. Incidentalmente, tali polimeri compositi rivestono grande importanza nel campo della bioelettrochimica in quanto sono in grado di promuovere il trasferimento elettronico diretto di taluni enzimi [1] in condizioni tali da non precludere la stabilità di questi ultimi. Essi pertanto sono utilizzabili per la realizzazione di dispositivi innovativi quali ad esempio i "transistor elettrochimici" [2]. La presente comunicazione intende illustrare uno studio sul comportamento elettrochimico a pH neutri di un film composito PANI/PSS, elettrosintetizzato potenziostaticamente in presenza di un monomero para sostituito, quale l'1,4-diamminobenzene, in grado di promuovere la formazione di gruppi fenazinici (mediatori efficaci per una vasta serie di enzimi) in seguito ad accoppiamenti di tipo orto all'interno del polimero e successiva ciclizzazione [3]. Questo studio ha evidenziato la capacità dell'1,4-diamminobenzene di modulare il grado di cross-linking del polimero risultante, la sua struttura e quindi la sua elettroattività. In particolare il comportamento elettrochimico del polimero è risultato fortemente influenzato dal suo spessore. Infatti si è osservato un grado di elettroattività apprezzabile solo per film polimerici sottili: ciò suggerisce che gli accoppiamenti orto sembrano prevalere all'inizio del processo di elettrosintesi garantendo così una struttura compatta con alto grado di cross-linking. Questa indagine ha permesso la realizzazione di film compositi PANI/PSS elettroattivi e stabili a pH neutri, ad elevato carattere fenazinico e quindi di sicuro interesse in campo bioelettrochimico. [1] Bartlett, P. N.; Wang, J. H. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1996, 92, 4137 [2] Bartlett, P. N.; Birkin, P. R. Anal. Chem. 1994, 66, 1552 [3] Mailhe, C.; Desilvestro, J. J. Electroanal. Chem. 1989, 262, 28

Biosensore amperometrico per la L-lisina basato su co-crosslinking di lisina-ossidasi su elettrodi di Pt modificati con polipirrolo overossidato

La determinazione dell’aminoacido essenziale L-lisina è di particolare interesse in campo biochimico, biotecnologico ed alimentare poichè, ad es., i suoi livelli sono in genere associabili, rispettivamente, a talune disfunzioni patologiche ed alle qualità nutrizionali di un prodotto alimentare. In questo contesto, l’impiego di metodi enzimatici specifici, basati su elettrodi ad enzima immobilizzato, costituisce certamente una valida alternativa alle metodiche analitiche convenzionali. Diversi biosensori per la determinazione della lisina sono descritti in letteratura. White e Guilbault [1] hanno esplorato la determinazione potenziometrica della lisina accoppiando elettrodi a CO2 con la lisina-decarbossilasi mentre Dempsey et al. [2] hanno sviluppato un biosensore amperometrico immobilizzando la lisina-deidrogenasi su elettrodi di Pt. Sfortunatamente, il metodo potenziometrico è limitato dall’interferenza dovuta alla CO2 atmosferica che ne riduce notevolmente la sensibilità mentre il secondo necessita la presenza dell’NAD+ come cofattore e di un mediatore in soluzione. Conseguentemente, l’approccio più efficiente risulta essere quello amperometrico basato sull’impiego della L-lisina-α-ossidasi che catalizza l’ossidazione dell’aminoacido ad α-cheto-ε-aminocaproato, ione ammonio ed acqua ossigenata. Nella realizzazione di un biosensore è preliminare lo sviluppo e l’ottimizzazione di una metodica di immobilizzazione enzimatica efficiente, in grado di assicurare un notevole grado di stabilità dell’enzima immobilizzato ed elevate attività. Diverse tecniche di immobilizzazione sono state esplorate per la lisina ossidasi quali ad es. l’immobilizzazione covalente su nylon [3] o membrane preattivate [4], l’intrappolamento in collagene [5], il crosslinking [6] o il co-crosslinking [7] dell’enzima su elettrodi di Pt modificati con 1,2-diaminobenzene. In particolare, il co-crosslinking è una tecnica di immobilizzazione particolarmente versatile e vantaggiosa in quanto applicabile ad una vasta gamma di enzimi e facilmente adattabile alle geometrie elettrodiche usualmente utilizzate nei rivelatori elettrochimici in batch ed in flusso. Biosensori per colina ed acetilcolina [8], ad es., sono stati realizzati immobilizzando il sistema bienzimatico acetilcolinesterasi/colina ossidasi su elettrodi di Pt mediante co-crosslinking con albumina di siero bovina e glutaraldeide; ancora, lo stesso approccio ha permesso la realizzazione di un biosensore interference and fouling-free per il glucosio [9] basato su un doppio strato costituito da glucosio ossidasi co-crosslinked e polipirrolo overossidato. Nel laboratorio degli autori è stato di recente messo a punto un nuovo biosensore per la determinazione della lisina in campioni di interesse farmacologico ed alimentare basato su co-crosslinking della lisina ossidasi con una proteina inerte quale l’albumina di siero bovino e la glutaraldeide come crosslinker. Uno studio delle concentrazioni ottimali di enzima, proteina inerte e crosslinker ha permesso la realizzazione su elettrodi di Pt di una membrana ad elevata attività enzimatica ed al tempo stesso meccanicamente stabile tanto da permetterne l’applicazione per analisi in flusso. Il sensore così realizzato ha evidenziato un valore di sensibilità relativamente elevato, pari a circa 1.4 µA/mM mm2, un range lineare esteso sino a circa 0.6 mM, un breve tempo di risposta (6-7 secondi) ed una stabilità tale da consentire un impiego in continuo per più di 40 giorni senza apprezzabile variazione della sensibilità. Una caratterizzazione elettroanalitica del biosensore ha consentito di stimare un valore di KM apparente pari a circa 2.1 ± 0.2 mM ed, al tempo stesso, ha evidenziato uno spiccato controllo diffusivo, difficilmente riscontrabile nei dispositivi basati sulla immobilizzazione elettrochimica. In particolare, questo studio ha messo in evidenza la possibilità di modulare il comportamento cinetico dell’elettrodo da diffusivo a enzimatico variando il pH dell’elettrolita di supporto. E’ possibile quindi nel presente caso ottimizzare le performances del biosensore senza modificare variabili complesse quali la concentrazione dell’enzima immobilizzato e lo spessore e la permeabilità al substrato della membrana enzimatica. Nonostante gli enzimi siano notoriamente specifici nei confronti di un singolo substrato, la lisina-ossidasi catalizza in soluzione, seppur con rese inferiori, anche l’ossidazione di altri aminoacidi [10], quali l’ornitina, la fenilalanina e l’arginina, che potrebbero interferire nella determinazione della lisina. Sebbene l’approccio più usuale per ovviare a questo inconveniente sia quello di selezionare la fonte dell’enzima [7] in base alla sua maggiore specificità, il presente studio ha evidenziato che un opportuno controllo cinetico del sensore, variando il pH e/o la velocità di flusso, permette con un comune enzima commerciale specificità ottimali se non migliori a quelle riscontrabili con enzimi selezionati da fonti opportune. La codeposizione sull’elettrodo di un polimero permselettivo elettrosintetizzato [9], ha infine permesso la realizzazione di un biosensore per L-lisina, scevro da interferenza ed avvelenamento, tramite elettrodeposizione di una membrana polimerica permselettiva basata su polipirrolo overossidato. Riferimenti 1. W. C. White, G. Guilbault, Anal. Chem., 50 (1978) 1481 2. E. Dempsey, J. Wang, V. Wollenberg, M. Ozsos, M. R. Smith, Biosensors and Bioelectronics, 7 (1992) 323 3. E. Vrbovà e M. Marek, Anal. Chim. Acta, 239 (1990) 263 4. M. G. Lavagnini, D. Moscone, G. Palleschi, D. Compagnone, C. Cremisini, Talanta, 40(8) (1993) 1301 5. E. Vrbovà e M. Marek, Collect. Czech. Chem. Commun., 55 (1990) 2568 6. A. Curulli, S. Kelly, C. O’Sullivan, G. G. Guilbaut, G. Palleschi, Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 1245 7. S. C. Kelly, P. J. O’Connell, C. K. O’Sullivan, G. G. Guilbaut, , Anal. Chim. Acta, 412 (2000) 111 8. A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Analyst, 120 (1995) 2731 9. A. Guerrieri, G. E. De Benedetto, F. Palmisano, P. G. Zambonin, Biosensors & Bioelectronics, 13 (1) (1998) 103 10. H. Kusakabe, K. Kodama, A. Kuminaka, H. Yoshimo, H. Misono, K. Soda, J. Biol. Chem., 255 (1980) 97

An Amperometric Biosensor Based on a Bilayer of Electrodeposited Graphene Oxide and Co-Crosslinked Tyrosinase for L-Dopa Detection in Untreated Human Plasma

L-Dopa, a bioactive compound naturally occurring in some Leguminosae plants, is the most effective symptomatic drug treatment for Parkinson’s disease. During disease progression, fluctuations in L-DOPA plasma levels occur, causing motor complications. Sensing devices capable of rapidly monitoring drug levels would allow adjusting L-Dopa dosing, improving therapeutic outcomes. A novel amperometric biosensor for L-Dopa detection is described, based on tyrosinase co-crosslinked onto a graphene oxide layer produced through electrodeposition. Careful optimization of the enzyme immobilization procedure permitted to improve the long-term stability while substantially shortening and simplifying the biosensor fabrication. The effectiveness of the immobilization protocol combined with the enhanced performances of electrodeposited graphene oxide allowed to achieve high sensitivity, wide linear range, and a detection limit of 0.84 μM, suitable for L-Dopa detection within its therapeutic window. Interference from endogenous compounds, tested at concentrations levels typically found in drug-treated patients, was not significant. Ascorbic acid exhibited a tyrosinase inhibitory behavior and was therefore rejected from the enzymatic layer by casting an outer Nafion membrane. The proposed device was applied for L-Dopa detection in human plasma, showing good recoveries

A Critical Overview of Enzyme-Based Electrochemical Biosensors for L-Dopa Detection in Biological Samples

L-Dopa is an intermediate amino acid in the biosynthesis of endogenous catecholamines, such as dopamine. It is currently considered to be the optimal dopaminergic treatment for Parkinson’s disease, a neurodegenerative disorder affecting around 1% of the population. In an advanced stage of the disease, complications such as dyskinesia and psychosis are caused by fluctuations in plasma drug levels. Real-time monitoring of L-Dopa levels would be advantageous for properly adjusting drug dosing, thus improving therapeutic efficacy. Electrochemical methods have advantages such as easyto- use instrumentation, fast response time, and high sensitivity, and are suitable for miniaturization, enabling the fabrication of implantable or wearable devices. This review reports on research papers of the past 20 years (2003–2023) dealing with enzyme-based biosensors for the electrochemical detection of L-Dopa in biological samples. Specifically, amperometric and voltammetric biosensors, whose output signal is a measurable current, are discussed. The approach adopted includes an initial study of the steps required to assemble the devices, i.e., electrode modification and enzyme immobilization. Then, all issues related to their analytical performance in terms of sensitivity, selectivity, and capability to analyze real samples are critically discussed. The paper aims to provide an assessment of recent developments while highlighting limitations such as poor selectivity and long-term stability, and the laborious and time-consuming fabrication protocol that needs to be addressed from the perspective of the integrated clinical management of Parkinson’s disease

Impiego dell'elettroforesicapillare per la caratterizzazione di microrganismi: l'analisi di ceppi di Saccharomyces cerevisiae

La possibilità di analizzare e determinare microrganismi, quali batteri e lieviti, in maniera rapida e riproducibile, suscita notevole interesse scientifico data la loro versatilità nel campo della ricerca e dell’industria. Rispetto alle classiche tecniche impiegate in microbiologia, i metodi basati sull’elettroforesi capillare appaiono a tutt'oggi alquanto promettenti poiché in grado non solo di separare con elevata efficienza molecole, ma anche particelle colloidali e quindi cellule. In particolari condizioni, infatti, le cellule microbiche evidenziano in superficie una propria carica netta, grazie alla composizione della loro parete cellulare, e conseguentemente si comportano alla stregua dei colloidi [1,2] il ché rende possibile la loro analisi elettroforetica [2-4]. Nella presente attività di ricerca è stato messo a punto un originale metodo di analisi basato su elettroforesi capillare con rivelazione a diode array applicato alla caratterizzazione di ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae. L'implementazione della metodica ha previsto l'ottimizzazione di una serie di parametri elettroforetici quali ad es. la viscosità del tampone di corsa, il volume di campione e l’intensità del campo elettrico applicato. Successivamente si è focalizzato l’interesse sullo studio del comportamento elettroforetico di diversi ceppi di Saccharomyces cerevisiae cresciuti in terreno liquido YPD (Yeast extract, Peptone, D-glucose). Lo studio ha evidenziato una variabilità significativa dei profili elettroforetici, imputata alle differenti velocità di crescita di ciascun ceppo. In particolare, la crescita del ceppo selvaggio 4LBI3 ha evidenziato, inoltre, che esiste una relazione tra il profilo elettroforetico e la fase di crescita in cui si trova la popolazione cellulare esaminata. L’analisi delle dimensioni cellulari mediante microscopia ottica ha evidenziato infine una correlazione tra il profilo elettroforetico del campione e l’effettiva eterogeneità dimensionale della popolazione cellulare analizzata. I risultati sperimentali ottenuti dimostrano la validità dell’elettroforesi capillare per lo studio delle dinamiche di crescita dei lieviti e ne incoraggiano una futura applicazione per analisi quantitative anche di altre specie microbiche. [1] Radko S.P., Chrambach A., Electrophoresis, (2002) 23: pp. 1957-1972 [2] Rodriguez M.A., Armstrong D.W., J. of Chromatography B, 800, 7 (2004). [3] Armstrong D.W., Girod L.H., Rodriguez M.A. et al., Analy. Chem., 74, 5523 (2002). [4] Armstrong D.W., Schulte G., Schneiderheinze J.M., Westenberg D.J., Anal. Chem., 71, 5465 (1999)

Legal Cannabis sativa L. Dried Inflorescences: Cannabinoids Content and Cytotoxic Activity against Human HepG2 Cell Line

Cannabis sativa L. has health benefits, principally due to the levels and ratios of two impor- tant cannabinoids, ∆9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD). THC:CBD ratio affects their pharmacological interaction for the treatment of different diseases as well as its modulation allows for a custom-made product that utilizes the distinguishing effects of CBD, THC, or both, for a peculiar patient or clinical effect. This study aims to investigate the total content of THC, CBD, and their ratio in 34 dried inflorescence legally sold in physical and online stores, by using a validated liquid chromatography-ultraviolet (HPLC-UV) method, after cannabinoids identification performed through MSn studies. Cannabinol (CBN) content was also monitored to evaluate hemp age or con- servation status. CBN content always resulted lower than limit of quantification, thus confirming well-stored fresh hemp. All investigated samples showed a total THC amount below 0.59% w/w, thus responding to legal requirements.. The total CBD amount ranged from 2.62 to 20.27% w/w and it was not related to THC level. THC:CBD ranged among 1:3 and 1:26, thus ascertaining their suitability for different target pharmacological uses. In vitro studies using human hepatoblastoma cell line HepG2 suggested that hemp extracts with THC:CBD ratios of 1:9 exhibited higher toxicity than pure cannabinoids

A validated LC–MS/MS method for quantitative determination of L-dopa in Fagioli di Sarconi beans (Phaseolus vulgaris L.)

An analytical method based on ultrasound assisted extraction (UAE) and liquid chromatography 36 coupled to electrospray tandem mass spectrometry (LC–ESI/MS/MS) was validated and applied for 37 determining L-dopa in four ecotypes of Fagioli di Sarconi beans (Phaseolus vulgaris L.), marked 38 with the European label PGI (Protected Geographical Indication). The selectivity of the proposed 39 method was ensured by the specific fragmentation of the analyte. Simple isocratic chromatographic 40 conditions and mass spectrometric detection in multiple reaction monitoring (MRM) acquisition 41 mode were used for sensitive quantification. The LC–ESI/MS/MS method was validated within a 42 linear range of 0.001–5.000 μg/mL. Values of 0.4 and 1.1 ng/mL were obtained for limit of detection 43 and limit of quantification, respectively. The repeatability, inter-day precision and recovery values 44 ranges were 0.6-4.5%, 5.4-9.9%, 83-93 %, respectively. Fresh and dried beans cultivated exclusively 45 with organic methods avoiding any synthetic fertilizers and pesticides, as well as pods, were analyzed 46 showing a L-dopa content ranging from 0.020±0.005 μg/g to 2.34±0.05 μg/g dry weight