Miméticos de hemácias como sistemas de liberação de hidrolisados de hemoglobina com atividades antitumorais in vitro

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Ciências Biológicas, 2013.Devido à alta taxa de mortalidade por câncer todos os anos e em virtude dos tratamentos frequentemente utilizados causarem severos efeitos adversos devido à sua ação em células sadias, surge a necessidade pela busca por agentes ativos mais específicos para as células tumorais bem como a busca por mecanismos de transportes de bioativos mais eficientes. Nesse sentido o desenvolvimento de sistemas estruturados em hemácias torna-se promissor uma vez que essas células podem fornecer o arcabouço para o transporte desses ativos bem como fornecer peptídeos com atividade antitumoral a partir da hidrólise da hemoglobina. O objetivo do presente estudo foi desenvolver sistemas de liberação e entrega de hidrolisados de hemoglobina com ações antitumorais utilizando hemácias e avaliar seus efeitos sobre linhagens de células tumorais (4T1) e normais de mamíferos (NIH3T3), in vitro. O hidrolisado de hemoglobina livre, bem como o hidrolisado encapsulado em sistemas miméticos baseados em hemácias, lipossomos, partículas de quitosana e partículas de quitosana com polietilenoglicol tiveram suas características avaliadas por microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de varredura, espalhamento de luz dinâmico e suas possíveis atividades foram testadas contra células de câncer de mama e fibroblasto. O hidrolisado tríptico de hemoglobina livre não diminuiu expressivamente in vitro a viabilidade de células 4T1 e NIH3T3. Os miméticos de hemácias na ausência e presença do hidrolisado de hemoglobina apresentaram formas irregulares, tamanho micrométrico, alta polidispersividade (0,66 a 1,0) e citotoxicidade contra células NIH3T3 (17%) na ausência do hidrolisado de hemoglobina e contra células 4T1 na presença do hidrolisado. Os miméticos de hemácias bem como os lipossomos também apresentaram carga de superfície negativa e se mostraram instáveis coloidalmente. Adicionalmente, apresentaram tamanhos micrométricos e nanométricos, respectivamente. Todos os outros sistemas apresentaram tamanhos nanométricos, polidispersividade na faixa de 0,34 a 1,0 e boa estabilidade coloidal (±40 a >±60). Partículas de quitosana e quitosana com PEG apresentaram carga superficial positiva e alta estabilidade coloidal. Todos os sistemas nanométricos (lipossomos e baseados em quitosana) apresentaram taxa de encapsulamento entre 78- 89%, sendo que os lipossomos induziram maior diminuição na viabilidade (51%, P± 60). Chitosan and chitosan particles with PEG showed positive surface charge and high colloidal stability. All systems showed nanosized encapsulation rate between 78-89%, and the liposomes induced greater decrease in viability (51%, P <0.05) of 4T1 cells. From the results, it was observed that although most of the tested systems have not significantly altered the viability of tumor cells, the development of nanosystems using building-blocks endogenously found in organisms, such as red blood cells, is a promising strategy as alternative and / or complementary anticarcinogenic treatments

Desenvolvimento e avaliação de atividades biológicas in vitro e in vivo de micro- e nanopartículas de prata obtidas por síntese verde utilizando plantas do Cerrado

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016.Síntese verde é o nome dado às rotas de síntese relativamente atóxicas, que utilizam reagentes químicos biodegradáveis e de custo baixo para sintetizar nanomateriais, tendo como iniciador da rota, um componente biológico, dentre eles as plantas. O Cerrado possui uma vasta diversidade de plantas compostas por arsenais fitoquímicos que podem ser explorados na síntese verde de nanopartículas metálicas (NPMs). Dentre os metais utilizados para a síntese de NPMs, a prata tem sido amplamente utilizada devido às suas diversas propriedades, dentre elas a atividade antimicrobiana de amplo espectro. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de rotas exploratórias de síntese verde para produção de micro- e nanopartículas de prata (AgMPs e AgNPs) utilizando 91 extratos aquosos obtidos a partir de fruto (cajuzinho do Cerrado) e/ou folhas de plantas do Cerrado. O monitoramento da formação de AgNPs por espectroscopia de absorção indicou potencial redutor do extrato obtido a partir do fruto/nozes de Anacardium othonianum como uma função da temperatura de reação. As AgNPs sintetizadas apresentaram tamanhos variados; índices de polidispersividade (PdI) moderados; potencial Zeta de superfície baixo a moderado; formato esférico; e ausência de efeito citotóxico pronunciado para leveduras Saccharomyces cerevisiae. Dos extratos obtidos a partir das folhas de 90 espécies de plantas pertencentes a 41 diferentes famílias, ~77% foram capazes de reduzir expressivamente Ag+ em Ag0, formando partículas. As AgNPs e AgMPs apresentaram diâmetros hidrodinâmicos variados com 61% das suspensões coloidais apresentando estruturas dentro da faixa nanométrica (10 a 100 nm); PdI variado, sendo 40% indicativo de monodispersão (0,1 a 0,3); potencial Zeta negativo variável, sendo que 87% foram coloidalmente portadoras de instabilidade incipiente (-10 a -30 mV). Todas as partículas inibiram in vitro o crescimento de bactérias Escherichia coli em concentrações micromolares, e apenas 66,67% inibiram o crescimento de Staphylococcus aureus, sendo mais efetivas contra bactérias Gram-negativas em relação a bactérias Gram-positivas. A rota de síntese desenvolvida com extrato aquoso das folhas de Caryocar brasiliense (CbC - Pequi) foi selecionada com base em critérios racionais para dar continuidade e aprofundamento a estudos confirmatórios. As AgNPs produzidas por essa rota (AgNPs-CbC) se mostraram altamente reprodutíveis (pequena variação entre lotes e época de coleta das folhas), estáveis (pelo menos 1,5 anos), passíveis de escalonamento (5-500 mL) e de serem dissolvidas em condições controladas (peróxido de hidrogênio). Além disso, foi possível identificar alguns dos compostos possivelmente relacionados ao processo de redução e estabilização das AgNPs-CbC, dentre os quais estão flavonoides, taninos e outros compostos orgânicos. Ensaios in vitro demonstraram que as AgNPs-CbC inibiram o crescimento de leveduras Candida albicans, e foram mais efetivas contra bactérias Escherichia coli (Gram-negativa) do que Staphylococcus aureus (Grampositiva). Ensaios de viabilidade celular indicaram diminuição da viabilidade de células de fibroblastos murino (NIH3T3) (14,6%), células de câncer de mama humano (MCF-7) (24,4%), macrófagos peritoneais murinos (C57Bl/6) (51,5%) e células de insetos (Sf21) (65%); e apresentaram taxa hemolítica baixa (1,5%) quando expostas às AgNPs-CbC na concentração de 100 μM. As AgNPs-CbC apresentaram efeito nematicida contra Caenorhabditis elegans e Meloidogyne incognita em concentrações muito mais baixas do que as observadas para outros organismos; e não indicaram feitos toxicológicos sob os pontos de vista anatômicos e bioquímicos em plantas Nicotiana tabacum. Ensaios in vivo controlaram em 85% a infestação por M. incognita em plantas de tabaco sem alterar os parâmetros anatômicos e bioquímicos (clorofila e peroxidação lipídica). Adicionalmente, as AgNPs-CbC em concentração de 64 μM administradas por via intravenosa em camundongos não desencadearam alterações nos perfis hematológicos (hemograma e leucograma), bioquímicos [gama glutamil transpeptidase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotrasferase (ALT), bilirrubina total (TBIL) e lipidograma] e morfológicos (fígado, baço, rim e pulmão). Um método racional, comparativo e em etapa única foi desenvolvido para síntese de partículas de prata utilizando extratos obtidos a partir de plantas do Cerrado, sendo que o método e abordagens apresentadas direcionam para um alto potencial biotecnológico dessa plataforma sustentável de para produção de nanomateriais.Green synthesis is the common name given to the relatively non-toxic synthetic routes, using biodegradable and inexpensive chemicals to synthesize nanomaterials, and with a biological organism as the primary source or initiator of the route, among them plants. The Cerrado has a wide diversity of plants composed by phytochemical arsenals that can be exploited in the green synthesis of metallic nanoparticles (NPMs). Among the metals used for the synthesis of NPMs, silver has been widely used because of its diverse properties, among them a broad spectrum of antimicrobial activity. The aim of the present study was the development of exploratory routes of green synthesis to produce silver micro- and nanoparticles (AgMPs and AgNPs) using 91 aqueous extracts obtained from fruit (Cerrado cashew) and/or leaves of Cerrado plants. The monitoring of the formation of AgNPs by absorption spectroscopy indicated the reducing potential of the extract obtained from the fruit/nuts of Anacardium othonianum as a function of the reaction temperature. The AgNPs obtained had varying sizes; moderate polydispersity indexes (PdI); low to moderate surface Zeta potential; spherical shape; and absence of pronounced cytotoxic effect against Saccharomyces cerevisiae yeasts. From the extracts obtained from the leaves of 90 species of plants belonging to 41 different families, ~77% were able to expressively reduce Ag+ into Ag0, forming particles. The AgNPs and AgMPs presented varying hydrodynamic diameters, with 61% of the colloidal suspensions presenting structures within the nanometric range (10 to 100 nm); PdI varied, with 40% indicative of monodispersion (0.1 to 0.3); variable negative Zeta potential, with 87% colloidally carrying incipient instability (-10 to -30 mV). All particles inhibited in vitro the growth of Escherichia coli bacteria at micromolar concentrations, and only 66.67% inhibited the growth of Staphylococcus aureus, being more effectives against Gram-negative bacteria compared to Gram-positive bacteria. The route of synthesis developed with aqueous extract of the leaves from Caryocar brasiliense (CbC) was selected based on a rational criteria to give continuity and deepening to confirmatory studies. The AgNPs produced by this route (AgNPs-CbC) showed to be highly reproducible (small variation between lots and time of collection of leaves), stable (at least 1.5 years), scalable (5-500 mL), and being possible to be dissolved under controlled conditions (hydrogen peroxide). In addition, it was possible to identify some of the compounds possibly related to the process of reduction and stabilization of AgNPs-CbC, among which are flavonoids, tannins and other organic compounds. In vitro assays demonstrated that AgNPs-CbC inhibited the growth of Candida albicans yeasts, and were more effective against Escherichia coli (Gram-negative) than Staphylococcus aureus (Gram-positive) bacteria. Cell viability assays indicated decreased viability of murine fibroblast cells (NIH3T3) (14%), human breast cancer cells (MCF-7) (24%), murine peritoneal macrophages (C57Bl/6) (51%) and insect cells (Sf21) (65%); and presented a low hemolytic rate (1.5%) when exposed to the AgNPs-CbC in the concentration of 100 μM. AgNPs-CbC showed a nematicidal effect against Caenorhabditis elegans and Meloidogyne incognita at concentrations much lower than those observed for other organisms; and did not indicate anatomical and biochemical toxicological effects on Nicotiana tabacum plants. In vivo assays controlled in 85% the infestation in tobacco plants by M. incognita without altering the anatomical and biochemical parameters (chlorophyll and lipid peroxidation). In addition, AgNPs-CbC in concentrations of 64 μM administered intravenously in mice did not trigger changes in hematological (hemogram and leukogram), biochemical profiles (gamma glutamyl transpeptidase (GGT), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total bilirubin (TBIL) and lipidogram] and morphological (liver, spleen, kidney and lung) profiles. A rational, comparative and single step method was developed for the synthesis of silver particles using extracts obtained from Cerrado plants, and the method and approaches suggested a high biotechnological potential of this sustainable platform for production of nanomaterials.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia Anima

Rapid and Versatile Biosensing of Liposome Encapsulation Efficiency Using Electrical Conductivity Sensor

Liposomes are prominent nanosystems for drug delivery, with potential extending beyond isolated drugs. Ethanol-aqueous plant extracts can be encapsulated within liposomes to protect bioactive compounds (secondary metabolites) from rapid oxidation and enable sustained release. Determining which compound classes are present in each extract and the encapsulation efficiency (EE) of these extracts in liposomes is crucial for nanocarrier functionality. This involves assessing the ratio of bioactive substances within liposomes to the total content. However, quantifying EE for non-isolated compounds poses challenges due to the need for advanced analytical equipment and biosensing approaches. This study introduces an innovative method for EE quantification, using a conductivity electrode (k = 0.842/cm) to establish an EE biosensing technology. By correlating dynamic light scattering (DLS), zeta potential (ZP), and electrical conductivity (Cnd) data with the conductivity meter’s calibration curve, a robust relationship between the free extract concentration and Cnd (r2 ≥ 0.950) was established. Lavender-loaded liposomes demonstrated an EE of 56.33%, while wormwood and oregano formulations exhibited high EEs of 94.33% and 91.70%, respectively. In contrast, sage-loaded liposomes exhibited an inadequate EE, encapsulating only approximately 0.57% of the extract. The straightforward quantification of the free extract within liposome formulations, compared to more complex approaches, could facilitate EE determination and support future characterizations

Liposomes Composed by Membrane Lipid Extracts from Macrophage Cell Line as a Delivery of the Trypanocidal N,N’-Squaramide 17 towards Trypanosoma cruzi

Chagas is a neglected tropical disease caused by Trypanosoma cruzi, and affects about 25 million people worldwide. N, N&rsquo;-Squaramide 17 (S) is a trypanocidal compound with relevant in vivo effectiveness. Here, we produced, characterized, and evaluated cytotoxic and trypanocidal effects of macrophage-mimetic liposomes from lipids extracted of RAW 264.7 cells to release S. As results, the average hydrodynamic diameter and Zeta potential of mimetic lipid membranes containing S (MLS) was 196.5 &plusmn; 11 nm and &minus;61.43 &plusmn; 2.3 mV, respectively. Drug entrapment efficiency was 73.35% &plusmn; 2.05%. After a 72 h treatment, MLS was observed to be active against epimastigotes in vitro (IC50 = 15.85 &plusmn; 4.82 &mu;M) and intracellular amastigotes (IC50 = 24.92 &plusmn; 4.80 &mu;M). Also, it induced low cytotoxicity with CC50 of 1199.50 &plusmn; 1.22 &mu;M towards VERO cells and of 1973.97 &plusmn; 5.98 &mu;M in RAW 264.7. MLS also induced fissures in parasite membrane with a diameter of approximately 200 nm in epimastigotes. MLS showed low cytotoxicity in mammalian cells and high trypanocidal activity revealing this nanostructure a promising candidate for the development of Chagas disease treatment