Folat Rezeptor alpha vermittelte Aufnahme von Photosensibilisator-Konjugaten und die Phototoxizität der Folsäure

Ein aufstrebender Ansatz in der Tumortherapie ist die Photodynamische Therapie (PDT), bei der Photosensibilisatoren (PS) eingesetzt werden, die nach Bestrahlung zell- und gewebstoxische Moleküle, wie zum Beispiel reaktive Sauerstoffspezies (ROS), generieren. Für eine höhere Spezifität sollten Tumorzellen adressiert werden. Hierfür wurde ausgenutzt, dass viele Krebszellen den Folsäure-Rezeptor α (FRα) überexprimieren, der Folsäure (FS) und alles was daran gebunden ist endozytotisch in die Zelle aufnimmt. Zum Transport der PS wurden dabei hochmolekulare Vehikel verwendet, um bei späterer Anwendung den Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effekt ausnutzen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Transportsysteme charakterisiert: Im ersten System wurden Albumin-FS-Konjugate kovalent an geladene PS gebunden. Exemplarisch wurde hier mit β Carbolin Derivaten gearbeitet. Wir konnten zeigen, dass die kovalente Bindung von FS und einem PS an das Albumin zu einer FRα-spezifischen Aufnahme des gesamten Konstruktes in FRα-tragende KB Zellen führt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses nach der endozytotischen Aufnahme in die Zellen ins Lysosom gelangt. Dort wird das Albumin abgebaut und setzt den PS frei. So konnte durch Bestrahlung eine hochspezifische Rezeptor-vermittelte Photozytotoxizität induziert werden, während das freie β Carbolin und ein Albumin β Carbolin-Konjugat ohne FS keinen zytotoxischen Effekt nach Bestrahlung zeigten. Durch Kompetition mit FS-Überschuss konnte dieser Effekt verhindert werden. Aufbauend auf den Ergebnissen, die mit den Albumin-FS-Konjugaten erhoben wurden, wurden FS-konjugierte Dextran-Partikel als weitere spezifische Transport-Vehikel charakterisiert. Sie sind in der Lage, große Mengen lipophiler PS einzuschließen. Hier wurde exemplarisch das Tetraphenylporphyrin (TPP) verwendet. Die hier verwendeten Dextran-Partikel sind säurelabil. Nach Aufnahme über den Rezeptor und Transport ins Lysosom fallen sie auseinander und geben den PS frei. Auch mit diesem System konnte eine hochspezifische FRα-vermittelte Photozytotoxizität gezeigt werden. Schon geringe Mengen (20 µg/mL) des FS-konjugierten und TPP beladenen Partikels führen nach kurzer Inkubationszeit und anschließender Bestrahlung zu vollständiger Zytotoxizität. Dieselben Partikel zeigten keinen Effekt im Dunkeln. Durch Kompetition mit einem Überschuss an FS kann der zytotoxische Effekt im untersuchten Konzentrationsbereich fast komplett aufgehoben werden. Dieselben Partikel ohne FS-Konjugation sind auf der Oberfläche kationisch geladen. Es wurde gefunden, dass diese Partikel lipophile PS hocheffizient, aber unspezifisch ins Zellinnere transportieren. Umgeht man hingegen die positive Ladung auf der Oberfläche der Partikel, wurden diese überhaupt nicht von Zellen aufgenommen und erwiesen sich deshalb trotz TPP-Beladung als vollkommen untoxisch. Während der Experimente zur FRα-vermittelten Aufnahme stießen wir als interessanten Nebenbefund auf das photozyto- und photogenotoxische Potential der FS selbst. Es konnte gezeigt werden, dass FS unter Bestrahlung zellfrei und in Zellen dosisabhängig oxidative DNA-Schäden generiert. Dieser Effekt konnte durch die Inhibition des FS-Metabolismus durch das Medikament Methotrexat (MTX) noch verstärkt werden. Außerdem wurde nach Inhibtion dieses Metabolismus ein signifikantes mutagenes Potential von FS plus Licht nachgewiesen. Dies liefert einen Anhaltspunkt, dass die bekannte kanzerogene Wirkung von UV-Licht nicht nur von dessen UV-B Anteil ausgelöst wird, sondern über endogene Chromophore, wie die FS und dessen Abkömmlingen, auch vom UV-A Anteil, verursacht wird.An interesting new way in tumor therapy is the photodynamic therapy (PDT). Photosensitizers (PS) are used to generate cell and tissue toxic molecules such as reactive oxygen species (ROS) under irradiation with light. To achieve higher specificity and efficiency it makes sense to address tumor cells via the folic acid receptor α (FRα) which is over expressed by many different tumors. FRα internalizes folic acid (FA) and everything that is bound to it endocyticly. For the transport of the PS we investigated two high molecular vehicles to take advantage of the Enhanced Permeability and Retention effect (EPR) later on in the treatment of cancer patients. The first characterized transport system in this thesis are albumin-FA-conjugates which are linked covalently to a charged PS. As an example we used β-carbolinium derivatives. We could show that the conjugate with FA is taken up specifically in FRα over expressing KB cells. Additionally, we could show that the conjugates are reaching the lysosome after endocytic uptake where the albumin gets degraded and the PS is released. On this way we could induce a highly FRα specific cytotoxicity after irradiation. At the same time the free β-carbolinium molecule and the conjugate without FA showed no light induced cytotoxicity at all. By using an excess of FA as competition on the receptor we could avoid the uptake and the following cytotoxicity nearly completely. Based on the results of the albumin conjugates we investigated FA linked dextran particles as a second possible transport system. They can incorporate big amounts of lipophilic PS. We used tetraphenylphorphyrin (TPP) generically. The used particles are acid-labile and fall apart after endocytic uptake and transport to the lysosome where they release their payload. With this transport system we could also show highly specific FRα mediated cytotoxicity. Very small amounts of the FA linked particles (20 µg/mL) showed complete light dependent cytotoxicity after short pre-incubation times. The same particles did not show any effect in the dark. The same particles without FA modification on the surface are positively charged. We found that they transport lipophilic PS even more efficient but not specific into cells. Avoiding the positive charge by using a different kind of dextran for the particle formation the TPP loaded particles showed no cytotoxic effect at all. During our experiments concerning FRα mediated uptake we came across the photocyto- and photogenotoxic potential of FA. We could show in this thesis that FA can induce oxidized DNA bases in cell-free DNA and in cells. This effect is both dose and light dependent. The inhibition of the FA metabolism by the drug Methotrexat (MTX) increases the intracellular effect significantly. Furthermore, we could show an increased mutation risk after MTX incubation and subsequent irradiation in presence of FA. This provides a clue that the cancerogenous effect of UV light is not only caused by the UV-B fraction, but also by UV-A in combination with endogenous chromophores such as FA.128 S

Памяти Александра Евгеньевича Будникова

In photodynamic therapy (PDT), photosensitizers and light are used to cause photochemically induced cell death. The selectivity and the effectiveness of the phototoxicity in cancer can be increased by a specific uptake of the photosensitizer into tumor cells. A promising target for this goal is the folic acid receptor α (FRα), which is overexpressed on the surface of many tumor cells and mediates an endocytotic uptake. Here, we describe a polysaccharide-based nanoparticle system suitable for targeted uptake and its photochemical and photobiological characterization. The photosensitizer 5, 10, 15, 20-tetraphenyl-21H, 23H-porphyrine (TPP) was encapsulated in spermine- and acetal-modified dextran (SpAcDex) nanoparticles and conjugated with folic acid (FA) on the surface [SpAcDex(TPP)-FA]. The particles are successfully taken up by human HeLa-KB cells, and a light-induced cytotoxicity is observable. An excess of free folate as the competitor for the FRα-mediated uptake inhibits the phototoxicity. In conclusion, folate-modified SpAcDex particles are a promising drug delivery system for a tumor cell targeted photodynamic therapy

Albumin–Folate Conjugates for Drug‐targeting in Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is based on the cytotoxicity of photosensitizers in the presence of light. Increased selectivity and effectivity of the treatment is expected if a specific uptake of the photosensitizers into the target cells, often tumor cells, can be achieved. An attractive transporter for that purpose is the folic acid receptor α (FRα), which is overexpressed on the surface of many tumor cells and mediates an endocytotic uptake. Here, we describe the synthesis and photobiological characterization of polar β‐carboline derivatives as photosensitizers covalently linked to folate‐tagged albumin as the carrier system. The particles were taken up by KB (human carcinoma) cells within <90 min and then co‐localized with a lysosomal marker. FRα antibodies prevented the uptake and also the corresponding conjugate without folate was not taken up. Accordingly, a folate‐albumin‐β‐carbolinium conjugate proved to be phototoxic, while the corresponding albumin–β‐carbolinium conjugates without FA were nontoxic, both with and without irradiation. An excess of free folate as competitor for the FRα‐mediated uptake completely inhibited the photocytotoxicity. Interestingly, the albumin conjugates are devoid of photodynamic activity under cell‐free conditions, as shown for DNA as a target. Thus, phototoxicity requires cellular uptake and lysosomal degradation of the conjugates. In conclusion, albumin–folate conjugates appear to be promising vehicles for a tumor cell targeted PDT.Facultad de Ciencias Exacta

Folat Rezeptor alpha vermittelte Aufnahme von Photosensibilisator-Konjugaten und die Phototoxizität der Folsäure

Ein aufstrebender Ansatz in der Tumortherapie ist die Photodynamische Therapie (PDT), bei der Photosensibilisatoren (PS) eingesetzt werden, die nach Bestrahlung zell- und gewebstoxische Moleküle, wie zum Beispiel reaktive Sauerstoffspezies (ROS), generieren. Für eine höhere Spezifität sollten Tumorzellen adressiert werden. Hierfür wurde ausgenutzt, dass viele Krebszellen den Folsäure-Rezeptor α (FRα) überexprimieren, der Folsäure (FS) und alles was daran gebunden ist endozytotisch in die Zelle aufnimmt. Zum Transport der PS wurden dabei hochmolekulare Vehikel verwendet, um bei späterer Anwendung den Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effekt ausnutzen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Transportsysteme charakterisiert: Im ersten System wurden Albumin-FS-Konjugate kovalent an geladene PS gebunden. Exemplarisch wurde hier mit β Carbolin Derivaten gearbeitet. Wir konnten zeigen, dass die kovalente Bindung von FS und einem PS an das Albumin zu einer FRα-spezifischen Aufnahme des gesamten Konstruktes in FRα-tragende KB Zellen führt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses nach der endozytotischen Aufnahme in die Zellen ins Lysosom gelangt. Dort wird das Albumin abgebaut und setzt den PS frei. So konnte durch Bestrahlung eine hochspezifische Rezeptor-vermittelte Photozytotoxizität induziert werden, während das freie β Carbolin und ein Albumin β Carbolin-Konjugat ohne FS keinen zytotoxischen Effekt nach Bestrahlung zeigten. Durch Kompetition mit FS-Überschuss konnte dieser Effekt verhindert werden. Aufbauend auf den Ergebnissen, die mit den Albumin-FS-Konjugaten erhoben wurden, wurden FS-konjugierte Dextran-Partikel als weitere spezifische Transport-Vehikel charakterisiert. Sie sind in der Lage, große Mengen lipophiler PS einzuschließen. Hier wurde exemplarisch das Tetraphenylporphyrin (TPP) verwendet. Die hier verwendeten Dextran-Partikel sind säurelabil. Nach Aufnahme über den Rezeptor und Transport ins Lysosom fallen sie auseinander und geben den PS frei. Auch mit diesem System konnte eine hochspezifische FRα-vermittelte Photozytotoxizität gezeigt werden. Schon geringe Mengen (20 µg/mL) des FS-konjugierten und TPP beladenen Partikels führen nach kurzer Inkubationszeit und anschließender Bestrahlung zu vollständiger Zytotoxizität. Dieselben Partikel zeigten keinen Effekt im Dunkeln. Durch Kompetition mit einem Überschuss an FS kann der zytotoxische Effekt im untersuchten Konzentrationsbereich fast komplett aufgehoben werden. Dieselben Partikel ohne FS-Konjugation sind auf der Oberfläche kationisch geladen. Es wurde gefunden, dass diese Partikel lipophile PS hocheffizient, aber unspezifisch ins Zellinnere transportieren. Umgeht man hingegen die positive Ladung auf der Oberfläche der Partikel, wurden diese überhaupt nicht von Zellen aufgenommen und erwiesen sich deshalb trotz TPP-Beladung als vollkommen untoxisch. Während der Experimente zur FRα-vermittelten Aufnahme stießen wir als interessanten Nebenbefund auf das photozyto- und photogenotoxische Potential der FS selbst. Es konnte gezeigt werden, dass FS unter Bestrahlung zellfrei und in Zellen dosisabhängig oxidative DNA-Schäden generiert. Dieser Effekt konnte durch die Inhibition des FS-Metabolismus durch das Medikament Methotrexat (MTX) noch verstärkt werden. Außerdem wurde nach Inhibtion dieses Metabolismus ein signifikantes mutagenes Potential von FS plus Licht nachgewiesen. Dies liefert einen Anhaltspunkt, dass die bekannte kanzerogene Wirkung von UV-Licht nicht nur von dessen UV-B Anteil ausgelöst wird, sondern über endogene Chromophore, wie die FS und dessen Abkömmlingen, auch vom UV-A Anteil, verursacht wird.An interesting new way in tumor therapy is the photodynamic therapy (PDT). Photosensitizers (PS) are used to generate cell and tissue toxic molecules such as reactive oxygen species (ROS) under irradiation with light. To achieve higher specificity and efficiency it makes sense to address tumor cells via the folic acid receptor α (FRα) which is over expressed by many different tumors. FRα internalizes folic acid (FA) and everything that is bound to it endocyticly. For the transport of the PS we investigated two high molecular vehicles to take advantage of the Enhanced Permeability and Retention effect (EPR) later on in the treatment of cancer patients. The first characterized transport system in this thesis are albumin-FA-conjugates which are linked covalently to a charged PS. As an example we used β-carbolinium derivatives. We could show that the conjugate with FA is taken up specifically in FRα over expressing KB cells. Additionally, we could show that the conjugates are reaching the lysosome after endocytic uptake where the albumin gets degraded and the PS is released. On this way we could induce a highly FRα specific cytotoxicity after irradiation. At the same time the free β-carbolinium molecule and the conjugate without FA showed no light induced cytotoxicity at all. By using an excess of FA as competition on the receptor we could avoid the uptake and the following cytotoxicity nearly completely. Based on the results of the albumin conjugates we investigated FA linked dextran particles as a second possible transport system. They can incorporate big amounts of lipophilic PS. We used tetraphenylphorphyrin (TPP) generically. The used particles are acid-labile and fall apart after endocytic uptake and transport to the lysosome where they release their payload. With this transport system we could also show highly specific FRα mediated cytotoxicity. Very small amounts of the FA linked particles (20 µg/mL) showed complete light dependent cytotoxicity after short pre-incubation times. The same particles did not show any effect in the dark. The same particles without FA modification on the surface are positively charged. We found that they transport lipophilic PS even more efficient but not specific into cells. Avoiding the positive charge by using a different kind of dextran for the particle formation the TPP loaded particles showed no cytotoxic effect at all. During our experiments concerning FRα mediated uptake we came across the photocyto- and photogenotoxic potential of FA. We could show in this thesis that FA can induce oxidized DNA bases in cell-free DNA and in cells. This effect is both dose and light dependent. The inhibition of the FA metabolism by the drug Methotrexat (MTX) increases the intracellular effect significantly. Furthermore, we could show an increased mutation risk after MTX incubation and subsequent irradiation in presence of FA. This provides a clue that the cancerogenous effect of UV light is not only caused by the UV-B fraction, but also by UV-A in combination with endogenous chromophores such as FA

Albumin–Folate Conjugates for Drug-targeting in Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is based on the cytotoxicity of photosensitizers in the presence of light. Increased selectivity and effectivity of the treatment is expected if a specific uptake of the photosensitizers into the target cells, often tumor cells, can be achieved. An attractive transporter for that purpose is the folic acid receptor α (FRα), which is overexpressed on the surface of many tumor cells and mediates an endocytotic uptake. Here, we describe the synthesis and photobiological characterization of polar β-carboline derivatives as photosensitizers covalently linked to folate-tagged albumin as the carrier system. The particles were taken up by KB (human carcinoma) cells within <90 min and then co-localized with a lysosomal marker. FRα antibodies prevented the uptake and also the corresponding conjugate without folate was not taken up. Accordingly, a folate-albumin-β-carbolinium conjugate proved to be phototoxic, while the corresponding albumin–β-carbolinium conjugates without FA were nontoxic, both with and without irradiation. An excess of free folate as competitor for the FRα-mediated uptake completely inhibited the photocytotoxicity. Interestingly, the albumin conjugates are devoid of photodynamic activity under cell-free conditions, as shown for DNA as a target. Thus, phototoxicity requires cellular uptake and lysosomal degradation of the conjugates. In conclusion, albumin–folate conjugates appear to be promising vehicles for a tumor cell targeted PDT.Fil: Butzbach, Kathrin. University of Mainz; AlemaniaFil: Rasse Suriani, Federico Ariel Osvaldo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Gonzalez, Maria Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Cabrerizo, Franco Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús). Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas "Dr. Raúl Alfonsín" (sede Chascomús); ArgentinaFil: Epe, Bernd. University of Mainz; Alemani

Mechanisms of DNA damage by photoexcited 9-methyl-β-carbolines

It has been well documented that β-carboline alkaloids, particularly the 9-methyl derivatives, are efficient photosensitizers. However, structure–activity relationships are missing and the photochemical mechanisms involved in the DNA photodamage still remain unknown. In the present work, we examined the capability of three 9-methyl-β-carbolines (9-methyl-norharmane, 9-methyl-harmane and 9-methylharmine) to induce DNA damage upon UVA excitation at physiological pH. The type and extent of the damage was analyzed together with the photophysical and binding properties of the β-carboline derivatives investigated. The results indicate that even at neutral pH most of the DNA damage is generated from the protonated form of the excited β-carbolines in a type-I reaction. Oxidized purine residues are produced in high excess over oxidized pyrimidines, single-strand breaks and sites of base loss. In addition, the excited neutral form of the β-carbolines is responsible for significant generation of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) by triplet–triplet-energy transfer. In the case of 9-methyl-norharmane, the yield of CPDs is increased in D2O, probably due to less rapid protonation in the deuterated solvent.Fil: Vignoni, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Rasse Suriani, Federico Ariel Osvaldo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); ArgentinaFil: Butzbach, Kathrin. No especifíca;Fil: Erra Balsells, Rosa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Epe, Bernd. No especifíca;Fil: Cabrerizo, Franco Martín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas - Instituto Tecnológico Chascomús. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (sede Chascomús); Argentin