Differentiation of In Vitro–Modified Human Peripheral Blood Monocytes Into Hepatocyte–like and Pancreatic Islet-like Cells

BACKGROUND & AIMS: Adult stem cells provide a promising alternative for the treatment of diabetes mellitus and end-stage liver diseases. We evaluated the differentiation potential of human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells. METHODS: Monocytes were treated with macrophage colony-stimulating factor and interleukin 3 for 6 days, followed by incubation with hepatocyte and pancreatic islet-specific differentiation media. Cells were characterized by flow cytometry, gene-expression analysis, metabolic assays, and transplantation for their state of differentiation and tissue-specific functions. RESULTS: In response to macrophage colony-stimulating factor and interleukin 3, monocytes resumed cell division in a CD115-dependent fashion, which was associated with a down-regulation of the PRDM1 and ICSBP genes. These programmable cells of monocytic origin were capable of differentiating into neohepatocytes, which closely resemble primary human hepatocytes with respect to morphology, expression of hepatocyte markers, and specific metabolic functions. After transplantation into the liver of severe combined immunodeficiency disease/nonobese diabetic mice, neohepatocytes integrated well into the liver tissue and showed a morphology and albumin expression similar to that of primary human hepatocytes transplanted under identical conditions. Programmable cells of monocytic origin-derived pancreatic neoislets expressed beta cell-specific transcription factors, secreted insulin and C peptide in a glucose-dependent manner, and normalized blood glucose levels when xenotransplanted into immunocompetent, streptozotocin-treated diabetic mice. Programmable cells of monocytic origin retained monocytic characteristics, notably CD14 expression, a monocyte-specific methylation pattern of the CD115 gene, and expression of the transcription factor PU.1. CONCLUSIONS: The ability to reprogram, expand, and differentiate peripheral blood monocytes in large quantities opens the real possibility of the clinical application of programmable cells of monocytic origin in tissue repair and organ regeneration

In Vitro Differentiation of Embryonic and Adult Stem Cells into Hepatocytes: State of the Art

Stem cells are a unique source of self-renewing cells within the human body. Before the end of the last millennium, adult stem cells, in contrast to their embryonic counterparts, were considered to be lineage-restricted cells or incapable of crossing lineage boundaries. However, the unique breakthrough of muscle and liver regeneration by adult bone marrow stem cells at the end of the 1990s ended this long-standing paradigm. Since then, the number of articles reporting the existence of multipotent stem cells in skin, neuronal tissue, adipose tissue, and bone marrow has escalated, giving rise, both in vivo and in vitro, to cell types other than their tissue of origin. The phenomenon of fate reprogrammation and phenotypic diversification remains, though, an enigmatic and rare process. Understanding how to control both proliferation and differentiation of stem cells and their progeny is a challenge in many fields, going from preclinical drug discovery and development to clinical therapy. In this review, we focus on current strategies to differentiate embryonic, mesenchymal(-like), and liver stem/progenitor cells into hepatocytes in vitro. Special attention is paid to intracellular and extracellular signaling, genetic modification, and cell-cell and cell-matrix interactions. In addition, some recommendations are proposed to standardize, optimize, and enrich the in vitro production of hepatocyte-like cells out of stem/progenitor cells

Differenzierung adulter Stammzellen nach Transplantation in die Leber immundefizienter Mäuse

Der Bedarf an Spenderlebern für die Behandlung akuter und chronischer Lebererkrankungen kann zurzeit nicht gedeckt werden. Insbesondere für metabolische Lebererkrankungen hat sich die Transplantation von Hepatozyten als Alternative zur Lebertransplantation erwiesen. Diese Therapie wird wegen Mangel an Hepatozyten ausreichender Qualität nicht flächendeckend eingesetzt. Falls es möglich wäre, Stammzellen zu Hepatozyten zu differen-zieren, könnte dies für die Behandlung von Lebererkrankungen einen erheblichen Fortschritt bedeuten. Eine von vielen Arbeitsgruppen verfolgte Strategie zur Beurteilung des Differenzie-rungspotentials hepatischer Vorläuferzellen ist die Transplantation in die Leber immundefi-zienter Mäuse. Die in der vorliegenden Arbeit verfolgte Strategie bestand darin, zunächst 750.000 zu beurteilende Zellen entweder direkt in das Parenchym des linken Leberlappens oder in die Milz zu injizieren. Die anschließende Analytik verfolgte folgende Ziele: i) Identi-fikation der transplantierten Zellen. Dies wurde durch den kombinierten Einsatz von CM-DiI und Sonden gegen humane Alu-Sequenzen erreicht. Hierbei markierte CM-DiI lediglich grob die Areale, in die transplantiert wurde. Die in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden ermöglichte die konkrete Identifikation humaner Kerne. ii) Analyse der Expression hepatischer Faktoren, die von den ursprünglichen Stammzellen nicht gebildet wurden. Hierzu wurde ein für huma-nes Albumin spezifischer Antikörper eingesetzt. iii) Überprüfung, ob die human Albumin-positiven Zellen menschlichen Ursprungs sind. Hierzu wurde eine Kombination aus in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden und Immunhistochemie gegen humanes Albumin etabliert. Als Positivkontrolle dienten in der vorliegenden Arbeit primäre humane Hepatozyten. Das Ergebnis nach Transplantation humaner Hepatozyten wurde mit dem Ergebnis nach Trans-plantation adhärent proliferierender Nabelschnurblutzellen, hepatopankreatischen Vorläufer-zellen und aus peripheren humanen Blutmonozyten in vitro ausdifferenzierten Neohepatozy-ten verglichen. Anhand positiver Rotfluoreszenz wurden bereits im paraffinisierten Schnitt die Be-reiche der transplantierten CM-DiI-markierten Stammzellen identifiziert. Durch die in situ Hybridisierung mit Mensch-spezifischen Alu-Sonden wurden in den CM-DiI-positiven Area-len Menschkerne nachgewiesen. Immunhistochemisch wurde in diesen Bereichen eine Ex-pression humanen Albumins gezeigt. Vom umgebenden Gewebe waren die identifizierten Zellen durch einen kleinen dezentral gelegenen Zellkern, geringe Zellgröße und einer Hepato-zyten unähnlichen Morphologie zu unterschieden. Diese Zellen traten in der Regel als kleine-re Zellagglomerate auf, die entweder in Gefäßen oder ohne Endothelabgrenzung im Gewebe zu finden waren. Bei der Auswertung weiterer auf humanes Albumin untersuchter Gewebe-schnitte wurde ein zweiter morphologisch unterschiedlicher Typ humanes Albumin-exprimierender Zellen gefunden. Dieser war durch eine perfekte Hepatozytenmorphologie mit großem, zentral gelegenem Kern und polygonaler Form der Zelle charakterisiert. Im Gewebe lagen diese Zellen vereinzelt, ohne immunhistochemische Detektion wäre eine Unterschei-dung von Maushepatozyten nicht möglich gewesen. Mit der in situ Hybridisierung wurde für diese Zellen ein Mauskern nachgewiesen. Der seltener auftretende Zelltyp mit perfekter He-patozytenmorphologie wurde als Typ I und der kleinzellige Zelltyp als Typ II bezeichnet. Bemerkenswert hierbei ist, dass die beobachteten Typen human Albumin-positiver Zellen nach Transplantation aller drei miteinander verglichenen Zelltypen nachweisbar waren. Eine mögliche Erklärung des Befundes der Typ II-Zellen besteht in einer teilweisen Differenzie-rung in Richtung Hepatozyte. Die menschlichen Zellen exprimieren zwar Albumin, nicht aber andere Faktoren wie CYP3A4, und nehmen keine hepatozelluläre Morphologie an. Ein über-raschender Befund war die Typ I-Zelle. Der Mechanismus, der in diesen Zellen zur Expressi-on humanen Albumins führt, ist zurzeit ungeklärt. Mithilfe des EROD-Assays wurde die metabolische Aktivität der CYP1A-Isoenzyme bei in vitro differenzierten Neohepatozyten bestimmt. Hierbei wurde ein zeitabhängiger Um-satz von EROD zu Resorufin beobachtet, der aber nicht durch 3-Methylcholanthren induzier-bar war. Damit fehlt den Neohepatozyten in diesem Punkt eine wichtige Eigenschaft primärer Hepatozyten. Allerdings sind durch publizierte Untersuchungen an Neohepatozyten weitere Hepatozyten-spezifische Parameter wie Harnstoffzyklus und Albuminproduktion belegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass nach Transplantation humaner Vor-läuferzellen verschiedenen Ursprungs ein qualitativ ähnliches Ergebnis mit zwei unterschied-lichen Typen human Albumin-positiver Zellen beobachtet wurde. Ob diese Zelltypen thera-peutisch nutzbar sind, bedarf weiterer Untersuchungen, beispielsweise mit Tiermodellen für menschliche Lebererkrankungen

Differenzierung adulter Stammzellen nach Transplantation in die Leber immundefizienter Mäuse

Der Bedarf an Spenderlebern für die Behandlung akuter und chronischer Lebererkrankungen kann zurzeit nicht gedeckt werden. Insbesondere für metabolische Lebererkrankungen hat sich die Transplantation von Hepatozyten als Alternative zur Lebertransplantation erwiesen. Diese Therapie wird wegen Mangel an Hepatozyten ausreichender Qualität nicht flächendeckend eingesetzt. Falls es möglich wäre, Stammzellen zu Hepatozyten zu differen-zieren, könnte dies für die Behandlung von Lebererkrankungen einen erheblichen Fortschritt bedeuten. Eine von vielen Arbeitsgruppen verfolgte Strategie zur Beurteilung des Differenzie-rungspotentials hepatischer Vorläuferzellen ist die Transplantation in die Leber immundefi-zienter Mäuse. Die in der vorliegenden Arbeit verfolgte Strategie bestand darin, zunächst 750.000 zu beurteilende Zellen entweder direkt in das Parenchym des linken Leberlappens oder in die Milz zu injizieren. Die anschließende Analytik verfolgte folgende Ziele: i) Identi-fikation der transplantierten Zellen. Dies wurde durch den kombinierten Einsatz von CM-DiI und Sonden gegen humane Alu-Sequenzen erreicht. Hierbei markierte CM-DiI lediglich grob die Areale, in die transplantiert wurde. Die in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden ermöglichte die konkrete Identifikation humaner Kerne. ii) Analyse der Expression hepatischer Faktoren, die von den ursprünglichen Stammzellen nicht gebildet wurden. Hierzu wurde ein für huma-nes Albumin spezifischer Antikörper eingesetzt. iii) Überprüfung, ob die human Albumin-positiven Zellen menschlichen Ursprungs sind. Hierzu wurde eine Kombination aus in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden und Immunhistochemie gegen humanes Albumin etabliert. Als Positivkontrolle dienten in der vorliegenden Arbeit primäre humane Hepatozyten. Das Ergebnis nach Transplantation humaner Hepatozyten wurde mit dem Ergebnis nach Trans-plantation adhärent proliferierender Nabelschnurblutzellen, hepatopankreatischen Vorläufer-zellen und aus peripheren humanen Blutmonozyten in vitro ausdifferenzierten Neohepatozy-ten verglichen. Anhand positiver Rotfluoreszenz wurden bereits im paraffinisierten Schnitt die Be-reiche der transplantierten CM-DiI-markierten Stammzellen identifiziert. Durch die in situ Hybridisierung mit Mensch-spezifischen Alu-Sonden wurden in den CM-DiI-positiven Area-len Menschkerne nachgewiesen. Immunhistochemisch wurde in diesen Bereichen eine Ex-pression humanen Albumins gezeigt. Vom umgebenden Gewebe waren die identifizierten Zellen durch einen kleinen dezentral gelegenen Zellkern, geringe Zellgröße und einer Hepato-zyten unähnlichen Morphologie zu unterschieden. Diese Zellen traten in der Regel als kleine-re Zellagglomerate auf, die entweder in Gefäßen oder ohne Endothelabgrenzung im Gewebe zu finden waren. Bei der Auswertung weiterer auf humanes Albumin untersuchter Gewebe-schnitte wurde ein zweiter morphologisch unterschiedlicher Typ humanes Albumin-exprimierender Zellen gefunden. Dieser war durch eine perfekte Hepatozytenmorphologie mit großem, zentral gelegenem Kern und polygonaler Form der Zelle charakterisiert. Im Gewebe lagen diese Zellen vereinzelt, ohne immunhistochemische Detektion wäre eine Unterschei-dung von Maushepatozyten nicht möglich gewesen. Mit der in situ Hybridisierung wurde für diese Zellen ein Mauskern nachgewiesen. Der seltener auftretende Zelltyp mit perfekter He-patozytenmorphologie wurde als Typ I und der kleinzellige Zelltyp als Typ II bezeichnet. Bemerkenswert hierbei ist, dass die beobachteten Typen human Albumin-positiver Zellen nach Transplantation aller drei miteinander verglichenen Zelltypen nachweisbar waren. Eine mögliche Erklärung des Befundes der Typ II-Zellen besteht in einer teilweisen Differenzie-rung in Richtung Hepatozyte. Die menschlichen Zellen exprimieren zwar Albumin, nicht aber andere Faktoren wie CYP3A4, und nehmen keine hepatozelluläre Morphologie an. Ein über-raschender Befund war die Typ I-Zelle. Der Mechanismus, der in diesen Zellen zur Expressi-on humanen Albumins führt, ist zurzeit ungeklärt. Mithilfe des EROD-Assays wurde die metabolische Aktivität der CYP1A-Isoenzyme bei in vitro differenzierten Neohepatozyten bestimmt. Hierbei wurde ein zeitabhängiger Um-satz von EROD zu Resorufin beobachtet, der aber nicht durch 3-Methylcholanthren induzier-bar war. Damit fehlt den Neohepatozyten in diesem Punkt eine wichtige Eigenschaft primärer Hepatozyten. Allerdings sind durch publizierte Untersuchungen an Neohepatozyten weitere Hepatozyten-spezifische Parameter wie Harnstoffzyklus und Albuminproduktion belegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass nach Transplantation humaner Vor-läuferzellen verschiedenen Ursprungs ein qualitativ ähnliches Ergebnis mit zwei unterschied-lichen Typen human Albumin-positiver Zellen beobachtet wurde. Ob diese Zelltypen thera-peutisch nutzbar sind, bedarf weiterer Untersuchungen, beispielsweise mit Tiermodellen für menschliche Lebererkrankungen

Chronic exposure of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) induces an obesogenic effect in C57BL/6J mice fed a high fat diet

IF 3.582International audienceContaminant involvement in the pathophysiology of obesity is widely recognized. It has been shown that low dose and chronic exposure to endocrine disruptor compounds (EDCs) potentiated diet- induced obesity. High and acute exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), a persistent organic pollutant (POP) and an EDC with anti-estrogenic property, causes wasting syndrome . However at lower doses, the TCDD metabolic effects remain poorly understood. We investigated the obesogenic effect during chronic exposure of TCDD at 1μg/kg body weight (bw)/week in adult C57BL/6J mice fed with a high fat diet (HFD) and exposed from 10 to 42 weeks old to TCDD or equal volume of vehicle by intragastric gavage. Under these conditions, TCDD was obesogenic in adult mice (7% in males and 8% in females), which was linked to fat mass. A sex effect was observed in the fat mass distribution in adipose tissue and in the hepatic triglyceride content evolution. In visceral fat pad weight, we observed a decrease (11%) in males and an increase (14%) in females. The hepatic triglyceride content increase (41%) in females only. TCDD failed to induce any change in plasma parameters regarding glucose and lipid homeostasis. Messenger ribonucleic acid (mRNA) levels involved in adipose tissue and hepatic metabolism, inflammation, xenobiotic metabolism and endocrine disruption were differently regulated between males and females. In conclusion, these results provide new evidence that dioxin, a POP and EDC can be obesogenic for adult mice with multi-organ effects

Obesogen effect of bisphenol S alters mRNA expression and DNA methylation profiling in male mouse liver

International audienceEnvironmental pollution is increasingly considered an important factor involved in the obesity incidence. Endocrine disruptors (EDs) are important actors in the concept of DOHaD (Developmental Origins of Health and Disease), where epigenetic mechanisms play crucial roles. Bisphenol A (BPA), a monomer used in the manufacture of plastics and resins is one of the most studied obesogenic endocrine disruptor. Bisphenol S (BPS), a BPA substitute, has the same obesogenic properties, acting at low doses with a sex-specific effect following perinatal exposure. Since the liver is a major organ in regulating body lipid homeostasis, we investigated gene expression and DNA methylation under low-dose BPS exposure. The BPS obesogenic effect was associated with an increase of hepatic triglyceride content. These physiological disturbances were accompanied by genome-wide changes in gene expression (1366 genes significantly modified more than 1.5-fold). Gene ontology analysis revealed alteration of gene cascades involved in protein translation and complement regulation. It was associated with hepatic DNA hypomethylation in autosomes and hypermethylation in sex chromosomes. Although no systematic correlation has been found between gene repression and hypermethylation, several genes related to liver metabolism were either hypermethylated (Acsl4, Gpr40, Cel, Pparδ, Abca6, Ces3a, Sgms2) or hypomethylated (Soga1, Gpihbp1, Nr1d2, Mlxipl, Rps6kb2, Esrrb, Thra, Cidec). In specific cases (Hapln4, ApoA4, Cidec, genes involved in lipid metabolism and liver fibrosis) mRNA upregulation was associated with hypomethylation. In conclusion, we show for the first time wide disruptive physiological effects of low-dose of BPS, which raises the question of its harmlessness as an industrial substitute for BPA

Epoxiconazole alters the histology and transcriptome of mouse liver in a transgenerational pattern

International audienceBackgroundThe use of phytosanitary products is always associated with their safety concern on the environment and on health. The associated adverse effects are very broad and substance-dependent. Among these substances, epoxiconazole (EPOX) is one of the most widely used fungicides, especially in beet crops. Although its use is questionable or even prohibited in the European Union, it is still widely used and its consequences (transgenerational effects) on future generations is unknown.ObjectivesWe aimed to investigate the hepatic effects of epoxiconazole in the descendants of perinatally exposed low-dose C57Bl/6J mice, focusing on liver histological and transcriptomic analyses.MethodsFrom day 0 of gestation up to day 21 postnatal, only pregnant F0 C57BL6/J mice were exposed to EPOX (1.75 μg/kg bw/day). F1 males and females were mated to obtain the F2 generation and similarly, F2 mice were crossed to obtain F3. Histological and transcriptomic analyses of the liver were performed. Gene set enrichment analysis was realized to determine an a priori defined set of genes with significantly altered mRNA expression. Plasma parameters were also measured.Results and conclusions: Perinatal exposure to EPOX induces transgenerational effects with phenotypic, histological and transcriptomic changes in the liver. These changes are highly dependent on the sex and generation of the animal. All these modifications lead to an alteration of the hepatic metabolism resulting in a difference in the size of the hepatocytes. Beyond these specific mechanisms, EPOX also seems to have a more general impact on hepatic metabolism via the circadian rhythm

Are epigenetic modifications linked to BPS obesogen effect after perinatal exposure? Differential DNA methylation study in mouse livers

International audienceIn 2002, a correlation was established between the environmentalpollution increase and the exponential evolution of the obesity epi-demic. A few years later, the concept of obesogen was developed.Most of the known obesogens are endocrine disruptor compounds(EDCs)..

Transgenerational effects on intestinal inflammation status in mice perinatally exposed to bisphenol S

International audienceIncreasing evidence has highlighted the critical role of early life environment in shaping the future health outcomes of individuals in subsequent generations. Bisphenol S (BPS) has been widely used as a substitute for various plastic materials due to the limited application of Bisphenol A (BPA) which is an endocrine disruptor. However, the lack of efficient evaluation of BPS leaves doubts about the relevant substitute of BPA. Few studies of transgenerational inheritance have examined the effects of environmental exposures to endocrine disruptors on the immune system. In this study, we analyzed the transgenerational effects of BPS on intestinal inflammation and its consequence in metabolism. In this study, only F0 pregnant mice were exposed to BPS (1.5 μg/kg bw/day) from gestational day 0 until weaning of offspring. In this work, both F1 and F2 male offspring developed an inflammatory response in the ileum and colon at adulthood after F0 mothers were exposed to BPS; this phenomenon disappeared in F3. This inflammatory response in F1 male offspring is associated with a significant decrease of blood cholesterol without modification of metabolic status. Further, in F3 offspring male, the decrease of gut inflammatory response is associated with a decrease of fat weight and with an increase of blood glucose and cholesterol level. A sex-specific profile is observed in female offspring. We also observed that early life exposure to BPS was associated with strong abnormal intestinal immune status. The study presented here demonstrates that the immune system, like other organ systems, is vulnerable to transgenerational effects caused by environmental exposure