High Salt Intake Down-Regulates Colonic Mineralocorticoid Receptors, Epithelial Sodium Channels and 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 2

Besides the kidneys, the gastrointestinal tract is the principal organ responsible for sodium homeostasis. For sodium transport across the cell membranes the epithelial sodium channel (ENaC) is of pivotal relevance. The ENaC is mainly regulated by mineralocorticoid receptor mediated actions. The MR activation by endogenous 11β-hydroxy-glucocorticoids is modulated by the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11β-HSD2). Here we present evidence for intestinal segment specific 11β-HSD2 expression and hypothesize that a high salt intake and/or uninephrectomy (UNX) affects colonic 11β-HSD2, MR and ENaC expression. The 11β-HSD2 activity was measured by means of 3H-corticosterone conversion into 3H-11-dehydrocorticosterone in Sprague Dawley rats on a normal and high salt diet. The activity increased steadily from the ileum to the distal colon by a factor of about 3, an observation in line with the relevance of the distal colon for sodium handling. High salt intake diminished mRNA and protein of 11β-HSD2 by about 50% (p<0.001) and reduced the expression of the MR (p<0.01). The functionally relevant ENaC-β and ENaC-γ expression, a measure of mineralocorticoid action, diminished by more than 50% by high salt intake (p<0.001). The observed changes were present in rats with and without UNX. Thus, colonic epithelial cells appear to contribute to the protective armamentarium of the mammalian body against salt overload, a mechanism not modulated by UNX

Glucocorticoids and renal sodium transport:implications for hypertension and salt-sensitivity

The clinical manifestations of glucocorticoid excess include central obesity, hyperglycaemia, dyslipidaemia, electrolyte abnormalities and hypertension. A century on from Cushing's original case study, these cardinal features are prevalent in industrialized nations. Hypertension is the major modifiable risk factor for cardiovascular and renal disease and reflects underlying abnormalities of Na(+) homeostasis. Aldosterone is a master regulator of renal Na(+) transport but here we argue that glucocorticoids are also influential, particularly during moderate excess. The hypothalamic–pituitary–adrenal axis can affect renal Na(+) homeostasis on multiple levels, systemically by increasing mineralocorticoid synthesis and locally by actions on both the mineralocorticoid and glucocorticoid receptors, both of which are expressed in the kidney. The kidney also expresses both of the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11βHSD) enzymes. The intrarenal generation of active glucocorticoid by 11βHSD1 stimulates Na(+) reabsorption; failure to downregulate the enzyme during adaption to high dietary salt causes salt-sensitive hypertension. The deactivation of glucocorticoid by 11βHSD2 underpins the regulatory dominance for Na(+) transport of mineralocorticoids and defines the ‘aldosterone-sensitive distal nephron’. In summary, glucocorticoids can stimulate renal transport processes conventionally attributed to the renin–angiotensin–aldosterone system. Importantly, Na(+) and volume homeostasis do not exert negative feedback on the hypothalamic–pituitary–adrenal axis. These actions are therefore clinically relevant and may contribute to the pathogenesis of hypertension in conditions associated with elevated glucocorticoid levels, such as the metabolic syndrome and chronic stress

Digitaler Hörsaal interdisziplinär. Evaluation einer Online-Vorlesung mit fachlich heterogenen Studierenden

Der Beitrag stellt Ergebnisse der Evaluation einer videobasierten Online-Vorlesung an der Freien Universität Berlin vor. Dabei stehen insbesondere Unterschiede zwischen Subgruppen der interdisziplinären Studierendenschaft im Fokus. Die Pflichtveranstaltung für Studierende des Bachelorstudiengangs Bildungs- und Erziehungswissenschaft sowie für Studierende eines Bachelorstudiengangs mit Lehramtsoption wurde in ein Blended-Learning-Format überführt und dieses mit rund 650 TeilnehmerInnen durchgeführt. Im Zuge einer formativen Evaluation sollen insbesondere Erkenntnisse darüber gewonnen werden, inwieweit die Studierenden das videobasierte Online-Format akzeptieren und ob sie einen Lernerfolg durch die Teilnahme wahrnehmen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass das neue Angebot bei den Studierenden insgesamt auf hohe Akzeptanz stößt und weisen auf Unterschiede zwischen Studierenden der verschiedenen Studiengänge hin. Abschließend wird ein Ausblick gegeben, welche Impulse die vorgestellten Evaluationsergebnisse für die Weiterentwicklung des Blended-Learning-Konzepts geben.(DIPF/Orig.

regulation of corticosteroid-induced sodium transport by pro-inflammatory cytokines

INHALT Inhaltsverzeichnis I-IV 1 Einleitung 1 1\. 1 Die Regulation des Natriumhaushalts 1 1\. 2 Der epitheliale Natrium-Kanal ENaC 3 1\. 3 Molekulare Zusammensetzung des ENaC 4 1\. 4 Transkriptionelle Regulation des ENaC 6 1\. 4. 1 Regulation durch Corticosteroidrezeptoren 7 (I) Der Mineralocorticoidrezeptor 8 (II) Der Glucocorticoidrezeptor 10 1\. 4. 2 Regulation durch Butyrat 12 1\. 5 Regulation des ENaC-Targetings 13 1\. 5. 1 Regulation durch SGK-1 15 1\. 5. 2 Regulation durch GILZ 15 1\. 6 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) 16 1\. 6. 1 Rolle pro-inflammatorischer Zytokine bei CED 18 1\. 7 ENaC-Dysregulation bei CED 19 1\. 8 Existierende Modelle zur Charakterisierung der CED-Pathogenese 20 1\. 9 Zielsetzung der Arbeit 22 2 Material und Methoden 23 2\. 1 Material und Geräte 23 2\. 1. 1 Verbrauchsmaterial 23 2\. 1. 2 Geräte 23 2\. 1. 3 Software 24 2\. 2 Reagenzien 25 2\. 2. 1 Laborchemikalien und andere Reagenzien 25 2\. 2. 2 Inhibitoren 27 2\. 2. 3 Zytokine und Enzyme 27 2\. 2. 4 Verwendete Kits 28 2\. 2. 5 Antikörper 28 2\. 3 Kultivierung eukaryotischer Zellen 29 2\. 3. 1 Verwendete Zelllinien und Kulturmedien 29 2\. 3. 2 Zellkultur-Epithelmodell 29 2\. 3. 3 Zugabe von Reagenzien zu eukaryotischen Zellkulturen 30 2\. 3. 4 Generierung stabil transfizierter Zellklone mittels Nukleofektion 30 2\. 3. 5 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen mittels Lipofektion und Reportergen-Assay 31 2\. 4 Molekularbiologische Methoden 32 2\. 4. 1 Klonierungsstrategie zur Generierung des Reporterplasmids pcDNA3.1(+)-Luc 32 2\. 4. 2 Klonierungsstrategie zur Generierung des Expressionsplasmids pTRE2hyg-hMR 33 2\. 4. 3 Restriktionsverdau 33 2\. 4. 4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäurelösungen 34 2\. 4. 5 Agarosegel-Elektrophorese und Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen 34 2\. 4. 6 Dephosphorylierung von linearisierter DNA und Ligation 34 2\. 4. 7 Transformation chemisch kompetenter E. coli 35 2\. 4. 8 Isolierung von Plasmid-DNA 35 2\. 4. 9 PCR und Sequenzierung der Konstrukte 35 2\. 4. 10 Glycerolstocks 36 2\. 4. 11 RNA-Isolierung 36 2\. 4. 12 Reverse Transkription und Real-time PCR 36 2\. 5 Proteinchemische Methoden 37 2\. 5. 1 Gewinnung von Zelllysaten 37 2\. 5. 2 Konzentrationsbestimmungen von Protein- Lösungen 38 2\. 5. 3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 39 2\. 5. 4 Western Blot-Analyse 40 2\. 6 Elektrophysiologische Methoden 40 2\. 6. 1 Die Ussing- Technik 40 2\. 6. 2 Ermittlung des Amilorid-sensitiven Kurzschlussstroms in der Ussing-Kammer 42 2\. 6. 2. 1 Elektrophysiologische Messungen an humanen Colonzelllinien 43 2\. 6. 2. 2 Elektrophysiologische Messungen an distalem Rattencolon 43 2\. 7 Immunologische Methoden 45 2\. 7. 1 Immunfluoreszenz- Färbung 45 2\. 8 Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie 46 2\. 9 Statistische Analysen 46 3 Ergebnisse 47 3\. 1 Modulation des Glucocorticoid-induzierten elektrogenen Na+-Transports durch pro-inflammatorische Zytokine 47 3\. 1. 1 Regulation des ENaC durch TNF-α und Dexamethason im distalen Rattencolon 47 3\. 1. 2 Regulation des ENaC durch TNF-α und Dexamethason in humanen Colonzellen 50 3\. 1. 3 Charakterisierung von ENaC-Promotoraktivität und Glucocorticoid- rezeptor (GR)-Transaktivierung 53 3\. 1. 4 Proteinexpression und subzelluläre Lokalisation des GR 55 3\. 1. 5 Regulation von mRNA-Niveau und -Halblebenszeit des GR-α durch TNF-α 58 3\. 1. 6 Charakterisierung der beteiligten TNF-α-abhängigen Signalwege 60 3\. 1. 7 Wechselwirkung weiterer bei CED relevanter Zytokine mit Glucocorticoid- vermittelten Effekten 63 3\. 2 Charakterisierung eines Aldosteron-sensitiven epithelialen Modells humaner Colonzellen 65 3\. 2. 1 Generierung einer MR-exprimierenden epithelialen Colonzellinie 65 3\. 2. 2 Aldosteron-vermittelte ENaC-Induktion in HT-29/B6 -Tet-On-MR-Zellen 67 3\. 2. 3 Einfluss von Butyrat auf Protein- und mRNA- Expressionsniveau des MR 71 3\. 2. 4 Regulation der MR-abhängigen Transaktivierung durch Butyrat und Aldosteron 73 3\. 2. 5 ENaC- Expressionsniveau und -Aktivität in der apikalen Membran unter Aldosteron und Butyrat 75 4 Diskussion 80 4\. 1 Wechselwirkung von Glucocorticoiden und TNF-α bei der Regulation des elektrogenen Na+-Transports 80 4\. 1. 1 Synergismus von Dexamethason und TNF-α bei der Induktion des ENaC 80 4\. 1. 2 Steigerung des GR-Expressionsniveaus durch TNF-α 81 4\. 1. 3 Wechselwirkung der Glucocorticoid- und TNF-α-abhängigen Signaltransduktion 85 4\. 1. 4 Bedeutung des Synergismus von GC und TNF-α für CED 88 4\. 1. 5 Wechselwirkung weiterer CED-Zytokine mit der GC-vermittelten Signaltransduktion 90 4\. 2 Charakterisierung des Aldosteron-induzierten elektrogenen Na+-Transports via ENaC im Zellmodell 92 4\. 2. 1 Generierung eines MR-exprimierenden epithelialen Modells humaner Colonzellen 92 4\. 2. 2 Steigerung des MR- Expressionsniveaus durch Butyrat 94 4\. 2. 3 Zusammenspiel von Butyrat und Mineralocorticoiden beim ENaC- Targeting 96 5 Zusammenfassung 102 6 Summary 104 7 Literatur 105 8 Abkürzungsverzeichnis 126 9 Anhang 129 Publikationen 129 Lebenslauf 131 Danksagung 132Der elektrogene Natriumtransport wird im distalen Colon durch den Epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) kontrolliert. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist die Induktion des ENaC reduziert, wofür hauptsächlich die Hemmung der Transkription des ENaC durch pro- inflammatorische Zytokine wie TNF-α verantwortlich ist. Dies kann therapeutisch durch den Einsatz von Glucocorticoiden (GC) überwunden werden, die neben einer allgemeinen anti-inflammatorischen Wirkung auch einen schnellen Anstieg der Na+-Resorption zur Folge haben. Während für die ENaC- Induktion durch Mineralocorticoide eine Antagonisierung durch TNF-α nachgewiesen werden konnte, wurde das Zusammenspiel von GC und TNF-α im Hinblick auf die ENaC-Regulation bisher noch nicht untersucht. Daher wurde im ersten Projektteil dieser Arbeit der Einfluss von TNF-α auf die ENaC-Induktion durch das synthetische Glucocorticoid Dexamethason im distalen Rattencolon und in der humanen Colon-Zelllinie HT-29/B6-GR charakterisiert. In beiden Systemen konnte nachgewiesen werden, dass Dexamethason nicht nur der TNF-α-vermittelten Inhibition des ENaC entgegenwirkte, sondern sogar eine synergistische Induktion des ENaC-abhängigen Na+-Transports verursachte. Dieser Synergismus resultierte aus einer durch TNF-α vermittelten Stabilisierung der mRNA des Glucocorticoidrezeptors (GR) und einer daraus folgenden Steigerung des GR- Proteinniveaus im Zusammenspiel mit der Aktivierung des GR durch Dexamethason. Parallel dazu wurde die Transkription der β- und γ-Untereinheit des ENaC gesteigert, wodurch es zu einer erhöhten ENaC-vermittelten Na+-Resorption kam. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass für den beobachteten Synergismus die MAP-Kinase p38 eine entscheidende Rolle spielt. Die Beobachtung eines synergistischen Effekts von TNF-α und Dexamethason bei der Induktion des ENaC- vermittelten Na+-Transports liefert eine Erklärung für die schnelle und ausgeprägte Resorptionssteigerung und anti-diarrhoische Wirkung von Glucocorticoiden bei der Behandlung von CED. Neben Glucocorticoiden wird bei CED die kurzkettige Fettsäure Butyrat therapeutisch eingesetzt. Es wurde beobachtet, dass Butyrat ebenfalls eine transkriptionelle Expressionssteigerung des ENaC bewirkt. Für die Generierung signifikanter Na+-Transportraten via ENaC war die zusätzliche Anwesenheit von Corticosteroiden essentiell, jedoch blieben die zugrunde liegenden Mechanismen aufgrund des Mangels eines Mineralocorticoidrezeptor (MR)-exprimierenden Colonzellmodells bislang ungeklärt. Im zweiten Projektteil dieser Arbeit wurde daher ein epitheliales Colonzellmodell generiert, das induzierbar den MR exprimiert (HT-29/B6-Tet-On-MR). In diesem Zellmodell ließen sich durch nanomolare Dosen des Mineralocorticoids Aldosteron funktionell aktive ENaC- Kanäle induzieren. Voraussetzung dafür war jedoch die gleichzeitige Präsenz von Butyrat, das eine verstärkte Expression des MR nach sich zog. Dies gewährleistete eine Aldosteron-abhängige Stimulation der Expression von β- und γ-ENaC. Da Butyrat allein keinen signifikanten ENaC-vermittelten Na+-Transport auslöste, wurde bei der Suche nach weiteren Aldosteron-abhängigen Genen das Protein GILZ (Glucocorticoid-induced Leucin Zipper) als möglicher Faktor bei der Steigerung des ENaC-Niveaus in der apikalen Zellmembran identifiziert.The epithelial sodium channel (ENaC) mediates electrogenic sodium absorption in the distal large intestine. In patients with inflammatory bowel disease (IBD), ENaC induction is impaired, mainly via transcriptional suppression by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor (TNF)-α. This can be overcome by glucocorticoid therapy which promotes an anti-inflammatory effect as well as a rapid increase in sodium absorption. While ENaC induction by mineralocorticoids has been shown to be antagonized by TNF-α, the interplay between glucocorticoids and TNF-α in ENaC regulation has remained elusive. Therefore, in the first part of this project, the influence of TNF-α on ENaC induction by the synthetic glucocorticoid dexamethasone has been characterized in rat distal colon and in the human colonic cell line HT-29/B6-GR. In both systems, dexamethasone not only preserved TNF-α-mediated ENaC suppression but caused synergistic induction of ENaC-dependent sodium absorption. This synergism was the result of a TNF-α-mediated stabilization of glucocorticoid receptor (GR)-mRNA leading to enhanced GR protein levels and a subsequent GR transactivation by dexamethasone. In parallel, transcription of the ENaC β and γ-subunits was up-regulated which increased ENaC-dependent sodium absorption. Furthermore, it was revealed that the activitiy of mitogen-activated protein kinase p38 was required for the observed synergy. The synergistic increase in ENaC-mediated sodium transport via an enhanced expression of ENaC subunits β and γ dependent on TNF-α and dexamethasone explains the rapid and intense proabsorptive effect of glucocorticoid therapy in IBD. Besides glucocorticoids the short-chain fatty acid butyrate is applied in the therapy of IBD. It was shown that butyrate also induces transcriptional up-regulation of ENaC. Still, for the generation of significant transport rates via ENaC the additional presence of corticosteroids was essential. The underlying mechanisms of this observation remained unknown due to the lack of a colonic cell line expressing functional mineralocorticoid receptor (MR). In the second part of this project, an epithelial colonic cell model inducibly expressing the MR (HT-29/B6-Tet-On-MR) was generated. In this cell model, nanomolar doses of the mineralocorticoid aldosterone induced functional ENaC. The simultaneous presence of butyrate was a prerequisite for this induction, leading to high- level expression of the MR. This allowed for aldosterone-dependent up- regulation of β and γ-ENaC expression. As butyrate alone was not capable of promoting ENaC-mediated sodium transport, aldosterone-induced GILZ (Glucocorticoid-induced Leucin Zipper) was identified as a candidate factor increasing ENaC levels

Secondary school – and what comes next?

Für die Entstehung von migrationsbezogenen Ungleichheiten im Bildungserfolg werden neben leistungsbezogenen Disparitäten (primäre Effekte) auch Unterschiede zwischen Personen mit und ohne Zuwanderungshintergrund in den Bildungsentscheidungen (sekundäre Effekte) als ausschlaggebend erachtet (Boudon, 1974; Heath & Brinbaum, 2007). Diese migrationsbezogenen Unterschiede in Bildungsentscheidungen werden einerseits auf hohe Aspirationen in Zuwandererfamilien sowie antizipierte Diskriminierungen auf dem Ausbildungs- und Arbeitsmarkt zurückgeführt (Heath & Brinbaum, 2007; Kao & Tienda, 1995, 1998). Andererseits wird angenommen, dass auch Unsicherheiten und Orientierungsschwierigkeiten, die aus einer geringeren Kenntnis des deutschen Bildungssystems in Zuwandererfamilien resultieren, zu migrationsbezogenen Unterschieden in Bildungsentscheidungen führen (Becker, 2010; Hillmert, 2005). Beim Übergang in eine Berufsausbildung könnten über die individuellen Entscheidungsprozesse hinaus auch migrationsbezogene Unterschiede im Bewerbungs- und Suchverhalten sowie diskriminierende Rekrutierungspraktiken von Betrieben eine Rolle spielen (Ulrich, 2005, 2006; Skrobanek, 2007). In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig Entscheidungsprozesse von Jugendlichen am Übergang von der Sekundarstufe I in die berufliche Erstausbildung systematisch untersucht, wobei auf Grundlage der dargestellten theoretischen Überlegungen und der Theorie des geplanten Verhaltens (Ajzen, 1991) der Frage nachgegangen wurde, welche Faktoren für die in repräsentativen Studien nachgewiesenen migrations- und geschlechtsbezogenen Disparitäten in der Ausbildungsbeteiligung ausschlaggebend sind. Hierfür wurde ein mehrphasiges Forschungsdesign umgesetzt, das sowohl qualitative als auch quantitative Methoden beinhaltet. Die Datenbasis beruht auf einer Befragung von N=560 Jugendlichen aus elf Berliner Haupt-, Real- und Gesamtschulen. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass sekundäre Effekte des Zuwanderungshintergrunds auch am Übergang von der Sekundarstufe I in die Berufsausbildung bestehen und diese maßgeblich zur Erklärung von migrationsbezogenen Unterschieden in der Ausbildungsbeteiligung kurz nach Schulabschluss beitragen. Für die Entstehung migrationsbezogener Unterschiede in den Bildungsentscheidungen spielten dabei sowohl hohe Aspirationen von Zuwanderern als auch Orientierungsschwierigkeiten, die aus einem geringeren Wissen über das deutsche Bildungssystem resultieren könnten, eine Rolle. Weitere Prädiktoren der Ausbildungsaufnahmeintention waren Einstellungen und subjektiv wahrgenommene Normen zur Ausbildungsaufnahme. Diskriminierungen durch Ausbildungsträger oder migrationsspezifische Bewerbungs- und Suchstrategien scheinen darüber hinaus hingegen nicht ausschlaggebend für die geringeren Übergangsraten von Jugendlichen aus Zuwandererfamilien im Vergleich zu Jugendlichen ohne Zuwanderungshintergrund in eine Berufsausbildung zu sein. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass die in der Gruppe der Zuwanderer zu beobachtenden traditionelleren Geschlechterrollenorientierungen nicht zu differenziellen geschlechtsbezogenen Ungleichheitsmustern zwischen Heranwachsenden mit und ohne Migrationshintergrund in der (Aus-)Bildungsbeteiligung zu führen scheinen.The disadvantage of immigrants in educational success cannot only be explained by differing socioeconomic backgrounds and inequalities in educational achievements (so-called primary effects) but also by immigrant-specific decision behaviour, so called secondary effects of migration background (Boudon, 1974; Heath & Brinbaum, 2007; Kristen, 1999). Those secondary effects of migration background are often assumed to result from high aspirations of immigrants and/or the anticipation of discrimination (Heath & Brinbaum, 2007; Kao & Tienda, 1995, 1998). Other authors argue that orientation difficulties of immigrants due to less detailed knowledge of the German educational system may explain immigrant-specific decision behaviour as well (Becker, 2010; Hillmert, 2005). With regard to the transition from secondary school to vocational training, ethnic differences in the process of searching and applying for vocational training positions as well as discrimination within the labour market could also play a role in the emergence of inequalities between immigrants and non-immigrants (Ulrich, 2005, 2006; Skrobanek, 2007). The present study is the first to systematically examine decision making processes of students at the transition from secondary school to vocational training. The aim was to identify factors that explain the emergence of differences between immigrants and non-immigrants at this transition on the basis of the theoretical assumptions mentioned above and the theory of planned behaviour (Ajzen, 1991). For this purpose, an integrative research design was implemented which incorporates both, qualitative and quantitative methods. The sample comprises 560 students from eight lower secondary schools (Hauptschulen) and three comprehensive schools (Gesamtschulen) in Berlin who completed a questionnaire at the end of their final school year (grade 10). Results revealed that youths from immigrant families intended to take up vocational training after completing secondary school less often than students without migration background, even when previous educational achievement and social background were taken into account. Thus, the results corroborate the assumption that secondary effects of migration background affect the transition from school to vocational training. Furthermore, results suggested that immigrant-specific differences in vocational aspirations as well as immigrant-specific differences in orientation difficulties explained secondary effects of migration background to some extent. Attitudes towards taking up vocational training and subjective norms were also predictors of the intention to take up vocational training. In contrast, discrimination processes and ethnic differences in the process of searching and applying for vocational training positions did not play a role in the emergence of migration-specific inequalities at the transition from school to vocational training when intentions were controlled for. In addition, results show that the more traditional gender role attitudes of immigrants did not result in differential gender-specific inequalities in (vocational) education compared to non- immigrants