Participation of lysophosphatidic acid in human first trimester trophoblast angiogenesis

El establecimiento de la preñez depende de una adecuada coordinación entre diferentes procesos vasculares que ocurren en la interfase materno-fetal. En las etapas tempranas, el trofoblasto extravelloso invasor cumple un rol crítico ya que reemplaza a las células endoteliales de los vasos remodelando las arterias espiraladas uterinas. Durante este proceso, el trofoblasto adquiere un fenotipo endotelial y tapiza las arterias espiraladas del útero transformando los vasos musculares rígidos en sacos sinusoidales flácidos. Este remodelado es fundamental ya que de él depende la formación de la placenta y la llegada de oxígeno y nutrientes al embrión en crecimiento. Se ha postulado que defectos en este mecanismo podrían contribuir a la disfunción placentaria provocando complicaciones obstétricas como las fallas implantatorias o la preclampsia. En nuestro laboratorio estudiamos el rol de mediadores lipídicos en los procesos que tienen lugar en la interfase materno-fetal. En particular, teniendo en cuenta resultados propios y de otros grupos de investigación, en este proyecto nos propusimos investigar el rol del ácido lisofosfatídico (LPA), un potente mensajero de origen lipídico que ejerce su función a través de 6 receptores (LPA1-6). El estudio de la participación del LPA en la implantación del blastocisto, ha puesto de manifiesto el rol preponderante del receptor LPA3 en las primeras etapas de la gestación4-6. Sin embargo, el papel del LPA en la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto humano de primer trimestre, así como en la transformación de la vasculatura uterina durante las etapas tempranas de la gestación, aún no han sido estudiados. Por lo tanto, el objetivo general del presente trabajo es investigar el rol del LPA en la angiogénesis de la interfase materno-fetal durante la gestación temprana. Dada la imposibilidad ética de estudiar el proceso de implantación en humanos, necesariamente se debe recurrir a modelos experimentales in vitro (cultivos de líneas celulares) e in vivo (animales de laboratorio). Por lo tanto, en el presente trabajo adoptamos dos estrategias experimentales. En el primer diseño, utilizamos una línea celular de trofoblasto humano de primer trimestre, HTR-8/SVneo (H8), para investigar la acción in vitro del LPA en la respuesta endovascular del trofoblasto. En el segundo, hembras de la cepa Wistar en día 5 de gestación recibieron una dosis única intra-uterina de un antagonista selectivo del LPA3 (DGPP 0.1 mg/kg). Mediante este diseño experimental in vivo investigamos la participación del LPA endógeno y su receptor LPA3 en diferentes aspectos de la fisiología vascular uterina durante la implantación embrionaria. Observamos que la el LPA induce la formación de túbulos, la migración y la proliferación del trofoblasto humano de primer trimestre, indicando que este mediador lipídico promueve la angiogénesis in vitro del trofoblasto en la interfase materno-fetal. Utilizando antagonistas selectivos de los diferentes subtipos de receptores de LPA, observamos que la formación de túbulos está mediada por el LPA3. Este nuevo rol del LPA en las funciones del trofoblasto implica la participación de las vías de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), siendo el óxido nítrico el último efector en esta cascada de señalización. Además, estudiamos la expresión de diferentes mediadores angiogénicos (VEGF-C, IL-8, IL-6) y observamos que el LPA incrementa la expresión del mRNA de IL-6, y que la liberación de esta citoquina al sobrenadante de cultivo media el efecto del LPA sobre la angiogénesis del trofoblasto. Las hormonas esteroideas, estradiol y progesterona, funcionan como grandes orquestadoras de los procesos que tienen lugar en el sitio de implantación durante las primeras etapas de la gestación. Observamos que la incubación con estradiol y progesterona promueve el fenotipo endovascular del trofoblasto y que este efecto está mediado por el receptor LPA3. La interacción del trofoblasto con el endotelio es fundamental durante el remodelado de las arterias espiraladas. Por lo tanto, decidimos investigar si la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto inducido por LPA, modula el comportamiento de las células endoteliales. Para ello, utilizamos medios condicionados provenientes de ensayos de tubulogénesis de las células H8 incubadas con LPA. Observamos que estos sobrenadantes promueven la migración de las células endoteliales (línea EA.hy926). Esta interacción trofoblasto-endotelio ocurre por la secreción de factores solubles que involucran los productos de las vías de la COX-2, la iNOS y la IL-6. Por último, observamos que el bloqueo farmacológico in vivo del receptor LPA3 aumenta la reabsorción embrionaria en ratas (~60%), lo que se correlaciona con defectos en la macro y microvasculatura, apoyando por lo tanto los resultados obtenidos in vitro. En resumen, en este trabajo de tesis hemos demostrado que el LPA promueve los procesos vasculares del sitio de implantación regulando el fenotipo endovascular del trofoblasto, la interacción trofoblasto-endotelio, y el desarrollo de los vasos sanguíneos del útero. Además, describimos que estos fenómenos estarían modulados por las hormonas esteroideas, las cuales son partícipes fundamentales de los eventos que tienen lugar durante la implantación embrionaria. Estos resultados nos permiten postular nuevas funciones para el LPA vinculadas con el remodelado vascular que tiene lugar en la interfase materno-fetal durante la gestación temprana, mecanismo fundamental para el mantenimiento y el progreso del embarazo.The establishment of successful pregnancy requires a profound reorganization of uterine and fetal tissues. The coordination of vascular processes at the maternal-fetal interface is crucial and involves extravillous trophoblast differentiation into endovascular trophoblast. Endovascular trophoblast invades maternal spiral arteries, and not only disrupts the endothelium-myometrium interactions, but also replaces endothelial and myometrial cells, while acquiring an endothelial-like phenotype. The adequate remodeling of the uterine vessels ensures sufficient blood flow in response to the increasing metabolic demands of the embryo. Failure to achieve these transformations is correlated with severe obstetric complications such as implantation failure and preeclampsia. Much effort is being made to elucidate the molecules and mechanisms that underlie the transformation of fetal trophoblast into the endovascular phenotype. Understanding the possible causes of the disorders associated with inadequate vascular remodeling would help to design new strategies to alleviate these pathologies. Some of the most widely studied mediators in reproduction are the phosphorylated lipids such as Lysophosphatidic acid (LPA). LPA regulates several female reproductive functions through 6 G-protein coupled receptors, LPA1-6. LPA participates in embryo implantation and contributes to vascular physiology in different biological systems. However, the role of LPA on vascular processes at the implantation site has not been investigated. We adopted an in vitro and an in vivo pharmacological approach to study LPA action on trophoblast endovascular response and uterine transformation during early gestation. The HTR-8/SVneo cell line (H8) was used to model the acquisition of the trophoblast endovascular phenotype in vitro. We observed that LPA increased trophoblast tube formation, migration and proliferation. By using selective antagonists, we showed that enhanced tubulogenesis was mediated by LPA3 receptor. In addition, COX-2 and iNOS pathways participated in LPA-stimulated tubulogenesis, being nitric oxide the last effector. When we investigated if the master hormones that orchestrate crucial events at the implantation sites, modulate trophoblast angiogenesis, we observed that estradiol + progesterone increased H8 tube formation via LPA3. The interaction between the trophoblast and the endothelium is relevant during the remodeling of the spiral arteries. We demonstrated that trophoblast LPA-triggered secreted factors increased the migration of the EA.hy926 endothelial cell line. Finally, the administration of a selective LPA3 antagonist to Wistar rats in day 5 of gestation increased the rate of embryo resorption (60%) associated to macro and microvascular defects. Our results demonstrate a new role for LPA during spiral artery remodeling at the maternal-fetal interface, and could help to elucidate the causes of obstetric complications as implantation failure and preeclampsia.Fil: Beltrame, Jimena Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Participación del receptor LPA3 en el desarrollo de la placenta a término

Objetivo: Previamente describimos que el ácidolisofosfatídico promueve la decidualización en el útero de rata vía el receptorLPA3. Por lo tanto, el objetivo fue investigar la participación de LPA3 en eldesarrollo de la placenta a término. Materiales y métodos: un grupo de ratas Wistar en eldía 5 de preñez recibió una dosis intrauterina de DGPP (antagonista de LPA3) ovehículo (control) y se las sacrificó en el día 21. Previamente describimos queeste tratamiento aumenta la reabsorción embrionaria sin modificar el número desitios de implantación. Por lo tanto, en los sitios controles fue posiblediscriminar la placenta, el útero y la decidua. En los sitios reabsorbidos seaislaron la unidad fetoplacentaria, el útero y el botón decidual. Se realizaronestudios macroscópicos y microscópicos. Resultados: no se observaron diferencias en lamorfología histológica del útero proveniente de los sitios de implantacióncontrol y no reabsorbido frente a los reabsorbidos presentes en el cuernotratado con DGPP. Las placentas control presentaron una arquitectura tisularconservada acorde con su edad gestacional. Sin embargo, las placentas de lossitios no reabsorbidos exhibieron una zona basal engrosada con un aumento en elcontenido de glucógeno y de células gigantes. Las placentas de los sitiosreabsorbidos presentaron una arquitectura totalmente desorganizada, con grandesdepósitos de fibrina, núcleos picnóticos, extravasación eritrocitaria einfiltración con neutrófilos. Conclusiones: la ablación farmacológica del receptorLPA3 durante la implantación embrionaria modula eventos relevantes, como ladecidualización, que tienen consecuencias sobre la placentación y el desarrollofetal, comprometiendo el éxito de la gestación.Objective: we previously observed that lysophosphatidic acid modulates decidualization in the rat uterus through LPA3 receptor. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of LPA3 in placenta development at term. Materials and methods: Wistar rats on day 5 of pregnancy received an intra-uterine dose of DGPP (LPA3 receptor antagonist) or vehicle (control). Rats on day 21 of gestation were sacrificed. Previously we described that this treatment induces embryonic resorption without changes in the number of implantations sites. Therefore, in the control horn, the placenta, the uterus and the decidua were extracted. In the DGPP horn, the feto-placental units, the uterus and the decidua were separated. Micro and macroscopic studies were performed. Results: histological studies of the uterus show no morphological differences between control, non-resorbed and resorbed implantation sites. Placentas obtained from control sites, exhibited the typical architecture for their gestational age. However, placentas from not resorbed sites showed a wider basal zone with an increase in the glycogen content and the number of giant cells. Finally, placentas from resorbed sites displayed a completely disorganized structure with fibrin deposits, picnotic nuclei, erythrocyte extravasation and neutrophil infiltration. Conclusions: the pharmacological ablation of LPA3 receptor during the window of implantation modulates primordial events as decidualization that has strong consequences in placentation and the well-being of the fetuses, thus affecting pregnancy outcome.Fil: Sordelli, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Cañumil, Vanesa Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

Maternal exposure to an enrichment environment promotes uterine vascular remodeling and prevents embryo loss in mice.

Implantation-related events are crucial for pregnancy success. In particular, defects in vascular remodeling at the maternal-fetal interface are associated with spontaneous miscarriage and recurrent pregnancy loss. Physical activity and therapies oriented to reduce stress improve pregnancy outcomes. In animal models, environmental stimulation and enrichment are associated with enhanced well-being, cognitive function and stress resilience. Here, we studied whether the exposure of BALB/c mice to an enriched environment (EE) regulates crucial events during early gestation at the maternal-fetal interface. Pregnant BALB/c mice were exposed to the EE that combines non-invasive stimuli from the sensory pathway with voluntary physical activity. The pregnancy rate was evaluated. Implantation sites were investigated microscopically and macroscopically. Vascular adaptation parameters at the maternal-fetal interface were analyzed. We found that exposure to the EE prevented pregnancy loss between gestational days 7 and 15. Also, it increased the diameter of the uterine artery and decreased the wall:lumen ratio of the mesometrial decidual vessels, suggesting that EE exposure promotes vascular remodeling. Moreover, it increased nitric oxide synthase activity and inducible nitric oxide synthase expression, as well as prostaglandin F2a production and endoglin expression in the implantation sites. Exposure of pregnant females to the EE regulates uterine physiology, promoting vascular remodeling during early gestation. These adaptations might contribute to preventing embryo loss. Our results highlight the importance of the maternal environment for pregnancy success. The design of an 'EE-like' protocol for humans could be considered as a new non-pharmacologic strategy to prevent implantation failure and recurrent miscarriage.Fil: de la Cruz Borthiry, Fernanda Luz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Schander, Julieta Aylen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Cella, Maximiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Franchi, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

A physiological concentration of anandamide promotes the migration of human endometrial fibroblast and the interaction with endothelial cells in vitro

The mechanisms that govern fibroblast behavior during the vascular adaptations of the uterus at early pregnancy remain unknown. Anandamide, an endocannabinoid, binds to cannabinoid receptors (CBs), and regulates gestation and angiogenesis. Its tone is regulated by fatty acid amide hydrolase (FAAH) within the uterus. We investigated the role of anandamide in endometrial fibroblasts migration and whether anandamide modulates fibroblasts-endothelial crosstalk.Fil: Cañumil, Vanesa Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: de la Cruz Borthiry, Fernanda Luz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Scheffer, Frida. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Herrero, Yamila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Scotti, Leopoldina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Bogetti, Maria Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Meresman, Gabriela Fabiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Franchi, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

Participación del ácido lisofosfatídico en la angiogénesis del trofoblasto humano de primer trimestre

El establecimiento de la preñez depende de una adecuada coordinación entre diferentes procesos vasculares que ocurren en la interfase materno-fetal. En las etapas tempranas, el trofoblasto extravelloso invasor cumple un rol crítico ya que reemplaza a las células endoteliales de los vasos remodelando las arterias espiraladas uterinas. Durante este proceso, el trofoblasto adquiere un fenotipo endotelial y tapiza las arterias espiraladas del útero transformando los vasos musculares rígidos en sacos sinusoidales flácidos. Este remodelado es fundamental ya que de él depende la formación de la placenta y la llegada de oxígeno y nutrientes al embrión en crecimiento. Se ha postulado que defectos en este mecanismo podrían contribuir a la disfunción placentaria provocando complicaciones obstétricas como las fallas implantatorias o la preclampsia. En nuestro laboratorio estudiamos el rol de mediadores lipídicos en los procesos que tienen lugar en la interfase materno-fetal. En particular, teniendo en cuenta resultados propios y de otros grupos de investigación, en este proyecto nos propusimos investigar el rol del ácido lisofosfatídico (LPA), un potente mensajero de origen lipídico que ejerce su función a través de 6 receptores (LPA1-6). El estudio de la participación del LPA en la implantación del blastocisto, ha puesto de manifiesto el rol preponderante del receptor LPA3 en las primeras etapas de la gestación4-6. Sin embargo, el papel del LPA en la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto humano de primer trimestre, así como en la transformación de la vasculatura uterina durante las etapas tempranas de la gestación, aún no han sido estudiados. Por lo tanto, el objetivo general del presente trabajo es investigar el rol del LPA en la angiogénesis de la interfase maternofetal durante la gestación temprana. Dada la imposibilidad ética de estudiar el proceso de implantación en humanos, necesariamente se debe recurrir a modelos experimentales in vitro (cultivos de líneas celulares) e in vivo (animales de laboratorio). Por lo tanto, en el presente trabajo adoptamos dos estrategias experimentales. En el primer diseño, utilizamos una línea celular de trofoblasto humano de primer trimestre, HTR-8/SVneo (H8), para investigar la acción in vitro del LPA en la respuesta endovascular del trofoblasto. En el segundo, hembras de la cepa Wistar en día 5 de gestación recibieron una dosis única intra-uterina de un antagonista selectivo del LPA3 (DGPP 0.1 mg/kg). Mediante este diseño experimental in vivo investigamos la participación del LPA endógeno y su receptor LPA3 en diferentes aspectos de la fisiología vascular uterina durante la implantación embrionaria. Observamos que la el LPA induce la formación de túbulos, la migración y la proliferación del trofoblasto humano de primer trimestre, indicando que este mediador lipídico promueve la angiogénesis in vitro del trofoblasto en la interfase materno-fetal. Utilizando antagonistas selectivos de los diferentes subtipos de receptores de LPA, observamos que la formación de túbulos está mediada por el LPA3. Este nuevo rol del LPA en las funciones del trofoblasto implica la participación de las vías de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), siendo el óxido nítrico el último efector en esta cascada de señalización. Además, estudiamos la expresión de diferentes mediadores angiogénicos (VEGF-C, IL-8, IL-6) y observamos que el LPA incrementa la expresión del mRNA de IL-6, y que la liberación de esta citoquina al sobrenadante de cultivo media el efecto del LPA sobre la angiogénesis del trofoblasto. Las hormonas esteroideas, estradiol y progesterona, funcionan como grandes orquestadoras de los procesos que tienen lugar en el sitio de implantación durante las primeras etapas de la gestación. Observamos que la incubación con estradiol y progesterona promueve el fenotipo endovascular del trofoblasto y que este efecto está mediado por el receptor LPA3. La interacción del trofoblasto con el endotelio es fundamental durante el remodelado de las arterias espiraladas. Por lo tanto, decidimos investigar si la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto inducido por LPA, modula el comportamiento de las células endoteliales. Para ello, utilizamos medios condicionados provenientes de ensayos de tubulogénesis de las células H8 incubadas con LPA. Observamos que estos sobrenadantes promueven la migración de las células endoteliales (línea EA.hy926). Esta interacción trofoblasto-endotelio ocurre por la secreción de factores solubles que involucran los productos de las vías de la COX-2, la iNOS y la IL-6. Por último, observamos que el bloqueo farmacológico in vivo del receptor LPA3 aumenta la reabsorción embrionaria en ratas (~60%), lo que se correlaciona con defectos en la macro y microvasculatura, apoyando por lo tanto los resultados obtenidos in vitro. En resumen, en este trabajo de tesis hemos demostrado que el LPA promueve los procesos vasculares del sitio de implantación regulando el fenotipo endovascular del trofoblasto, la interacción trofoblastoendotelio, y el desarrollo de los vasos sanguíneos del útero. Además, describimos que estos fenómenos estarían modulados por las hormonas esteroideas, las cuales son partícipes fundamentales de los eventos que tienen lugar durante la implantación embrionaria. Estos resultados nos permiten postular nuevas funciones para el LPA vinculadas con el remodelado vascular que tiene lugar en la interfase materno-fetal durante la gestación temprana, mecanismo fundamental para el mantenimiento y el progreso del embarazo.The establishment of successful pregnancy requires a profound reorganization of uterine and fetal tissues. The coordination of vascular processes at the maternal-fetal interface is crucial and involves extravillous trophoblast differentiation into endovascular trophoblast. Endovascular trophoblast invades maternal spiral arteries, and not only disrupts the endothelium-myometrium interactions, but also replaces endothelial and myometrial cells, while acquiring an endothelial-like phenotype. The adequate remodeling of the uterine vessels ensures sufficient blood flow in response to the increasing metabolic demands of the embryo. Failure to achieve these transformations is correlated with severe obstetric complications such as implantation failure and preeclampsia. Much effort is being made to elucidate the molecules and mechanisms that underlie the transformation of fetal trophoblast into the endovascular phenotype. Understanding the possible causes of the disorders associated with inadequate vascular remodeling would help to design new strategies to alleviate these pathologies. Some of the most widely studied mediators in reproduction are the phosphorylated lipids such as Lysophosphatidic acid (LPA). LPA regulates several female reproductive functions through 6 G-protein coupled receptors, LPA1-6. LPA participates in embryo implantation and contributes to vascular physiology in different biological systems. However, the role of LPA on vascular processes at the implantation site has not been investigated. We adopted an in vitro and an in vivo pharmacological approach to study LPA action on trophoblast endovascular response and uterine transformation during early gestation. The HTR-8/SVneo cell line (H8) was used to model the acquisition of the trophoblast endovascular phenotype in vitro. We observed that LPA increased trophoblast tube formation, migration and proliferation. By using selective antagonists, we showed that enhanced tubulogenesis was mediated by LPA3 receptor. In addition, COX-2 and iNOS pathways participated in LPA-stimulated tubulogenesis, being nitric oxide the last effector. When we investigated if the master hormones that orchestrate crucial events at the implantation sites, modulate trophoblast angiogenesis, we observed that estradiol + progesterone increased H8 tube formation via LPA3. The interaction between the trophoblast and the endothelium is relevant during the remodeling of the spiral arteries. We demonstrated that trophoblast LPA-triggered secreted factors increased the migration of the EA.hy926 endothelial cell line. Finally, the administration of a selective LPA3 antagonist to Wistar rats in day 5 of gestation increased the rate of embryo resorption (60%) associated to macro and microvascular defects. Our results demonstrate a new role for LPA during spiral artery remodeling at the maternal-fetal interface, and could help to elucidate the causes of obstetric complications as implantation failure and preeclampsia.Fil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

Participation of lysophosphatidic acid in human first trimester trophoblast angiogenesis

El establecimiento de la preñez depende de una adecuada coordinación entre diferentes procesos vasculares que ocurren en la interfase materno-fetal. En las etapas tempranas, el trofoblasto extravelloso invasor cumple un rol crítico ya que reemplaza a las células endoteliales de los vasos remodelando las arterias espiraladas uterinas. Durante este proceso, el trofoblasto adquiere un fenotipo endotelial y tapiza las arterias espiraladas del útero transformando los vasos musculares rígidos en sacos sinusoidales flácidos. Este remodelado es fundamental ya que de él depende la formación de la placenta y la llegada de oxígeno y nutrientes al embrión en crecimiento. Se ha postulado que defectos en este mecanismo podrían contribuir a la disfunción placentaria provocando complicaciones obstétricas como las fallas implantatorias o la preclampsia. En nuestro laboratorio estudiamos el rol de mediadores lipídicos en los procesos que tienen lugar en la interfase materno-fetal. En particular, teniendo en cuenta resultados propios y de otros grupos de investigación, en este proyecto nos propusimos investigar el rol del ácido lisofosfatídico (LPA), un potente mensajero de origen lipídico que ejerce su función a través de 6 receptores (LPA1-6). El estudio de la participación del LPA en la implantación del blastocisto, ha puesto de manifiesto el rol preponderante del receptor LPA3 en las primeras etapas de la gestación4-6. Sin embargo, el papel del LPA en la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto humano de primer trimestre, así como en la transformación de la vasculatura uterina durante las etapas tempranas de la gestación, aún no han sido estudiados. Por lo tanto, el objetivo general del presente trabajo es investigar el rol del LPA en la angiogénesis de la interfase materno-fetal durante la gestación temprana. Dada la imposibilidad ética de estudiar el proceso de implantación en humanos, necesariamente se debe recurrir a modelos experimentales in vitro (cultivos de líneas celulares) e in vivo (animales de laboratorio). Por lo tanto, en el presente trabajo adoptamos dos estrategias experimentales. En el primer diseño, utilizamos una línea celular de trofoblasto humano de primer trimestre, HTR-8/SVneo (H8), para investigar la acción in vitro del LPA en la respuesta endovascular del trofoblasto. En el segundo, hembras de la cepa Wistar en día 5 de gestación recibieron una dosis única intra-uterina de un antagonista selectivo del LPA3 (DGPP 0.1 mg/kg). Mediante este diseño experimental in vivo investigamos la participación del LPA endógeno y su receptor LPA3 en diferentes aspectos de la fisiología vascular uterina durante la implantación embrionaria. Observamos que la el LPA induce la formación de túbulos, la migración y la proliferación del trofoblasto humano de primer trimestre, indicando que este mediador lipídico promueve la angiogénesis in vitro del trofoblasto en la interfase materno-fetal. Utilizando antagonistas selectivos de los diferentes subtipos de receptores de LPA, observamos que la formación de túbulos está mediada por el LPA3. Este nuevo rol del LPA en las funciones del trofoblasto implica la participación de las vías de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), siendo el óxido nítrico el último efector en esta cascada de señalización. Además, estudiamos la expresión de diferentes mediadores angiogénicos (VEGF-C, IL-8, IL-6) y observamos que el LPA incrementa la expresión del mRNA de IL-6, y que la liberación de esta citoquina al sobrenadante de cultivo media el efecto del LPA sobre la angiogénesis del trofoblasto. Las hormonas esteroideas, estradiol y progesterona, funcionan como grandes orquestadoras de los procesos que tienen lugar en el sitio de implantación durante las primeras etapas de la gestación. Observamos que la incubación con estradiol y progesterona promueve el fenotipo endovascular del trofoblasto y que este efecto está mediado por el receptor LPA3. La interacción del trofoblasto con el endotelio es fundamental durante el remodelado de las arterias espiraladas. Por lo tanto, decidimos investigar si la adquisición del fenotipo endovascular del trofoblasto inducido por LPA, modula el comportamiento de las células endoteliales. Para ello, utilizamos medios condicionados provenientes de ensayos de tubulogénesis de las células H8 incubadas con LPA. Observamos que estos sobrenadantes promueven la migración de las células endoteliales (línea EA.hy926). Esta interacción trofoblasto-endotelio ocurre por la secreción de factores solubles que involucran los productos de las vías de la COX-2, la iNOS y la IL-6. Por último, observamos que el bloqueo farmacológico in vivo del receptor LPA3 aumenta la reabsorción embrionaria en ratas (~60%), lo que se correlaciona con defectos en la macro y microvasculatura, apoyando por lo tanto los resultados obtenidos in vitro. En resumen, en este trabajo de tesis hemos demostrado que el LPA promueve los procesos vasculares del sitio de implantación regulando el fenotipo endovascular del trofoblasto, la interacción trofoblasto-endotelio, y el desarrollo de los vasos sanguíneos del útero. Además, describimos que estos fenómenos estarían modulados por las hormonas esteroideas, las cuales son partícipes fundamentales de los eventos que tienen lugar durante la implantación embrionaria. Estos resultados nos permiten postular nuevas funciones para el LPA vinculadas con el remodelado vascular que tiene lugar en la interfase materno-fetal durante la gestación temprana, mecanismo fundamental para el mantenimiento y el progreso del embarazo.The establishment of successful pregnancy requires a profound reorganization of uterine and fetal tissues. The coordination of vascular processes at the maternal-fetal interface is crucial and involves extravillous trophoblast differentiation into endovascular trophoblast. Endovascular trophoblast invades maternal spiral arteries, and not only disrupts the endothelium-myometrium interactions, but also replaces endothelial and myometrial cells, while acquiring an endothelial-like phenotype. The adequate remodeling of the uterine vessels ensures sufficient blood flow in response to the increasing metabolic demands of the embryo. Failure to achieve these transformations is correlated with severe obstetric complications such as implantation failure and preeclampsia. Much effort is being made to elucidate the molecules and mechanisms that underlie the transformation of fetal trophoblast into the endovascular phenotype. Understanding the possible causes of the disorders associated with inadequate vascular remodeling would help to design new strategies to alleviate these pathologies. Some of the most widely studied mediators in reproduction are the phosphorylated lipids such as Lysophosphatidic acid (LPA). LPA regulates several female reproductive functions through 6 G-protein coupled receptors, LPA1-6. LPA participates in embryo implantation and contributes to vascular physiology in different biological systems. However, the role of LPA on vascular processes at the implantation site has not been investigated. We adopted an in vitro and an in vivo pharmacological approach to study LPA action on trophoblast endovascular response and uterine transformation during early gestation. The HTR-8/SVneo cell line (H8) was used to model the acquisition of the trophoblast endovascular phenotype in vitro. We observed that LPA increased trophoblast tube formation, migration and proliferation. By using selective antagonists, we showed that enhanced tubulogenesis was mediated by LPA3 receptor. In addition, COX-2 and iNOS pathways participated in LPA-stimulated tubulogenesis, being nitric oxide the last effector. When we investigated if the master hormones that orchestrate crucial events at the implantation sites, modulate trophoblast angiogenesis, we observed that estradiol + progesterone increased H8 tube formation via LPA3. The interaction between the trophoblast and the endothelium is relevant during the remodeling of the spiral arteries. We demonstrated that trophoblast LPA-triggered secreted factors increased the migration of the EA.hy926 endothelial cell line. Finally, the administration of a selective LPA3 antagonist to Wistar rats in day 5 of gestation increased the rate of embryo resorption (60%) associated to macro and microvascular defects. Our results demonstrate a new role for LPA during spiral artery remodeling at the maternal-fetal interface, and could help to elucidate the causes of obstetric complications as implantation failure and preeclampsia.Fil: Beltrame, Jimena Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Novel Role for Lysophosphatidic Acid in Vascular Remodeling at the Maternal-Fetal Interface

Lysophosphatidic acid (LPA) belongs to the group of phosphorylated lipids reported as crucial mediators in the physiology of reproduction. LPA binds to G-protein coupled receptors and regulates a wide range of female reproductive functions. This bioactive lipid has been also implicated in vascular functions during physiological and pathological conditions. In this regard, the establishment of a successful pregnancy requires proper coordination of vascular processes and remodeling of maternal blood vessels during early gestation. During this process, first trimester cytotrophoblast changes from an invasive to an endovascular phenotype and transforms uterine spiral arteries which are the nutrient supply for placenta and fetus. Here we present an overview of LPA participation in vascular remodeling and highlight the importance of LPA-LPA3 signaling during early gestation at the maternal-fetal interface.Fil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Cañumil, Vanesa Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Sordelli, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

Cyclooxygenase-2 prostaglandins mediate anandamide-inhibitory action on nitric oxide synthase activity in the receptive rat uterus

Anandamide, an endocannabinoid, prostaglandins derived from cyclooxygenase-2 and nitric oxide synthesized by nitric oxide synthase (NOS), are relevant mediators of embryo implantation. We adopted a pharmacological approach to investigate if anandamide modulated NOS activity in the receptive rat uterus and if prostaglandins mediated this effect. As we were interested in studying the changes that occur at the maternal side of the fetalmaternal interface, we worked with uteri obtained from pseudopregnant rats. Females were sacrificed on day 5 of pseudopregnancy, the day in which implantation would occur, and the uterus was obtained. Anandamide (2 ng/kg, i.p.) inhibited NOS activity (P < 0.001) and increased the levels of prostaglandin E2 (P < 0.01) and prostaglandin F2α(P < 0.01). These effects were mediated via cannabinoid receptor type 2, as the pre-treatment with SR144528 (10 mg/kg, i.p.), a selective cannabinoid receptor type 2 antagonist, completely reverted anandamide effect on NOS activity and prostaglandin levels. The pre-treatment with a non-selective cyclooxygenase inhibitor (indomethacin 2.5 mg/kg, i.p.) or with selective cyclooxygenase-2 inhibitors (meloxicam 4 mg/kg, celecoxib 3 mg/kg, i.p.) reverted anandamide inhibition on NOS, suggesting that prostaglandins are derived from cyclooxygenase-2 mediated anandamide effect. Thus, anandamide levels seemed to modulate NOS activity, fundamental for implantation, via cannabinoid receptor type 2 receptors, in the receptive uterus. This modulation depends on the production of cyclooxygenase-2 derivatives. These data establish cannabinoid receptors and cyclooxygenase enzymes as an interesting target for the treatment of implantation deficiencies. © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.Fil: Sordelli, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Cella, Maximiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Franchi, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

Lysophosphatidic acid-triggered pathways promote the acquisition of trophoblast endovascular phenotype in vitro

Successful implantation and placentation requires that extravillous cytotrophoblast acquires an endovascular phenotype and remodels uterine spiral arteries. Defects in this mechanism correlate with severe obstetric complications as implantation failure and preeclampsia. Lysophosphatidic acid (LPA) participates in embryo implantation and contributes to vascular physiology in different biological systems. However, the role of LPA on trophoblast endovascular transformation has not been studied. Due to difficulties in studying human pregnancy in vivo, we adopted a pharmacological approach in vitro to investigate LPA action in various aspects of trophoblast endovascular response, such as the formation of endothelial capillary-like structures, migration, and proliferation. The HTR-8/SVneo cell line established from human first trimester cytotrophoblast was used to model the acquisition of the endovascular phenotype by the invading trophoblast. LPA increased HTR-8/SVneo tube formation, migration (wound healing assay and phalloidin staining) and proliferation (MTT assay). LPA G protein-coupled receptors, LPA1 and LPA3, were expressed in HTR-8/SVneo. By using selective antagonists, we showed that enhanced tubulogenesis was mediated by LPA3. In addition, cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase pathways participated in LPA-stimulated tubulogenesis. Inducible nitric oxide synthase was activated downstream cyclooxygenase-2. Furthermore, prostaglandin E2 and a nitric oxide donor (SNAP) increased trophoblast tube formation in a concentration-dependent manner. Finally, we observed that cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase were localized in the nucleus, and LPA did not modify their cellular distribution. Our results show that LPA-triggered regulatory pathways promote trophoblast endovascular response in vitro, suggesting a new role for LPA during spiral artery remodeling at the maternal-fetal interface.Fil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Sordelli, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Cañumil, Vanesa Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Franchi, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentin

Lysophosphatidic acid increases the production of pivotal mediators of decidualization and vascularization in the rat uterus

Introduction: The decidual reaction and the formation of new vessels in the uterus are two crucial processes during embryo implantation. Previously, we observed that lysophosphatidic acid (LPA) increases cyclooxygenase-2 derived ? prostaglandin E2 production during implantation in the rat uterus and that it augments the expression of decidualization (IGFBP-1) and vascularization (IL-10) markers. Both cyclooxygenase and nitric oxide synthase (NOS) are known enzymes involved in these processes. Thus, we became interested in studying which factors contribute to LPA receptor-specific role during the decidual and the vascular reaction at implantation. Methods: We adopted a pharmacological approach in vitro incubating the uterus from rats on day 5 of gestation (day of implantation) with LPA, DGPP (a highly selective antagonist of LPA3, an LPA receptor) and cyclooxygenase and NOS selective and non selective inhibitors. We determined NOS activity, prostaglandin E2 production and IGFBP-1 and IL-10 expression to evaluate decidualization and vascularization. Results: We observed that LPA augmented the activity of the inducible NOS isoform through LPA1/LPA3. Inducible NOS activity participated in the induction of cyclooxygenase-2/prostaglandin E2 increment stimulated by LPA. Also, cyclooxygenase-2 derived prostaglandins mediated LPA-stimulatory action on NOS activity. Both cyclooxygenase-2 and inducible NOS mediated LPA effect on IGFBP-1 and IL-10 expression. Conclusions: These results suggest the participation of LPA/LPA3 in the production of crucial molecules involved in vascularization and decidualization, two main processes that prepare the uterine milieu for embryo invasion during implantation.Fil: Beltrame, Jimena Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Sordelli, Micaela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Cella, Maximiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Perez Martinez, Silvina Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Franchi, Ana Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; ArgentinaFil: Ribeiro, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentin