Research Models for Studying Vascular Calcification

Calcification of the vessel wall contributes to high cardiovascular morbidity and mortality. Vascular calcification (VC) is a systemic disease with multifaceted contributing and inhibiting factors in an actively regulated process. The exact underlying mechanisms are not fully elucidated and reliable treatment options are lacking. Due to the complex pathophysiology, various research models exist evaluating different aspects of VC. This review aims to give an overview of the cell and animal models used so far to study the molecular processes of VC. Here, in vitro cell culture models of different origins, ex vivo settings using aortic tissue and various in vivo disease-induced animal models are summarized. They reflect different aspects and depict the (patho)physiologic mechanisms within the VC process

Die Vaskuläre Kalzifizierung – eine Diversifizierung der experimentellen Methoden

Kardiovaskuläre Erkrankungen tragen wesentlich zu Morbidität und Mortalität des Menschen bei und sind eine altersabhängige Erscheinung. Wesentliche Ursache sind die systemischen Vaskulopathien Atherosklerose und Arteriosklerose, die mit einer Kalzifizierung der Arterien einhergehen. Insbesondere die Kalzifizierung der tunica media ist histologisches Korrelat für sowohl das physiologische als auch pathologische, vorzeitige vaskuläre Altern. In den letzten Jahrzehnten sind einige Schlüsselmechanismen und Risikofaktoren identifiziert worden, deren genaues Zusammenspiel und einzelne Bedeutung noch nicht vollständig verstanden sind. Darüber hinaus existieren auch keine krankheitsübergreifenden therapeutischen Möglichkeiten, so dass das Ziel dieser Arbeit ist, zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie beizutragen und damit die Identifikation therapeutischer Ziele zu erleichtern. Im Rahmen zweier narrativer Reviews wurden die pathophysiologischen und methodischen Grundlagen der vaskulären Kalzifizierung in der Grundlagenwissenschaft erarbeitet und diese im Rahmen einer experimentellen Originalarbeit angewandt. Dabei wurden Ratten über 24 Wochen mit Azathioprin gefüttert und sein Einfluss auf die vaskuläre Kalzifizierung mittels Kalziumquanitifzierung, real-time PCR und Alizarin-Rot Färbung untersucht. Für die nachgewiesene Azathioprin-induzierte Kalzifizierung konnte das NLRP-3 Inflammasom im Rahmen von ex vivo Versuchen mit NLRP-3 knockout Mäusen als kritischer Signalweg identifiziert und die Rolle von Zellstress für den vaskulären Alterungsprozess herausgearbeitet werden. Im Rahmen dieser Arbeiten ergaben sich bei den etablierten experimentellen Methoden eine eingeschränkte Beurteilbarkeit der örtlichen Kommunikation zwischen Endothel, glatten Gefäßmuskelzellen und der EZM sowie des zeitlichen Verlaufs zwischen Kalzifizierung und Gefäßalterung, so dass im Rahmen zweier weiterer experimenteller Originalarbeiten neue Methoden etabliert wurden: Das Modell der isoliert-perfundierten Rattenaorta, bei welchem explantierte Rattenaorten für 14 Tage extrakorporal mit Kontrollmedium bzw. einem Induktor der Kalzifizierung perfundiert werden, ermöglicht die Untersuchung der Kalzifizierungsprozesse in einem physiologischen, vaskulären Milieu. Zur besseren Untersuchbarkeit des zeitlichen Verlaufs von Kalzifizierung und Seneszenz wurden neue Protokolle zur Diversifizierung der Auswertungsmethoden mittels Immunhistochemie und RNA-in-situ-Hybridisierung etabliert, um die Expression von Markern der Seneszenz und der Kalzifizierung parallel, aber Individualzell-basiert mittels Fluoreszenzmikroskopie zu messen. Mit dieser Disseration konnte die besondere Rolle von Zellstress für die Induktion der vaskulären Kalzifizierung am Beispiel von Azathioprin und ein zugehöriger Signalweg identifiziert werden und auf Basis der experimentellen Erfahrungen und Einsichten neue Modelle zur Untersuchung der vaskulären Kalzifizierung etabliert werden.Cardiovascular diseases contribute significantly to human morbidity and mortality and are an age-related phenomenon. The main causes are the systemic vasculopathies atherosclerosis and arteriosclerosis, which are associated with calcification of the arteries. In particular, calcification of the tunica media is a histological correlate of both physiological and pathological premature vascular aging. In recent decades, several key mechanisms and risk factors have been identified whose precise interplay and individual significance are not yet fully understood. In addition, cross-disease therapeutic options do not exist either, so the aim of this work is to contribute to a better understanding of the pathophysiology and thus facilitate the identification of therapeutic targets. In two narrative reviews, the pathophysiological and methodological basis of vascular calcification was elaborated and applied in the context of an original experimental work. In this work, rats were fed azathioprine for 24 weeks and its effect on vascular calcification was examined by calcium quantification, real-time PCR, and alizarin red staining. For the detected azathioprine-induced calcification, ex vivo experiments with NLRP-3 knockout mice identified the NLRP-3 inflammasome as a critical signaling pathway and elaborated the role of cell stress in the vascular aging process. In the course of this work, established methods revealed limited assessability of local communication between endothelium, vascular smooth muscle cells, and the extracellular matrix, as well as of the time course between calcification and vascular aging, so that new methods were established in the course of two additional original experimental studies: The isolated-perfused rat aorta model, in which explanted rat aortas are perfused extracorporeally with control medium or an inducer of calcification for 14 days, allows the study of calcification processes in a physiological, vascular milieu. To improve the ability to study the time course of calcification and senescence, new protocols were established to diversify the evaluation methods using immunohistochemistry and RNA in situ hybridization to measure the expression of markers of senescence and calcification in a parallel but individual cell-based manner by fluorescence microscopy. This work identified the specific role of cell stress in the induction of vascular calcification by azathioprine and an associated signaling pathway and, based on experimental experience and insights, diversified the methodology for studying vascular calcification

A Novel Long-Term ex vivo Model for Studying Vascular Calcification Pathogenesis: The Rat Isolated-Perfused Aorta

The investigation of vascular calcification and its underlying cellular and molecular pathways is of great interest in current research efforts. Therefore, suitable assays are needed to allow examination of the complex calcification process under controlled conditions. The current study describes a new ex vivo model of isolated-perfused rat aortic tissue with subsequent quantification and vessel staining to analyze the calcium content of the aortic wall. A rat aorta was perfused ex vivo with control and calcification media for 14 days, respectively. The calcification medium was luminally perfused and induced a significant increase in calcium deposition within the media of the vessel wall detected alongside the elastic laminae. Perfusion with control medium induced no calcification. In addition, the mRNA expression of the osteogenic marker bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) increased in aortic tissue after perfusion, while SM22α as smooth muscle marker decreased. This newly developed ex vivo model of isolated-perfused rat aorta is suitable for vascular calcification studies testing inducers and inhibitors of vessel calcification and studying signaling pathways within calcification progression

Uremic mouse model to study vascular calcification and “inflamm-aging”

Calcification and chronic inflammation of the vascular wall is a high-risk factor for cardiovascular mortality, especially in patients with chronic uremia. For the reduction or prevention of rapid disease progression, no specific treatment options are currently available. This study aimed to evaluate an adenine-based uremic mouse model for studying medial vessel calcification and senescence-associated secretory phenotype (SASP) changes of aortic tissue to unravel molecular pathogenesis and provide a model for therapy testing. The dietary adenine administration induced a stable and similar degree of chronic uremia in DBA2/N mice with an increase of uremia blood markers such as blood urea nitrogen, calcium, creatinine, alkaline phosphatase, and parathyroid hormone. Also, renal fibrosis and crystal deposits were detected upon adenine feeding. The uremic condition is related to a moderate to severe medial vessel calcification and subsequent elastin disorganization. In addition, expression of osteogenic markers as Bmp-2 and its transcription factor Sox-9 as well as p21 as senescence marker were increased in uremic mice compared to controls. Pro-inflammatory uremic proteins such as serum amyloid A, interleukin (I1)-1 beta, and I1-6 increased. This novel model of chronic uremia provides a simple method for investigation of signaling pathways in vascular inflammation and calcification and therefore offers an experimental basis for the development of potential therapeutic intervention studies

Uremic mouse model to study vascular calcification and “inflamm-aging”

Calcification and chronic inflammation of the vascular wall is a high-risk factor for cardiovascular mortality, especially in patients with chronic uremia. For the reduction or prevention of rapid disease progression, no specific treatment options are currently available. This study aimed to evaluate an adenine-based uremic mouse model for studying medial vessel calcification and senescence-associated secretory phenotype (SASP) changes of aortic tissue to unravel molecular pathogenesis and provide a model for therapy testing. The dietary adenine administration induced a stable and similar degree of chronic uremia in DBA2/N mice with an increase of uremia blood markers such as blood urea nitrogen, calcium, creatinine, alkaline phosphatase, and parathyroid hormone. Also, renal fibrosis and crystal deposits were detected upon adenine feeding. The uremic condition is related to a moderate to severe medial vessel calcification and subsequent elastin disorganization. In addition, expression of osteogenic markers as Bmp-2 and its transcription factor Sox-9 as well as p21 as senescence marker were increased in uremic mice compared to controls. Pro-inflammatory uremic proteins such as serum amyloid A, interleukin (Il)-1β, and Il-6 increased. This novel model of chronic uremia provides a simple method for investigation of signaling pathways in vascular inflammation and calcification and therefore offers an experimental basis for the development of potential therapeutic intervention studies. Graphical abstractOpen Access funding enabled and organized by Projekt DEAL.Ernst und Berta Grimmke Stiftung http://dx.doi.org/10.13039/501100008436Berlin-Institute-of-HealthSonnenfeld Stiftung http://dx.doi.org/10.13039/100010121DynAge Focus AreaNanchong school science and technology strategic cooperation projectCharité - Universitätsmedizin Berlin (3093

Blutdrucksenkende pleiotrope Effekte antidiabetischer Medikamente

ZUSAMMENFASSUNGIn den letzten Jahren haben sich einige Medikamente hervorgetan, die unabhängig von ihrer primären Indikation einen protektiven Effekt auf die Nierenfunktion ausüben können. Für Nephrologen besonders interessant ist dabei der nephroprotektive Effekt, den die Inhibitoren des Natrium Glukose Kotransporters 2 (SGLT-2: „sodium glucose linked transporter 2“) wie Empagliflozin, Canagliflozin und Dapagliflozin ausüben, unabhängig von ihrem Einfluss auf den Blutzucker und wie wir seit der Studie DAPA-CKD wissen – sogar bei Patienten ohne Diabetes mellitus. Auch die modernen, nichtsteroidalen Mineralokortikoid-Rezeptor-Antagonisten wie Finerenon und Esaxerenon machten hinsichtlich ihrer Nephroprotektion auf sich aufmerksam, unabhängig von ihrer primären Indikation für die Therapie der Herzinsuffizienz und bisweilen der arteriellen Hypertonie. Ursächlich sind hierfür pharmakologische „Mehrfachwirkungen“, die pleiotrope Effekte genannt werden und einen vielschichten Eingriff in die (Patho-)Physiologie des Organismus ermöglichen. Die Therapie der arteriellen Hypertonie erfordert eine synergistische Kombination und stellt einen Angelpunkt in der kardiorenalen Achse dar. Deshalb sollen an diesem Beispiel die pleiotropen Effekte von SGLT-2-Inhibitoren, Mineralokortikoid-Rezeptor-Antagonisten und GLP-1-Agonisten (GLP-1: „glucagon-like peptide 1“) sowie deren klinische Implikationen beleuchtet werden.</jats:p

Die künstliche Niere

ZUSAMMENFASSUNGAngesichts des weltweiten Mangels an Transplantatnieren mehren sich die Bemühungen um eine künstliche Quelle für einen dauerhaften Nierenersatz. Durch ein besseres Verständnis der embryologischen Nierenentwicklung können mittlerweile Organoide aus induzierten Stammzellen gebildet werden, die auf niedrigem Niveau funktional sind. Problematisch bleibt die Herstellung einer höheren 3-dimensionalen Strukturierung, eine adäquate Blutversorgung und der Anschluss an die ableitenden Harnwege. Zur Lösung dieser Probleme werden verschiedene Ansätze verfolgt: Transplantation embryonaler Nierenanlagen, Neubesiedlung von dezellularisierten Nierengerüsten oder modernen Dialysefiltern sowie der Versuch der Strukturierung durch 3D-Drucken. Im vorliegenden Beitrag werden die gegenwärtig verfolgten Strategien zur Organogenese der Niere mitsamt der aktuell zu lösenden Probleme erörtert.</jats:p