Estructura y diversidad genética de poblaciones bacterianas en la rizosfera de olivo (Olea europaea L. subsp. europaea) en Andalucía

El olivo (Olea europaea L. subsp. europaea) ha sido culturalmente y económicamente el principal cultivo oleaginoso de la Cuenca Mediterránea. España es el mayor productor de aceite de oliva en el mundo, y Andalucía, la región sur del país, es el principal área de cultivo con 62% de la superficie de olivar en España, ocupando >1.5 millones ha, y un 17% de su superficie total en un monocultivo impresionante. En España, el olivo se puede encontrar en dos formas, silvestre (Olea europaea L. subsp. europaea var. sylvestris) y cultivada (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea). Las interacciones planta-microorganismo en la rizosfera y endosfera ha sido objeto de considerables estudios, ya que las comunidades bacterianas desempeñan un importante papel en el balance, desarrollo y funcionamiento del ecosistema suelo en diferentes sistemas agrícolas en muchas especies de plantas cultivadas. Esta Tesis Doctoral, se ha centrado en el estudio de la estructura y diversidad genética de las comunidades bacterianas de la rizosfera de olivos cultivados y silvestres en Andalucía, determinando el papel que los sistemas de manejo del suelo y los factores asociados a la planta pueden tener sobre éstas. En España, recientemente se han introducido métodos alternativos del manejo del suelo para reducir al mínimo la vulnerabilidad de los olivares a la erosión del suelo, uno de los principales problemas para la sostenibilidad del olivo en Andalucía, incluyendo el no-laboreo combinado con el control mecánico de malas hierbas, laboreo reducido con y sin control de malas hierbas y siembra de cubiertas vegetales en el otoño y eliminación de malas hierbas con herbicidas en la primavera y/o posterior desbroce o pastoreo. En este trabajo, se utilizó el análisis FT-RFLP (Análisis del Polimorfismos de Longitud del Fragmento de Restricción Terminal Fluorescente) de las secuencias amplificadas de la región 16S del ADNr para estudiar las diferencias en la estructura de las comunidades bacterianas en muestras de suelo de 46 plantaciones comerciales de olivo orgánico y 12 áreas naturales cercanas con diferentes tipos de suelo. Las fincas de olivar estudiadas han estado sometidas a los diferentes sistemas de manejo de suelo durante largo tiempo en dos de las zonas más representativas para el cultivo de olivar en Andalucía, y representan ejemplos de sistemas agroforestales y plantaciones tradicionales. Nuestros resultados demostraron que dentro de cada finca de olivar tanto el tipo de suelo como el manejo de éste contribuyeron en este orden a modificar la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas de acuerdo a los valores de los índices de Riqueza y Shannon Weiner. Los suelos de olivar de Sierra Morena con laboreo ligero o pastoreo con ovejas durante todo el año, presentaron mayores valores de estos índices de diversidad comparados con todos los sistemas de manejo del suelo en Campiña (laboreo convencional y cobertura del suelo con desbroce). Mediante este análisis FT-RFLP algunos fragmentos de restricción terminal han sido identificados y asociados significativamente a sistemas de manejo de suelo específicos, los cuales podrían ser utilizados en el futuro como indicadores para evaluar el efecto de cambios en el manejo de suelo en la modificación de las propiedades biológicas del suelo incluyendo la calidad biológica del mismo. Entre los árboles cultivados y silvestres, el olivo es una de las especies de mayor longevidad y riqueza en variabilidad genética. En España, más de 200 variedades son actualmente cultivadas. En Andalucía ocho cultivares de olivo (Hojiblanca, Lechín de Sevilla, Manzanilla de Sevilla, Nevadillo Negro, Picual, Picudo, y Verdial de Huévar) representan >90% del área total cultivada, y nuevos cultivares (Arbequina y Frantoio) están siendo actualmente introducidos. En esta Tesis Doctoral, utilizando un enfoque tanto cultivo-dependiente e independiente (FT-RFLP de las secuencias amplificadas de la región 16S ADNr), evaluamos la influencia específica del genotipo de olivo, vivero de origen de los plantones, y el tiempo de incubación en la estructura de las comunidades bacterianas así como en las comunidades bacterianas cultivables totales (BCT) y Pseudomonas fluorescentes (Ps) en la rizosfera y endosfera de seis cultivares (Arbequina, Frantoio, Hojiblanca, Manzanilla de Sevilla, Picual, y Picudo). Nuestros resultados indicaron que en primer lugar el vivero de origen, y en segundo lugar el genotipo del olivo, tuvieron una influencia significativa en la estructura de las comunidades iniciales y densidad de población de bacterias cultivables en la rizosfera y endosfera. En general, los cultivares Arbequina y Frantoio mostraron los mayores niveles de densidad de población. Asimismo, la estructura de las comunidades bacterianas de la rizosfera de seis cultivares de olivo muestreados en distintos tiempos de crecimiento fueron diferenciados en primer lugar en función del tiempo de muestreo y en segundo lugar en función del genotipo del olivo, con densidad de poblaciones de BCT y Ps manteniéndose estables o incrementando sus niveles de densidad de población durante el tiempo de crecimiento. En esta Tesis Doctoral, nuestra hipótesis fue que ambas formas de olivo, cultivada y silvestre, pueden ser una importante fuente de variabilidad genética la cual puede contener comunidades bacterianas en la rizosfera con importantes aplicaciones en la medicina, veterinaria, agricultura o industria. Mediante un enfoque de análisis polifásico, examinamos la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas en la rizosfera de olivos silvestres en Andalucía. Primero, utilizando la técnica de análisis FT-RFLP de la región 16S ADNr, encontramos una alta heterogeneidad en la composición de las comunidades bacterianas de la rizosfera, sugiriendo la existencia de comunidades específicas en función del genotipo de la planta y localización geográfica, siendo cada reducto de acebuche un reservorio único de diversidad. Posteriormente, investigamos el potencial antagonista de esas poblaciones bacterianas cultivables asociadas a la raíz. De un total de 675 aislados bacterianos de la rizosfera y endosfera de olivos silvestres, 94 (14%) mostraron una fuerte actividad antagonista in vitro contra V. dahliae patotipo defoliante, el cual es considerado uno de los más importantes patógenos que afectan al cultivo del olivo en el mundo. La proporción más alta de antagonistas se obtuvo de la rizosfera (59,6%) en comparación con la endosfera (40,4%). En total, la mayoría de los antagonistas (entre un 58,5 a 78,3%), mostraron actividad proteolítica, lipolítica, quitinolítica, produjeron ácido indol-acético y sideróforos. Mediante la secuenciación del gen 16S del ADNr, los antagonistas se identificaron indicando que la mayoría de las bacterias pertenecen al género Bacillus (56,4%), Pseudomonas (27,7%) y Paenibacillus (7,4%). Asimismo, varios de los aislados bacterianos que se identificaron no habían sido citados previamente en olivo incluyendo Acinetobacter sp. (3,2%), Chryseobacterium vyrstaatense (2,1%), Rhodococcus wratislaviensis (1,1%), y Rahnella sp. (1,1%). En general, varias de estas bacterias mostraron un alto y gran número de mecanismos de antagonismo, por lo que deben ser consideradas para futuros análisis como potenciales agentes de biocontrol contra V. dahliae en olivo. Finalmente, realizamos un intenso estudio centrado en nuevas bacterias pertenecientes a Duganella spp. con pigmentación morada productoras de violaceína con interés biotecnológico habitando la rizosfera de olivos silvestres y cultivados en el sur de España. Mediante una caracterización fisiológica y bioquímica, análisis filogenético de diferentes genes incluyendo 16S ADNr, gyrB y vioA (implicado en la síntesis de violaceína), aislamos e identificamos por primera vez Duganella spp. asociadas con la rizosfera de plantas leñosas en medio ambientes de clima Mediterráneos que son capaces de producir violaceína, un metabolito secundario de color azul-morado con importantes aplicaciones biológicas, médicas e industriales de alto interés biotecnológico. Las siete cepas de Duganella spp. estudiadas pudieron ser identificadas como dos potenciales especies nuevas y fueron diferenciadas de acuerdo a su huésped de origen (Duganella baetica en olivos silvestres versus Duganella olivae en olivos cultivados). Todas las cepas de Duganella spp. produjeron violaceína in vitro, con niveles de producción natural más altos (hasta X65) que los citados en la literatura para cepas de otras especies bacterianas productoras de violaceína. Este alto rendimiento, hacen de estas bacterias buenas candidatas para su explotación biotecnológica, ya que los bajos rendimientos en la producción de violaceína se consideran una de las principales limitaciones de las cepas silvestres para su producción masiva y explotación comercial. Aunque no se demostró actividad inhibidora in vitro frente a bacterias gram-negativas y hongos fitopatógenos, el filtrado crudo de violaceína si demostró actividad inhibidora contra bacterias gram positivas. También observamos que las cepas de Duganella spp. de olivos silvestres y cultivados mostraron actividad proteolítica y lipolítica y una débil producción de sideróforos lo cual merece una investigación más extensa como potenciales inoculantes de plantones de olivo para mejorar su crecimiento y el establecimiento y supresión de patógenos del suelo

Identification of Pseudomonas viridiflava, causal agent of onion (Allium cepa L.) bulb rot

Objective: To phenotypically and molecularly characterize and identify the causal agent of onion (Allium cepaL.) bulb rot in Morelos, Mexico.Methodology: Fluorescent bacteria from onion bulb tissue with symptoms of rot were isolated; the LOPATtest was used to describe them and subsequently they were identified by partial 16S rRNA gene amplification.Pathogenicity in vegetables and plants was evaluated injecting a suspension with 108 CFU mL-1of the pathogen.Results: Phenotypic characterization and 16S rRNA nucleotide sequencing showed 100% identity withPseudomonas viridiflava as the causal agent of onion bulb rot. The pathogen caused infection in broccoli (Brassica oleracea L.), spring onion (Allium fistulosum L.), purple onion (Allium cepa L.), cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.), leek (Allium porrum L.), and carrot (Daucus carota L.), as well as in plant species such as jalapeño pepper (Capsicum annuum var. annuum L.), bean (Phaseolus vulgaris L.), and tomato (Solanum lycopersicum L.).Implications: This information is important for agriculture in Mexico. Pseudomonas viridiflava is a bacterialpathogen with high potential to infect new hosts. This is the first report of P. viridiflava causing onion rot in Mexico.Conclusions: Pseudomonas viridiflava is the causal agent of onion bulb

Purple-Pigmented Violacein-Producing Duganella spp. Inhabit the Rhizosphere of Wild and Cultivated Olives in Southern Spain

Bacteria have evolved mechanisms that allow them to grow and survive in highly competitive environments like soil and the rhizosphere. Using classical microbiological, physiological, and genetic analyses, we isolated and identified for the first time Duganella spp. associated with the rhizosphere of woody plants in Mediterranean environments that are able to produce violacein, a blue-purple secondary metabolite of considerable biotechnological interest. Based on physiological and biochemical characterization and phylogenetic analysis of different genes including 16S rRNA, gyrB, and vioA (implicated in the synthesis of violacein), the seven Duganella spp. strains isolated and studied were differentiated according to their host of origin (wild versus cultivated olives) and potentially might belong to new species. All the Duganella spp. strains produced violacein in vitro, with natural production levels significantly higher than that previously reported for other violacein-producing bacteria without optimizing growing conditions. The important biological, medical, and industrial applications of violacein make these bacteria good candidates for their biotechnological exploitation because low violacein yields are considered as one of the main limitations of using wild-type strains for extensive exploitation and pigment production. Independent of violacein production, purple-pigmented strains from olives showed proteolytic and lipolytic activities and a weak siderophore production. No in vitro inhibitory activity was demonstrated for bacteria or crude violacein filtrates against plant-pathogenic Gram-negative bacteria and fungi, but they did inhibit Gram-positive bacteria. © 2011 Springer Science+Business Media, LLC.This research was supported by grants AGL2008-00344 and HA2008-0014 from ‘Ministerio de Ciencia e Innovación’ of Spain and the European Social Fund and PI2007-40I012 ‘Intramural Project’ to B. B. Landa from the Spanish National Research Council (CSIC).Peer Reviewe

Nuevas cepas de duganella aisladas de la rizosfera de olivo silvestre y cultivado y su uso en la producción de violaceína

[EN] The invention relates to bacterial strains of Duganella spp., obtained from the rhizosphere of wild and cultivated olive trees. Preferably, the strains are CECT 7779, CECT 7780 and CECT 7781, and more preferable still, the bacterial strain is CECT 7780. In addition, the invention relates to combinations thereof with other microorganisms and to compositions comprising the aforementioned pro ducts , as well as to a method for the production of violacein and to the violacein produced for bioteclmological and agronomic use.[ES] La presente invención se refiere a unas cepas bacterianas de Duganella spp. obtenidas de la rizosfera de olivos silvestres y cultivados. Preferentemente las cepas son CECT 7779, CECT 7780 y CECT 7781 y más preferentemente la cepa bacteriana es CECT 7780. Además, la presente invención se refiere a sus combinaciones con otros microorganismos y a las composiciones que comprenden los productos anteriores, así como a un procedimiento para la producción de violaceína y a la violaceína producida para su aplicación biotecnológica y agronómica.Peer reviewedConsejo Superior de Investigaciones CientíficasA1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

Microbial communities associated with the root system of wild olives (Olea europaea L. subsp. europaea var. sylvestris) are good reservoirs of bacteria with antagonistic potential against Verticillium dahliae

Wild olive trees, namely oleaster, are considered the ancestor of cultivated olive and a unexplored source of genetic variability that might contain important traits of agronomic and biotechnological interest. The longevity and genetic diversity of oleasters may have favoured selection of specific and well adapted rhizosphere microbial populations that can constitute unique reservoirs of microbial antagonists of Verticillium dahliae, the main soilborne fungal pathogen of olive worldwide. The objective of this present study was to determine the structure and diversity of bacterial communities in the rhizosphere and endosphere of oleaster from 11 havens in Cádiz and Córdoba provinces of Andalusia, southern Spain. To carry out the study we used a multiphasic approach. First, the occurrence and diversity of rhizosphere bacteria was monitored by a cultivation-independent-approach, using fluorescent terminal restriction fragment length polymorphism (FT-RFLP) analyses of amplified 16S rDNA sequences. FT-RFLP patterns revealed a high heterogeneity in the composition of the sampled rhizosphere bacterial communities and suggested the existence of plant genotype-site-specific communities, with each oleaster haven being a unique reservoir of bacterial diversity. Secondly, to investigate the antagonistic potential of these root-associated bacterial populations, a total of 675 bacterial isolates obtained from oleaster rhizosphere and endosphere were screened by dual testing for inhibition of in vitro growth of the highly virulent, olive defoliating pathotype of V. dahliae. Out of 675 tested bacterial isolates, 94 (14%) showed a strong antagonistic activity against a defoliating V. dahliae pathotype. Of the antagonistic bacteria, a slightly lower proportion (12.9% of total bacteria) were inhabitant of the oleaster rhizosphere compared to that in the endosphere (16.5%). The biotechnological potential of those isolates was assessed by in vitro production of different hydrolytic enzymes, indole-1.3-acetic acid (IAA), siderophores, and antimicrobial compounds. Overall, most of bacterial antagonists (58.5 to 78.3%) showed proteolytic, lipolytic, and chitinolytic activity, and produced IAA and siderophores. Finally, analysis of the 16S rDNA gene sequence indicated that most of the 94 bacterial antagonists belong to genera Bacillus (56.4%), Pseudomonas (27.7%), and Paenibacillus (7.4%). Overall, the rhizosphere and endosphere of wild olives were proved as a good reservoir of bacteria antagonists against V. dahliae. Several of those bacteria showing high and broad antagonism potential may therefore be considered for further analyses as promising biocontrol agents against V. dahliae in olive. © 2011 Springer Science+Business Media B.V.This research was supported by grants AGL2008-00344 and HA2008-0014 from ‘Ministerio de Ciencia e Innovación’ of Spain and the European Social Fund.Peer Reviewe

Soil factors involved in the diversity and structure of soil bacterial communities in commercial organic olive orchards in Southern Spain

Nowadays, there is a tendency in olive production systems to reduce tillage or keep a vegetative cover to reduce soil erosion and degradation. However, there is scarce information on the effects of different soil management systems (SMS) in soil bacterial community composition of olive groves. In this study, we have evaluated the effects of soil type and different SMS implemented to control weeds in the structure and diversity of bacterial communities of 58 soils in the two geographic areas that best represent the organic olive production systems in Spain. Bacterial community composition assessed by frequency and intensity of occurrence of terminal restriction profiles (TRFs) derived from terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis of amplified 16S ribosomal deoxyribonucleic acid were strongly correlated with soil type/field site (Eutric/Calcaric) that differed mainly in soil particle size distribution and soil pH, followed by a strong effect of SMS, in that order. Canonical discriminant (CD) analysis of TRFs properly classified all of the olive orchard soils as belonging to their respective soil type or SMS. Furthermore, only a small set of TRFs were enough to clearly and significantly differentiate soil samples according to soil type or SMS. Those specific TRFs could be used as bioindicators to assess the effect of changes in SMS aimed to enhance soil quality in olive production systems. © 2014 Society for Applied Microbiology and John Wiley & Sons Ltd.Financial support for this research was provided by Projects AGL2008-00344 and AGL2009–12936-C03-01 from ‘Ministerio de Ciencia e Innovación’, AGL-2012–37521 and ‘Ministerio de Economia y Competitividad’ of Spain and Projects P08-AGR-03528, P08-AGR-03643 and P10-AGR-5908 from ‘Consejería de Economía, Innovación y Ciencia’ of Junta de Andalucía and FEDER financial support from the European Union. S. Aranda was recipient of a PhD. grant from ‘Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología’ (CONACYT) México.Peer Reviewe

ALTERNATIVES PRODUCTS IN THE IN VITRO DISINFESTATION IN ROOTSTOCK EXPLANTS DUKE-7 AND IDENTIFICATION OF ENDOPHYTE MICROORGANISMS

Background. The vegetative material for in vitro establishment of avocado explants is from the field, for this reason, the proportion of contamination, oxidation and mortality of explants is elevated, therefore we are looking for alternatives to decreased. Objective. To evaluate concentrations of alternative products for disinfestation in avocado explants cv Duke 7, and decrease oxidation with the addition of L-cysteine in the in vitro establishment. Methodology. The products used were: peroxyacetic acid (AP), chlorine dioxide (DC), and quaternary ammonium salts (ACS), in three concentrations. 54 explants were used in each treatment, and placed in culture medium for establishment, evaluating contamination (%) and oxidation (%). Two weeks later, 50% of viable explants from each treatment were immersed in L-cysteine (100 mgL-1) and placed in a culture medium for multiplication, the rest was placed a in multiplication medium containing L-cysteine; only oxidation was evaluated (%). Contaminated explants were isolated, identified, and characterized fungi and bacteria. Results. The best results of the disinfestation were with ACS with 3.7% contamination, without oxidation. Regarding the use of L-cysteine (100 mgL-1), the lowest percentage of oxidation (47%) was obtained when immersed in a cysteine solution. Three genera of fungi were identified: Aspergillus (3), Penicillium (1) and Cladosporium (1), and Agrobacterium as a bacterium. Implications. With the proposed methodology, we can continue with the following stages of in vitro culture, to establish methodologies for budding, growth, and rooting of avocado clonal rootstocks. Conclusions. The use of ACS and cysteine in solution reduces both contamination and oxidation of explants, but it is necessary to modify concentrations and exposure times in the disinfestation protocol, in addition to identifying even the genus the microorganisms found

De Novo Transcriptome of <i>Mammillaria bombycina</i> (Cactaceae) under In Vitro Conditions and Identification of Glyoxalase Genes

Mammillaria bombycina is a cactus distributed in the central region of Mexico. Cactaceae have the particularity of surviving drought and high temperatures, which is why in vitro propagation studies have been carried out successfully to preserve this species and use it as a study model in cacti. In this contribution, a de novo transcriptome of M. bombycina was produced under in vitro conditions for the identification and expression of genes related to abiotic stress. Samples were sequenced using an Illumina platform, averaging 24 million clean readings. From assembly and annotation, 84,975 transcripts were generated, 55% of which were unigenes. Among these, the presence of 13 isoforms of genes belonging to glyoxalase I, II and III were identified. An analysis of the qRT-PCR expression of these genes was performed under in vitro and ex vitro conditions and dehydration at 6 and 24 h. The highest expression was observed under greenhouse conditions and dehydration at 24 h, according to the control. The de novo assembly of the M. bombycina transcriptome remains a study model for future work in cacti