Rôle de la phosphoinositide 3-kinase de classe II beta dans la dysfonction endothéliale lors d'un accident vasculaire cérébral ischémique

L'AVC ischémique, avec près de 140 000 cas par an en France, est une cause majeure de mortalité et de handicap. Il est caractérisé par l'occlusion d'une artère cérébrale dont le seul traitement approuvé est la recanalisation par fibrinolyse et/ou thrombectomie. Cependant, malgré une recanalisation complète de l'artère, 20 % des patients développent des lésions dites d'ischémie/reperfusion (I/R) consécutives à une hypoperfusion des capillaires cérébraux. Les conséquences majeures sont une rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et une inflammation accrue du système nerveux central (SNC) entrainant la formation d'un oedème compressif et une augmentation des lésions et des séquelles neurologiques. Ainsi, préserver l'intégrité de la BHE lors de la reperfusion pourrait représenter une approche thérapeutique d'intérêt. Les phosphoinositide 3-kinases de classe II alpha et ß (PI3KC2 alpha et ß) sont des lipides kinases qui phosphorylent le phosphatidylinositol en phosphatidylinositol 3-monophosphate (PtdIns3P) et le PtdIns4P en PtdIns(3,4)P2. Ces phosphoinositides sont connus principalement pour réguler l'endocytose et le trafic endosomal. Au début de ma thèse, le rôle de la PI3KC2ß et de ses produits dans la régulation du trafic endosomal et dans la physiopathologie était très peu connu. L'objectif de ma thèse a été d'étudier le rôle de la PI3KC2ß dans le contexte thrombo-inflammatoire de l'AVC ischémique. Dans deux modèles murins d'AVC ischémique, nos résultats montrent que l'inactivation génétique de la PI3KC2ß (PI3KC2B^D1212A/D1212A, KI) préserve fortement l'intégrité de la BHE, objectivée par une diminution de l'oedème et de la perméabilité vasculaire. Ces résultats ont été corrélés à une diminution de l'expression des cytokines pro-inflammatoires, des molécules d'adhésions endothéliales et de l'extravasation des leucocytes aboutissant à une diminution du volume lésionnel. La génération de souris chimères, par greffe de moelle osseuse, a permis de déterminer que cette neuroprotection était principalement médiée par le compartiment non hématopoïétique, suggérant l'implication des cellules endothéliales. En effet, des expériences réalisées avec des cellules endothéliales de la microcirculation cérébrale humaine, ont permis de montrer que la déplétion de la PI3KC2ß entraine une augmentation de la VE-Cadhérine à la membrane plasmique, malgré un traitement au TNFalpha ou une privation en oxygène et en glucose, préservant ainsi l'intégrité de la barrière endothéliale. Par ailleurs, l'absence de la PI3KC2ß diminue le taux de PtdIns3P, sans affecter la synthèse de PtdIns(3,4)P2, et induit un défaut de maturation des endosomes vers la voie de dégradation lysosomale en faveur de la voie de recyclage dépendante de Rab11a. Des expériences de réversion du phénotype par ajout de PtdIns3P perméant ou par expression d'un dominant négatif de la GTPase Rab11a ont confirmé que cette perturbation du trafic endosomal favorise le recyclage de la VE-Cadhérine au niveau de la membrane plasmique. Ce travail in vitro apporte les bases moléculaires et cellulaires expliquant l'effet neuroprotecteur de l'inhibition de la PI3KC2ß dans les modèles murins d'AVC ischémiques. Nous avons donc identifié la PI3KC2ß comme une cible thérapeutique d'intérêt dans le traitement des AVC ischémiques puisqu'inhiber cette lipide kinase durant la phase de reperfusion pourrait minimiser l'atteinte de la BHE et améliorer le taux de survie et les conditions de vie des patients.Ischemic stroke is the second cause of death and disability worldwide and is characterized by the occlusion of a cerebral artery. The only treatments approved are based on the recanalization by fibrinolysis and/or thrombectomy. However, despite a complete recanalization, 20 % of patients develop secondary ischemia known as ischemia/reperfusion (I/R) injuries. The major consequences are the defect and breakdown of the blood-brain barrier (BBB) and the exacerbation of central nervous system (CNS) inflammation leading to an increase of vascular permeability and edema. Thus, protecting the BBB from breakdown could be an attractive therapeutic approach to limit I/R injuries and neurological outcomes. Class II phosphoinositide 3-kinases alpha and ß (PI3KC2alpha and ß) are lipid kinases that phosphorylate phosphatidylinositol into phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) and PtdIns4P into PtdIns(3,4)P2, two lipids known to control endocytosis and endosomal trafficking. At the beginning of my thesis, very little was known about the role of the PI3KC2ß and its products in endosomal trafficking and physiopathology. The objective of my thesis was to study the role of the PI3KC2ß in the thrombo-inflammatory context of ischemic stroke. In vivo experiments, using mice genetically inactivated for the PI3KC2ß (PI3KC2B^D1212A/D1212A, KI), showed a strong resistance towards BBB breakdown as assessed by a decrease of Evan's blue leakage and edema after I/R following experimental stroke induction. These results were correlated with a strong decrease of ischemic injuries and inflammation with a reduction of leucocytes infiltration, cytokines, and adhesion molecules expression in two different mouse models of stroke. Generation of bone marrow (BM) chimeric mice highlighted a major role of the non-hematopoietic compartment in the neuroprotection pointing a potential role of endothelial cells. Indeed, in vitro experiments, carried out with human cerebral microvascular endothelial cells depleted for the PI3KC2ß by shRNA, showed a functional accumulation of VE-Cadherin at the plasma membrane. The depletion of PI3KC2ß increases the amount and stability of junctional VE-Cadherin even in the presence of TNFalpha or oxygen and glucose deprivation leading to a preservation of the endothelial barrier. Furthermore, the absence of PI3KC2ß decreases the amount of PtdIns3P, but not PtdIns(3,4)P2, and alters endosomal maturation towards the lysosomal pathway in favor of the Rab11a+ recycling path. This disruption of endosomal traffic promotes the recycling of VE-Cadherin at the plasma membrane, which preserves the integrity of the endothelial barrier. These results were confirmed by reversion experiments with the addition of exogenous cell-permeant PtdIns3P or the expression of a dominant-negative form of the GTPase Rab11a. Overall, these in vitro data provide a molecular and cellular explanation supporting the strong effect of PI3KC2ß inhibition in protecting the BBB in vivo. This work identifies the PI3KC2ß as a new potential therapeutic target to prevent brain injuries following ischemic stroke. Inhibiting this lipid kinase at the reperfusion time could preserve the BBB and thus improve survival and neurological outcome

Role of class II beta phosphoinositide 3-kinase in endothelial dysfunction during ischemic stroke

L'AVC ischémique, avec près de 140 000 cas par an en France, est une cause majeure de mortalité et de handicap. Il est caractérisé par l'occlusion d'une artère cérébrale dont le seul traitement approuvé est la recanalisation par fibrinolyse et/ou thrombectomie. Cependant, malgré une recanalisation complète de l'artère, 20 % des patients développent des lésions dites d'ischémie/reperfusion (I/R) consécutives à une hypoperfusion des capillaires cérébraux. Les conséquences majeures sont une rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et une inflammation accrue du système nerveux central (SNC) entrainant la formation d'un oedème compressif et une augmentation des lésions et des séquelles neurologiques. Ainsi, préserver l'intégrité de la BHE lors de la reperfusion pourrait représenter une approche thérapeutique d'intérêt. Les phosphoinositide 3-kinases de classe II alpha et ß (PI3KC2 alpha et ß) sont des lipides kinases qui phosphorylent le phosphatidylinositol en phosphatidylinositol 3-monophosphate (PtdIns3P) et le PtdIns4P en PtdIns(3,4)P2. Ces phosphoinositides sont connus principalement pour réguler l'endocytose et le trafic endosomal. Au début de ma thèse, le rôle de la PI3KC2ß et de ses produits dans la régulation du trafic endosomal et dans la physiopathologie était très peu connu. L'objectif de ma thèse a été d'étudier le rôle de la PI3KC2ß dans le contexte thrombo-inflammatoire de l'AVC ischémique. Dans deux modèles murins d'AVC ischémique, nos résultats montrent que l'inactivation génétique de la PI3KC2ß (PI3KC2B^D1212A/D1212A, KI) préserve fortement l'intégrité de la BHE, objectivée par une diminution de l'oedème et de la perméabilité vasculaire. Ces résultats ont été corrélés à une diminution de l'expression des cytokines pro-inflammatoires, des molécules d'adhésions endothéliales et de l'extravasation des leucocytes aboutissant à une diminution du volume lésionnel. La génération de souris chimères, par greffe de moelle osseuse, a permis de déterminer que cette neuroprotection était principalement médiée par le compartiment non hématopoïétique, suggérant l'implication des cellules endothéliales. En effet, des expériences réalisées avec des cellules endothéliales de la microcirculation cérébrale humaine, ont permis de montrer que la déplétion de la PI3KC2ß entraine une augmentation de la VE-Cadhérine à la membrane plasmique, malgré un traitement au TNFalpha ou une privation en oxygène et en glucose, préservant ainsi l'intégrité de la barrière endothéliale. Par ailleurs, l'absence de la PI3KC2ß diminue le taux de PtdIns3P, sans affecter la synthèse de PtdIns(3,4)P2, et induit un défaut de maturation des endosomes vers la voie de dégradation lysosomale en faveur de la voie de recyclage dépendante de Rab11a. Des expériences de réversion du phénotype par ajout de PtdIns3P perméant ou par expression d'un dominant négatif de la GTPase Rab11a ont confirmé que cette perturbation du trafic endosomal favorise le recyclage de la VE-Cadhérine au niveau de la membrane plasmique. [...]Ischemic stroke is the second cause of death and disability worldwide and is characterized by the occlusion of a cerebral artery. The only treatments approved are based on the recanalization by fibrinolysis and/or thrombectomy. However, despite a complete recanalization, 20 % of patients develop secondary ischemia known as ischemia/reperfusion (I/R) injuries. The major consequences are the defect and breakdown of the blood-brain barrier (BBB) and the exacerbation of central nervous system (CNS) inflammation leading to an increase of vascular permeability and edema. Thus, protecting the BBB from breakdown could be an attractive therapeutic approach to limit I/R injuries and neurological outcomes. Class II phosphoinositide 3-kinases alpha and ß (PI3KC2alpha and ß) are lipid kinases that phosphorylate phosphatidylinositol into phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) and PtdIns4P into PtdIns(3,4)P2, two lipids known to control endocytosis and endosomal trafficking. At the beginning of my thesis, very little was known about the role of the PI3KC2ß and its products in endosomal trafficking and physiopathology. The objective of my thesis was to study the role of the PI3KC2ß in the thrombo-inflammatory context of ischemic stroke. In vivo experiments, using mice genetically inactivated for the PI3KC2ß (PI3KC2B^D1212A/D1212A, KI), showed a strong resistance towards BBB breakdown as assessed by a decrease of Evan's blue leakage and edema after I/R following experimental stroke induction. These results were correlated with a strong decrease of ischemic injuries and inflammation with a reduction of leucocytes infiltration, cytokines, and adhesion molecules expression in two different mouse models of stroke. Generation of bone marrow (BM) chimeric mice highlighted a major role of the non-hematopoietic compartment in the neuroprotection pointing a potential role of endothelial cells. Indeed, in vitro experiments, carried out with human cerebral microvascular endothelial cells depleted for the PI3KC2ß by shRNA, showed a functional accumulation of VE-Cadherin at the plasma membrane. The depletion of PI3KC2ß increases the amount and stability of junctional VE-Cadherin even in the presence of TNFalpha or oxygen and glucose deprivation leading to a preservation of the endothelial barrier. Furthermore, the absence of PI3KC2ß decreases the amount of PtdIns3P, but not PtdIns(3,4)P2, and alters endosomal maturation towards the lysosomal pathway in favor of the Rab11a+ recycling path. This disruption of endosomal traffic promotes the recycling of VE-Cadherin at the plasma membrane, which preserves the integrity of the endothelial barrier. These results were confirmed by reversion experiments with the addition of exogenous cell-permeant PtdIns3P or the expression of a dominant-negative form of the GTPase Rab11a. Overall, these in vitro data provide a molecular and cellular explanation supporting the strong effect of PI3KC2ß inhibition in protecting the BBB in vivo. This work identifies the PI3KC2ß as a new potential therapeutic target to prevent brain injuries following ischemic stroke. Inhibiting this lipid kinase at the reperfusion time could preserve the BBB and thus improve survival and neurological outcome

Mutation of Arginine 264 on ERα (Estrogen Receptor Alpha) Selectively Abrogates the Rapid Signaling of Estradiol in the Endothelium Without Altering Fertility

International audienceObjective - ERα (estrogen receptor alpha) exerts nuclear genomic actions and also rapid membrane-initiated steroid signaling. The mutation of the cysteine 451 into alanine in vivo has recently revealed the key role of this ERα palmitoylation site on some vasculoprotective actions of 17β-estradiol (E2) and fertility. Here, we studied the in vivo role of the arginine 260 of ERα which has also been described to be involved in its E2-induced rapid signaling with PI-3K (phosphoinositide 3-kinase) as well as G protein in cultured cell lines. Approach and Results: We generated a mouse model harboring a point mutation of the murine counterpart of this arginine into alanine (R264A-ERα). In contrast to the , the females are fertile with standard hormonal serum levels and normal control of hypothalamus-pituitary ovarian axis. Although R264A-ERα protein abundance was normal, the well-described membrane ERα-dependent actions of estradiol, such as the rapid dilation of mesenteric arteries and the acceleration of endothelial repair of carotid, were abrogated in mice. In striking contrast, E2-regulated gene expression was highly preserved in the uterus and the aorta, revealing intact nuclear/genomic actions in response to E2. Consistently, 2 recognized nuclear ERα-dependent actions of E2, namely atheroma prevention and flow-mediated arterial remodeling were totally preserved. Conclusions - These data underline the exquisite role of arginine 264 of ERα for endothelial membrane-initiated steroid signaling effects of E2 but not for nuclear/genomic actions. This provides the first model of fertile mouse with no overt endocrine abnormalities with specific loss-of-function of rapid ERα signaling in vascular functions