Caracterização molecular de mutações em pacientes com doença de von Willebrand tipo 3

O Fator von Willebrand (FvW) humano é uma glicoproteína plasmática, sintetizada nos megacariócitos e células endoteliais, que circula no plasma sob a forma de multímeros. O gene codificante do FvW está localizado no braço curto do cromossomo 12 e contém 178 kb distribuídos em 52 éxons. O FvW participa tanto da hemostasia primária, ligando-se ao tecido lesionado e recrutando plaquetas, quanto na hemostasia secundária estabilizando a molécula de FVIII, impedindo que esta seja degradada. O gene do VWF é transcrito em um mRNA de 9kb e é traduzido em um pré-pro-polipeptídeo contendo 2813 aminoácidos, sendo composto por uma pré-sequência, um pro-peptídeo e um monômero. Os processos pós traducionais do FvW incluem dimerização, glicosilação, sulfatação, clivagem do pró- peptídeo e multimerização; seguido de estocagem ou secreção. Os níveis plasmáticos normais de FvW, na população em geral, variam de 35 a 200 UI/dL. A doença de von Willebrand (DvW) é causada por anormalidades quantitativas ou qualitativas no FvW. Defeitos quantitativos causam a DvW tipo 1 e tipo 3. Por outro lado, anormalidades qualitativas causam a DvW tipo 2, que pode ser subdividida em tipos 2A, 2B, 2M e 2N. A DvW tipo 3 é uma deficiência quantitativa grave do FvW e é herdada de maneira autossômica recessiva. Os indivíduos com DvW tipo 3, apresentam níveis indetectáveis de FvW:Ag e também níveis muito baixos de FVIII. Pessoas com DvW tipo 3 podem apresentar sintomas clínicos como sangramentos mucocutâneos graves ou moderados, hematomas musculares e hemartroses. O grande tamanho, a sequência altamente polimórfica e a presença de um pseudogene complicam o rastreamento de variantes patogênicas no VWF. O presente estudo visa a caracterização molecular de mutações em pacientes com DvW3 no Rio Grande do Sul. O gene VWF foi sequenciado em 26 casos diagnosticados com DvW3 por sequenciamento de nova geração usando IonTorrent. O impacto das mutações de sentido trocado encontradas foi analisado utilizando 5 algoritmos: Mutationtaster, PROVEAN, SIFT, Polyphen-2 e HOPE. O sequenciamento por Sanger foi realizado para confirmar algumas mutações encontradas pelo método de NGS. O gene do VWF foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando 52 pares de primers. As sequências foram alinhadas com a sua referência (NM_000552.4) usando o software CodonCodeAligner implementado no MEGA 5.04. Foram identificadas 72 variantes diferentes: 31 intrônicas, 17 sinônimas, 16 sentido trocado, 6 deleção-inserção, 2 sem sentido. As mutações foram distribuídas em todo o gene, tendo maior prevalência no exon 28 (11%). Cinco novas mutações foram encontradas: c.6976 + 5G> T; c.6885_6886insC; c.3378C> T; c.3346_3347insCCA; c.2503G> T. Vinte e quatro pacientes tiveram mais de uma mutação patogênica que poderia explicar o fenótipo da doença. Dentre elas, 17 pacientes apresentaram as variantes (p.Pro2063Ser e p.Arg324*), a p.Pro2063Ser possui divergências entre ser uma mutação patogênica ou um polimorfismo neutro, então provavelmente a causa da doença nesses pacientes seja a p.Arg324*, que gera um stop códon prematuro. Como 60% dos pacientes apresentaram essa mutação e eles se localizam em regiões próximas do estado do Rio Grande do Sul, podemos sugerir que possa ter havido um efeito fundador, e um haplótipo com outras 13 variantes comuns pra esses 17 pacientes reforça essa hipótese. Usando um painel de sequenciamento de nova geração para o VWF, dentre os 26 pacientes, conseguimos detectar 50 dos 52 alelos em um grupo de pacientes brasileiros com diagnóstico clínico de DvW3. Apesar de todos os pacientes apresentarem sangramento grave, a variação na intensidade do sangramento, tipos de sangramento e necessidade de tratamento não puderam ser correlacionados com os tipos ou posição de suas mutações. No entanto, a análise molecular do VWF pode ser útil para fins de diagnóstico e aconselhamento.Von Willebrand Factor (VWF) is a plasma glycoprotein, synthesized in megakaryocytes and endothelial cells, and circulates in plasma as multimers. The VWF coding gene is located on the short arm of chromosome 12 and contains 178 kb distributed in 52 exons. VWF participates in both primary hemostasis, binding to injured tissue and recruiting platelets, and secondary hemostasis by stabilizing the FVIII molecule, preventing it from being degraded. The VWF gene is transcribed into a 9kb mRNA and is translated into a pre-pro-polypeptide containing 2813 amino acids, consisting of a pre-sequence, a propeptide and a monomer. Post-translational processes of VWF include dimerization, glycosylation, sulfation, cleavage of the propeptide and multimerization; followed by storage or secretion. Normal VWF levels in the general population range from 35 to 200 IU/dL. Von Willebrand Disease (VWD) is caused by quantitative or qualitative abnormalities in VWF. Quantitative defects cause VWD type 1 and type 3. On the other hand, qualitative abnormalities cause VWD type 2, which can be subdivided into types 2A, 2B, 2M and 2N. VWD type 3 (VWD3) is a serious quantitative deficiency of VWF and is inherited in an autosomal recessive manner. Individuals with VWD3 have undetectable levels of VWF:Ag and also very low levels of FVIII. People with VWD3 may exhibit clinical symptoms such as severe or moderate mucocutaneous bleeding, muscle hematomas, and hemarthroses. Large size, highly polymorphic sequence and presence of a pseudogene complicate the screening of pathogenic variants in VWF. The present study aims at the molecular characterization of mutations in patients with VWD3 in Rio Grande do Sul. The VWF gene was sequenced in 26 cases diagnosed with VWD3 by new generation sequencing using Ion Torrent. The impact of the exchanged sense mutations was analyzed using 5 algorithms: Mutation taster, PROVEAN, S Mutation taster, PROVEAN, SIFT, Polyphen-2 and HOPE. Sanger sequencing was used to confirm a number ofmutations found in the NGS method. The VWF gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using 52 primer pairs. The strings were aligned with their reference (NM_000552.4) using the CodonCodeAligner software implemented in MEGA 5.04. We identified 72 different variants: 31 intronic, 17 synonymous, 16 missense, 6 deletion/insertion, and 2 nonsense. The mutations were distributed along the whole gene, having a higher prevalence in exon 28 (11%). Five novel mutations were found: c.6976+5G>T, c.6885_6886insC, c.3378C>T, c.3346_3347insCCA, and c.2503G> T. Twenty-four patients had more than one pathogenic mutation that could explain the disease phenotype. Among them, 17 patients presented the variants p.Pro2063Ser and p.Arg324*. The p.Pro2063Ser has controversies regarding the functional status of the variation. Both pathogenic and neutral results were found by the predictors, so probably the cause of the disease in these patients is p.Arg324* which generates a premature stop codon. As 60% of the patients presented this mutation and they live in neighboring regions in the state of Rio Grande do Sul, we can suggest that there may have been a founding effect. A haplotype with 13 other common variants found in these 17 patients reinforces this hypothesis. Using a next generation sequencing panel for VWF we were able to detect 50 out of 52 alleles in a set of 26 Brazilian patients clinically diagnosed withVWD3. However, despite all patients presented severe bleeding, the variation in their bleeding intensity, bleeding types and need of treatment could not be correlated with the types or position of their mutations. Nevertheless, the molecular analysis of VWF can be useful for both diagnostic and counselling purposes

Prolonged Survival of Allografts Induced by Mycobacterial Hsp70 Is Dependent on CD4+CD25+ Regulatory T Cells

Background: Heat shock proteins (Hsps) are stress induced proteins with immunomodulatory properties. The Hsp70 of Mycobacterium tuberculosis (TBHsp70) has been shown to have an anti-inflammatory role on rodent autoimmune arthritis models, and the protective effects were demonstrated to be dependent on interleukin-10 (IL-10). We have previously observed that TBHsp70 inhibited maturation of dendritic cells (DCs) and induced IL-10 production by these cells, as well as in synovial fluid cells. Methodology/Principal Findings: We investigated if TBHsp70 could inhibit allograft rejection in two murine allograft systems, a transplanted allogeneic melanoma and a regular skin allograft. In both systems, treatment with TBHsp70 significantly inhibited rejection of the graft, and correlated with regulatory T cells (Tregs) recruitment. This effect was not tumor mediated because injection of TBHsp70 in tumor-free mice induced an increase of Tregs in the draining lymph nodes as well as inhibition of proliferation of lymph node T cells and an increase in IL-10 production. Finally, TBHsp70 inhibited skin allograft acute rejection, and depletion of Tregs using a monoclonal antibody completely abolished this effect. Conclusions/Significance: We present the first evidence for an immunosuppressive role for this protein in a graft rejection system, using an innovative approach - immersion of the graft tissue in TBHsp70 solution instead of protein injection. Also, this is the first study that demonstrates dependence on Treg cells for the immunosuppressive role of TBHsp70. This finding is relevant for the elucidation of the immunomodulatory mechanism of TBHsp70. We propose that this protein can be used not only for chronic inflammatory diseases, but is also useful for organ transplantation management.Pontificia Universidade Catolica do Rio Grande do Sul (PUCRS)Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq)Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP

Altera??es fenotipicas e transcricionais em linf?citos T de uma popula??o idosa em risco imune no sul do Brasil

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 450693.pdf: 903446 bytes, checksum: 6805922c966dfb108b00594643df2744 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27The elderly population, characterized as people over 60 years old, has grown rapidly in recent years in Brazil, and with this increase in life expectancy, age-related changes appear, for example, immunosenescence. Some studies have shown that there are differences in the immunological profile of the elderly, often related to the numbers of T cells. The immune risk profile (IRP) has been defined as CD4/CD8 T-cell ratio <1 and positivity for serum anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. In this study, we investigated patterns of activation and differentiation of T lymphocytes by flow cytometry in an elderly population in IRP, compared with elderly people without risk profile (non-IRP), seeking to identify additional markers for this risk profile immune. For this study we recruited 60 elderly SUS patients in Porto Alegre, aged 60 years, 30 IRP and 30 non-IRP. Lymphocytes were isolated and stimulated in vitro to evaluate the production of cytokines and the expression of transcription factors. The subpopulations of T lymphocytes found were consistent with previous studies in which IRP patients had fewer naive and central memory T cells, as well as an increase was observed in the percentage of T cells CD8 + CD28-T cells and CD8 + PD-1 + in the IRP individuals. Furthermore, there was a reduction in mean fluorescence intensity (MFI) of transcription factors to canonical subtypes of T cell help (CD4 +) in IRP patients when compared to patients without IRP. The percentages of the different subtypes (TH1, TH2, TH17; Treg) of these cells were not different between the two groups. After stimulation with anti-CD3/anti-CD28 antibodies in culture for 24 hours, the concentration of cytokines in culture supernatants increased, but no significant differences between the two groups were found, except for IL-10, which was higher in IRP patients before stimulation. These results suggested that transcriptional mechanisms important in the differentiation of helper T cells are altered in IRP patients, which may affect the immune response of these individuals.A popula??o de idosos, caracterizada como pessoas com mais de 60 anos, vem aumentando muito nos ?ltimos anos no Brasil, e com esse aumento da expectativa de vida surgem altera??es relacionadas com a idade, por exemplo, a imunossenesc?ncia. Alguns estudos t?m demonstrado que existem diferen?as no perfil imunol?gico dos idosos, frequentemente relacionadas ao n?mero de c?lulas T. O perfil de risco imune (IRP) tem sido definido como taxa de c?lulas T CD4/CD8<1 e soro positividade para citomegalov?rus (CMV). Neste estudo, n?s investigamos padr?es de ativa??o e diferencia??o de linf?citos T, por citometria de fluxo, em uma popula??o idosa IRP, comparando com a popula??o idosa sem perfil de risco (n?o-IRP), buscando identificar marcadores adicionais para esse perfil de risco imune. Foram recrutados para esse estudo 60 idosos da rede SUS (sistema ?nico de sa?de) de Porto Alegre, com idade superior a 60 anos, sendo 30 IRP e 30 n?o-IRP. Linf?citos foram isolados e estimulados in vitro para avaliar a produ??o de citocinas e a express?o de fatores de transcri??o. As subpopula??es de linf?citos T encontradas foram condizentes com estudos anteriores em que os pacientes IRP possu?am menos c?lulas T naive e de mem?ria central, assim como foi observado um aumento nas porcentagens das c?lulas T CD8+CD28- e das c?lulas T CD8+PD-1+. Al?m disso, foi observada uma redu??o na m?dia de intensidade de fluoresc?ncia (MFI) dos fatores de transcri??o can?nicos para subtipos de c?lulas T de ajuda (CD4+) em pacientes IRP quando comparados com pacientes n?o-IRP. As porcentagens dos diferentes subtipos (TH1; TH2; TH17; Treg) dessas c?lulas n?o foram diferentes entre os dois grupos. Ap?s estimula??o com anticorpos anti-CD3/anti-CD28 em cultura por 24h, a concentra??o de citocinas no sobrenadante das culturas aumentou, mas n?o houve diferen?a significativa entre os dois grupos em rela??o ? concentra??o das citocinas em geral, exceto na IL-10 antes da estimula??o, que foi maior em pacientes IRP. Esses resultados sugerem que mecanismos transcricionais importantes para a diferencia??o de c?lulas T de ajuda est?o alterados em pacientes IRP, o que pode afetar a resposta imune desses indiv?duos

Perfil de risco imunológico de idosas com câncer de mama: os primeiros 37 casos = Immune risk profile of elderly women with breast cancer: the first 37 cases

Objetivos: Avaliar o perfil imunológico de risco em idosas com câncer de mama e testar se este pode ser um fator preditivo confiável para determinar tipos de tratamento e seguimento oncológico. Métodos: Foram pesquisadas a relação das células T CD4+/CD8+ e a sorologia para citomegalovírus no sangue periférico de mulheres com 60 anos ou mais de idade no momento do diagnóstico da neoplasia mamária, que realizaram tratamento cirúrgico no Centro de Mama da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul pelo Sistema Único de Saúde. Foram excluídas da pesquisa pacientes com sorologia positiva para HIV, com imunossupressão após transplante de órgãos e as que realizaram quimioterapia neoadjuvante. Os dados foram comparados em grupos conforme o comprometimento axilar, o tamanho tumoral, o perfil imunohistoquímico do tumor e a ocorrência de eventos adversos (recidiva axilar, recidiva local do tumor e/ou metástases). Nos casos de eventos adversos, foi realizada uma nova contagem de CD4+ e CD8+ Resultados: Foram incluídas 37 pacientes, entre as quais 10 tiveram metástases axilares. As pacientes com axila positiva para metástases apresentaram uma relação CD4+/CD8+ maior que nos casos de axila negativa para metástases (p=0,04). Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa em relação ao tamanho e perfil imunohistoquímico do tumor. No seguimento médio de 14,3 meses, ocorreram dois eventos adversos (uma recidiva axilar e um caso de metástases ósseas), quando se observou um aumento na relação das células T pesquisadas. Conclusões: A relação das células T CD4+/CD8+ parece aumentar nos casos de câncer de mama de pior prognóstico. Tanto quanto foi possível pesquisar na literatura, estes são os primeiros dados sobre células T CD4+ e CD8+ no sangue periférico de mulheres idosas com câncer de mama. Um seguimento maior poderá determinar o valor destas células como fator prognóstico e/ou preditiv

Local injection of TBHsp70 induces Tregs, IL-10 and leads to suppression in the draining lymph nodes.

<p>(A) Mice were injected subcutaneously in the thigh with PBS or 30 µg of TBHsp70. Draining lymph nodes were excised 4 days later, and cells were stained with fluorescent antibodies for CD4 and CD25, or CD4 and Foxp3. Plots show events gated on CD4+ cells. (B) Mice were injected subcutaneously in the thigh with TBHsp70 (1.5 mg/kg), DEXA (0.25 mg/kg) or PBS. Draining lymph nodes were excised 4 days later and single cell suspensions of lymph nodes were stimulated <i>in vitro</i> for 4 days with 0, 0.5, 1, or 2% of PHA. Viability of cells proliferating in response to PHA was estimated by an MTT assay, O.D. being read at 570 nm. Data are expressed as percentage of PHA-inhibited proliferation considering the O.D. at each PHA concentration as 100% proliferation. (C) Cytokine production of cultures supernatants was analyzed by flow cytometry, using a CBA (Mouse Th1/Th2/Th17) kit, except for TGF-β production, which was analyzed by ELISA. *, p<0.05; **, p<0.01.</p

CD4+CD25+ regulatory T cells are crucial for prolonged survival induced by TBHsp70.

<p>Mice were injected i.p. with a single injection of 150 µg anti-CD25 mAb (PC61). (A) Schematic representation of <i>in vivo</i> Treg depletion and transplantation. (B) For depletion confirmation, lymph nodes were excised, collagenase D treated, stained with anti-CD4 and anti-CD25 and analyzed by flow cytometry. (C) Survival curve of skin allograft immersed in PBS containing 30 µg of OVA or TBHsp70. Groups were CD25+ depleted or not depleted. *, p<0.05. n = 3 mice per treatment group. Depletions were performed 2 times.</p