Clonagem e expressão do gene da nucleoproteína do vírus da bronquite infecciosa em sistemas hospedeiros eucarioto (Pichia pastoris) e procarioto (Escherichia coli)

Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em...Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IBFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

Construção de uma biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais de galinhas com cadeia única (scFv) por phage display com reatividade cruzada para estirpes heterólogas do vírus da bronquite infecciosa aviária

Anticorpos monoclonais constituem a base de vários testes usados na detecção e na identificação de antígenos. Nesse contexto, tais imuno-reagentes têm sido extensivamente empregados na identificação de estirpes virais envolvidas na etiologia de surtos de bronquite infecciosa a campo, permitindo o aperfeiçoamento das técnicas de detecção e caracterização antigênica do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). No presente estudo, uma biblioteca de fragmentos de anticorpos de galinha originalmente preparada por phage display contra a estirpe vacinal (H120) do VBI foi usada para a seleção de fragmentos de anticorpos recombinantes com reatividade cruzada para as estirpes heterólogas IBVPR01 e IBVPR05, isoladas de surtos a campo no Brasil e a estirpe SE-17, isolada nos Estados Unidos. Após três ciclos de panning, foi identificado, pelo ELISA, um conjunto de 15 anticorpos scFv expressos em fagos e com reatividade cruzada para essas mesmas estirpes do VBI. A análise por Western-blotting revelou que dois desses clones apresentavam fagos expressando fragmentos de anticorpos monoclonais com reatividade cruzada para a nucleoproteína N das três estirpes do VBI e também para a forma recombinante dessa nucleoproteína derivada da estirpe M41. Concluindo, os fragmentos de anticorpos monoclonais recombinantes scFv-N produzidos em fagos interagem com um epítopo mais conservado da proteína N do VBI e apresentam um grande potencial para utilização na detecção e no diagnóstico direto desse vírus.Monoclonal antibodies are the basis of various techniques used for antigen detection or characterization, and their use is specially recommended for the identification of viral strains involved in the etiology of infectious bronchitis outbreaks. These antibodies are homogeneous, highly specific and fully characterizable, allowing the improvement of immunological techniques detection and antigenic characterization of avian infectious bronchitis virus strains (IBV). A phage display library was used, which was prepared previously against the IBV vaccine strain (H120) for the selection of new scFv antibody fragments specific for heterologous IBV strains isolated from outbreaks in Brazil (IBVPR01, IBVPR05) and USA (SE-17). After three cycles of panning, a set of 15 scFv antibodies were expressed in phages and cross-reacted in ELISA with these three viral strains. Western-blotting analysis showed that two of the clones were expressing scFv specific for the nucleoprotein of these IBV strains, as well as to the recombinant form of this protein derived from M41. In conclusion, the recombinant fragments of monoclonal antibodies expressed in phage have a great potential for future use in immunodiagnostic techniques and to study the evolution of infectious bronchitis virus.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq