Detection of Ralstonia solanacearum in potato tubers through qualitative and real-time PCR

Ralstonia solanacearum é uma bactéria transmitida por tubérculos-semente. As biovares 1 (raça 1) e 2 (raça 3) estão associadas à batata (Solanum tuberosum) e apresentam características epidemiológicas diferentes. A certificação de tubérculos-semente constitui-se num processo essencial para o manejo da murcha bacteriana, mas depende de métodos específicos e sensíveis de detecção deste patógeno. Este trabalho objetivou (i) projetar oligonucleotídeos iniciadores para diferenciação das biovares de R. solanacearum e (ii) estabelecer método de extração de DNA total de tubérculos de batata para detecção de R. solanacearum através de PCR qualitativa e quantitativa. Os oligos projetados para a biovar 1, baseados no gene pehS, não geraram o fragmento esperado de 500 pb, mas produtos inespecíficos. A PCR com os oligos projetados para a biovar 2, a partir do gene UDP-N-acetilglucosamina 4,6-dehidratase, amplificaram o DNA de ambas as biovares (354 pb). O método FTA foi mais sensível (um infectado/ 100 tubérculos) na obtenção de DNA de tecidos de batata, coletados com auxílio de seringas descartáveis, do que por lise celular por aquecimento ou bio-PCR. A presença de R. solanacearum em tubérculos coletados em São Francisco de Paula e Ibiraiaras, RS, não foi detectada através de PCR (OLI1/Y2), em amostras retiradas com seringas e submetidas à extração do DNA através do método FTA, lise celular por aquecimento, bio-PCR e lise celular por aquecimento, e kit GenSpinTM Plant DNA Purification. Entretanto, a detecção nos cartões FTA foi possível quando se utilizou os oligos RS-I/RS-II; a sensibilidade da PCR aumentou de 106 para 1 UFC.mL-1. Os resultados da PCR com o DNA eluído dos cartões FTA não se alteraram, viabilizando o uso do DNA do cartão FTA em PCR quantitativa. A PCR quantitativa, usando SYBR Green e os oligos RS-I/RS-II, confirmou a presença de R. solanacearum nas 13 amostras coletadas nos dois municípios.Ralstonia solanacearum is a seedborne potato tuber bacterium. Biovars 1 (race 1) and 2 (race 3) are associated to potato (Solanum tuberosum) and present different epidemiological features. Certification of seed potato tubers is the essencial step toward the bacterial wilt management, but depends on specific and sensitive methods of detection of this pathogen. This research aimed (i) to design primers to differentiate these biovars of R. solanacearum and (ii) to establish a method of total DNA extraction of potato tubers to detect R. solanacearum through qualitative and real-time PCR. Designed primers to biovar 1, based on the gene pehS, did not produce the expected fragment (500 bp), but unespecific bands. PCR with primers designed to biovar 2, based in the gene UDP-N-acetilglucosamina 4,6-dehydratase, amplified DNA from both biovars (354 bp). The FTA card method was more sensitive (one infected/ 100 tubers) to obtain DNA from potato tissue, collected using a dischargeable syringe, than by heating cellular lyse or bio-PCR plus heating cellular lyse. The presence of R. solanacearum in tubers collected in São Francisco de Paula and Ibiraiaras, RS, was not detected by PCR (OLI1/Y2), on samples extracted using syringes and submitted to DNA extraction through FTA card method, heating cellular lyse, bio-PCR plus heating cellular lyse, and GenSpinTM Plant DNA Purification kit. However, the detection in the FTA cards was possible when RS-I/RS-II was used; the PCR sensititivity increased from 106 to 1 CFU.mL-1. The PCR results with DNA eluted from FTA cards were the same, allowing the use of the DNA from the FTA card in real-time PCR. Real-time PCR, using SYBR Green and RS-I/RS-II primers, confirmed the presence of R. solanacearum in the 13 symptomless potato tuber samples collected in the two counties

Molecular and biochemical aspects involved in partial crown rust resistance in Avena sativa L

Ferrugem da folha, causada por Puccinia coronata f. sp. avenae, é a principal doença da aveia (Avena sativa L.). Tradicionalmente, a resistência utilizada nos programas de melhoramento é a completa, controlada por um ou poucos genes, sendo superada rapidamente pelo patógeno. Há várias décadas, tem sido sugerido que a resistência parcial pode ser mais durável. A cultivar URS 21 apresenta resistência parcial à ferrugem da folha e tem permanecido resistente desde seu lançamento, no ano 2000. Este estudo visou identificar aspectos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência parcial de URS 21 à ferrugem da folha. Foram utilizados dois genótipos suscetíveis e um completamente resistente como controles. Em plântulas e plantas inoculadas com o patógeno, foi verificado em URS 21 um aumento na síntese de compostos fenólicos máximo em 24 horas após a inoculação (hai), enquanto que URS 22 (suscetível) teve aumento tardio, 120 hai, provavelmente relacionado com a colonização do fungo. Em URS 21, foi verificado aumento da expressão de genes envolvidos na produção de avenantramidas, elevada concentração de compostos fenólicos totais, expressão de peroxidase, acúmulo de peróxido na epiderme, 24 hai, sugerindo síntese de compostos fenólicos estruturais. O decréscimo na produção de peróxido, em URS 21, a partir de 24 hai, também pode dever-se a produção de fenólicos estruturais. Além disso, em 24 hai, a atividade de ascorbato peroxidase, catalase e glutationa peroxidase, em URS 21, foram inferiores aos demais tempos, sugerindo que o peróxido foi consumido por peroxidases na síntese de fenólicos estruturais. Em plantas adultas de URS 21, inoculadas com o fungo, houve incremento na concentração de saponinas esteroidais, até 72 hai, enquanto que URS 22 em 48 hai, apresentou 15% da concentração máxima encontrada em URS 21, evidenciando a importância deste composto na resistência parcial à ferrugem da folha em URS 21. Além disso, a análise da expressão gênica e transcriptômica indicou a síntese de saponinas esteroidais do tipo avenacosides em URS 21. Das sequências geradas pelo RNA-sequenciamento, com função conhecida, muitas estão envolvidas no metabolismo secundário, estresse oxidativo, regulação transcricional, transporte, morte celular e defesa. Conclui-se que compostos fenólicos e saponinas são os principais componentes do mecanismo de defesa à resistência parcial à ferrugem da folha de URS 21.Crown rust caused by Puccinia coronata f. sp. avenae is the main disease of oats (Avena sativa L.) in the world. Traditionally, the resistance exploited by oat breeders completely prevents reproduction of the fungus on the host and it segregates as a single or a few genes, thus, it is rapidly overcome by the pathogen. For several decades, it has been suggested that the partial resistance can be more durable. The Brazilian oat cultivar URS 21 is partially resistant and has remained resistant to crown rust since its release 2000. This study aimed to identify the biochemical and molecular mechanisms involved in the partial resistance of URS 21 to crown rust. Two susceptible and one completely resistant cultivar were used as control. URS 21 adult plants and seedlings inoculated with the pathogen showed increasing of total phenolics, with maximum value at 24 hours after inoculation (hai), however in URS 22 (susceptible) there was a later increase, at 120 hai, probably related to the fungus colonization. In URS 21, genes involved in production of avenantramids were up regulated after 24 hai. The increase in the concentration of phenolic compounds, peroxidase expression and accumulation of peroxide in the epidermis, was due to the action of peroxidases at 24 hai and indicated that structural synthesis of phenolic compounds was involved in partial resistance in URS 21. The decrease in peroxide production in URS 21, at 24 hai, may be related to the assembly of structural phenolics. Furthermore, the reduction in the activity of ascorbate peroxidase, catalase and glutathione peroxidase in URS 21, at 24 hai, indicated that peroxide has been consumed by peroxidase and structural phenolics synthesis. After 48 hai, in resistant genotypes, fluorescent cells, indicative of cell death, were visualized. In inoculated URS 21 adult plants, an increase in the concentration of steroidal saponins was observed at 72 hai, while in URS 22 an increase was observed in this compound at 48 hai, about 15% of the maximum concentration found in URS 21, demonstrating the importance of this compound in partial resistance to crown rust in URS 21. Furthermore, gene expression and transcriptomics indicated the synthesis of avenacosides, a type of steroidal saponina, in URS 21. Several sequences generated by RNA sequencing were involved in secondary metabolism, oxidative stress, transcriptional regulation, transport, cell death and defense. The data suggest that phenolic compounds and saponins are the main defense mechanisms of partial resistance to crown rust in URS 21

Molecular and biochemical aspects involved in partial crown rust resistance in Avena sativa L

Ferrugem da folha, causada por Puccinia coronata f. sp. avenae, é a principal doença da aveia (Avena sativa L.). Tradicionalmente, a resistência utilizada nos programas de melhoramento é a completa, controlada por um ou poucos genes, sendo superada rapidamente pelo patógeno. Há várias décadas, tem sido sugerido que a resistência parcial pode ser mais durável. A cultivar URS 21 apresenta resistência parcial à ferrugem da folha e tem permanecido resistente desde seu lançamento, no ano 2000. Este estudo visou identificar aspectos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência parcial de URS 21 à ferrugem da folha. Foram utilizados dois genótipos suscetíveis e um completamente resistente como controles. Em plântulas e plantas inoculadas com o patógeno, foi verificado em URS 21 um aumento na síntese de compostos fenólicos máximo em 24 horas após a inoculação (hai), enquanto que URS 22 (suscetível) teve aumento tardio, 120 hai, provavelmente relacionado com a colonização do fungo. Em URS 21, foi verificado aumento da expressão de genes envolvidos na produção de avenantramidas, elevada concentração de compostos fenólicos totais, expressão de peroxidase, acúmulo de peróxido na epiderme, 24 hai, sugerindo síntese de compostos fenólicos estruturais. O decréscimo na produção de peróxido, em URS 21, a partir de 24 hai, também pode dever-se a produção de fenólicos estruturais. Além disso, em 24 hai, a atividade de ascorbato peroxidase, catalase e glutationa peroxidase, em URS 21, foram inferiores aos demais tempos, sugerindo que o peróxido foi consumido por peroxidases na síntese de fenólicos estruturais. Em plantas adultas de URS 21, inoculadas com o fungo, houve incremento na concentração de saponinas esteroidais, até 72 hai, enquanto que URS 22 em 48 hai, apresentou 15% da concentração máxima encontrada em URS 21, evidenciando a importância deste composto na resistência parcial à ferrugem da folha em URS 21. Além disso, a análise da expressão gênica e transcriptômica indicou a síntese de saponinas esteroidais do tipo avenacosides em URS 21. Das sequências geradas pelo RNA-sequenciamento, com função conhecida, muitas estão envolvidas no metabolismo secundário, estresse oxidativo, regulação transcricional, transporte, morte celular e defesa. Conclui-se que compostos fenólicos e saponinas são os principais componentes do mecanismo de defesa à resistência parcial à ferrugem da folha de URS 21.Crown rust caused by Puccinia coronata f. sp. avenae is the main disease of oats (Avena sativa L.) in the world. Traditionally, the resistance exploited by oat breeders completely prevents reproduction of the fungus on the host and it segregates as a single or a few genes, thus, it is rapidly overcome by the pathogen. For several decades, it has been suggested that the partial resistance can be more durable. The Brazilian oat cultivar URS 21 is partially resistant and has remained resistant to crown rust since its release 2000. This study aimed to identify the biochemical and molecular mechanisms involved in the partial resistance of URS 21 to crown rust. Two susceptible and one completely resistant cultivar were used as control. URS 21 adult plants and seedlings inoculated with the pathogen showed increasing of total phenolics, with maximum value at 24 hours after inoculation (hai), however in URS 22 (susceptible) there was a later increase, at 120 hai, probably related to the fungus colonization. In URS 21, genes involved in production of avenantramids were up regulated after 24 hai. The increase in the concentration of phenolic compounds, peroxidase expression and accumulation of peroxide in the epidermis, was due to the action of peroxidases at 24 hai and indicated that structural synthesis of phenolic compounds was involved in partial resistance in URS 21. The decrease in peroxide production in URS 21, at 24 hai, may be related to the assembly of structural phenolics. Furthermore, the reduction in the activity of ascorbate peroxidase, catalase and glutathione peroxidase in URS 21, at 24 hai, indicated that peroxide has been consumed by peroxidase and structural phenolics synthesis. After 48 hai, in resistant genotypes, fluorescent cells, indicative of cell death, were visualized. In inoculated URS 21 adult plants, an increase in the concentration of steroidal saponins was observed at 72 hai, while in URS 22 an increase was observed in this compound at 48 hai, about 15% of the maximum concentration found in URS 21, demonstrating the importance of this compound in partial resistance to crown rust in URS 21. Furthermore, gene expression and transcriptomics indicated the synthesis of avenacosides, a type of steroidal saponina, in URS 21. Several sequences generated by RNA sequencing were involved in secondary metabolism, oxidative stress, transcriptional regulation, transport, cell death and defense. The data suggest that phenolic compounds and saponins are the main defense mechanisms of partial resistance to crown rust in URS 21

Cafeeiro (Coffea arabica L. ): mancha de phoma

Apresenta folha de cafeeiro com mancha necrótica com bordos irregulares e picnídios. Exibe, também, massa de conídios retirada dessa lesãoComponente Curricular::Educação Superior::Ciências Agrárias::Agronomi

Cafeeiro (Coffea arabica L. ): mancha de phoma

Apresenta folha de cafeeiro com mancha necrótica com bordos irregulares e picnídios. Exibe, também, massa de conídios retirada dessa lesãoComponente Curricular::Educação Superior::Ciências Agrárias::Agronomi

Long-term maintenance of in vitro cultures affects growth and secondary metabolism of St. John's Wort A manutenção prolongada de culturas in vitro afeta o crescimento e o metabolismo secundário de hipérico

Hypericum perforatum is a traditional medicinal plant with wound healing and antidepressant properties. Efficiency of micropropagation is often related to the long term maintenance of tissues in culture, which may alter the secondary metabolism of plants. The objective of this study was to evaluate growth and secondary metabolism of in vitro shoots of H. perforatum on short and long term maintenance of cultures (30 and 100 days). The effect of BA and NAA supplementation was evaluated during 30 days of culture. Adventitious shoots were cultivated on MS medium supplemented with 4.4mM BA alone or in combination with 0.05mM NAA for 30 days. A hormone-free medium was used as control. Shoots cultivated for 100 days were maintained in presence of 4.4mM BA. Biomass, multiplication of shoots, contents of phenolic compounds, flavonoids and hypericin were evaluated. No difference between BA and BA+NAA was observed on growth, multiplication of shoots and levels of flavonoids at the end of 30 days of culture. Production of phenolic compounds was promoted by addition of BA+NAA to the medium, whereas hypericin was increased by the presence of BA. The time of culture (30 and 100 days) affected all the parameters analyzed, except the levels of flavonoids in the short term experiment.Hypericum perforatum é uma planta medicinal que apresenta propriedades cicatrizante e antidepressiva. Frequentemente, a eficiência da micropropagação está relacionada à manutenção dos tecidos em cultura por longos períodos, o que pode alterar o metabolismo secundário das plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento e o metabolismo secundário de brotações adventícias de H. perforatum mantidas por diferentes tempos de cultivo (30 e 100 dias). O efeito da adição de BA e ANA foi avaliado no período de 30 dias. As brotações foram cultivadas em meio MS suplementado com 4,4mM BA como único regulador ou em combinação com 0,05mM ANA, por 30 dias. Um meio de cultivo sem adição de reguladores foi utilizado como controle. As brotações cultivadas por 100 dias foram mantidas em presença de 4,4mM BA. A biomassa, a multiplicação dos brotos, as concentrações de compostos fenólicos, flavonoides e hipericina foram os parâmetros avaliados. Nenhuma diferença entre a adição de BA ou BA+ANA foi observada quanto ao crescimento, ao número de brotos e aos níveis de flavonoides ao final de 30 dias de cultivo. Diferenças neste período foram detectadas nos níveis de compostos fenólicos e de hipericina quando os brotos foram cultivados em presença de BA+NAA e de BA, respectivamente. O tempo de cultivo (30 e 100 dias) afetou todos os parâmetros avaliados, com exceção dos níveis de flavonoides no período de 30 dias