The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer

Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2). FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulären Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulären FGF-Bioaktivität spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome überexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische Färbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Überexpression von FGF-BP eine bösartige phänotypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann. Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Abhängig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg über ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleäre Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleärem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleäre Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene Verkürzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass Verkürzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzelluläre Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, während bei N-terminalen Verkürzungsmutanten die nukleäre Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhängen. Während in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. Außerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen Verkürzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, während bei C- und N-terminalen Verkürzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert. Zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulären Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazelluläre, nukleäre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhängig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende Aktivitäten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen. HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezüglich der Effekte der HER-2-Überexpression auf die zelluläre Sensitivität von Tumoren gegenüber Chemotherapie sind jedoch widersprüchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten Sensitivität von Tumoren führt. Dies gilt besonders für Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Überexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulären Resistenz gegenüber Paclitaxel und rViscumin untersucht. Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren führte zu erhöhter zellulärer Resistenz gegenüber Paclitaxel. Diese Daten bestätigten vorherige Ergebnisse bezüglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein „HER-2-Gen-Dosis-Effekt“ etabliert, während Doxorubicin- und Cisplatin-Zytotoxitäten unverändert blieben. Zur näheren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte Veränderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhängig von der HER-2-Expressions, aber änderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhängig. Schließlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen über einen Caspase-unabhängigen Weg Apoptose induziert. Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting führte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der Sensitivität gegenüber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine „HER-2-Gen-Dosis“-abhängige Sensitivität der Zellen gegenüber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geänderte zelluläre rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhängiger Weise aktiviert werden. Während keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhängige Herunterregulation des antiapoptotischen Moleküls bcl-2. Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches Zielmolekül in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezüglich seiner intrazellulären Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezüglich der Sensitivität von Ovarialkarzinomen gegenüber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte

The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer

Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2). FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulären Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulären FGF-Bioaktivität spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome überexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische Färbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Überexpression von FGF-BP eine bösartige phänotypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann. Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Abhängig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg über ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleäre Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleärem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleäre Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene Verkürzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass Verkürzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzelluläre Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, während bei N-terminalen Verkürzungsmutanten die nukleäre Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhängen. Während in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. Außerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen Verkürzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, während bei C- und N-terminalen Verkürzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert. Zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulären Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazelluläre, nukleäre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhängig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende Aktivitäten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen. HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezüglich der Effekte der HER-2-Überexpression auf die zelluläre Sensitivität von Tumoren gegenüber Chemotherapie sind jedoch widersprüchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten Sensitivität von Tumoren führt. Dies gilt besonders für Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Überexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulären Resistenz gegenüber Paclitaxel und rViscumin untersucht. Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren führte zu erhöhter zellulärer Resistenz gegenüber Paclitaxel. Diese Daten bestätigten vorherige Ergebnisse bezüglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein „HER-2-Gen-Dosis-Effekt“ etabliert, während Doxorubicin- und Cisplatin-Zytotoxitäten unverändert blieben. Zur näheren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte Veränderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhängig von der HER-2-Expressions, aber änderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhängig. Schließlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen über einen Caspase-unabhängigen Weg Apoptose induziert. Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting führte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der Sensitivität gegenüber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine „HER-2-Gen-Dosis“-abhängige Sensitivität der Zellen gegenüber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geänderte zelluläre rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhängiger Weise aktiviert werden. Während keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhängige Herunterregulation des antiapoptotischen Moleküls bcl-2. Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches Zielmolekül in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezüglich seiner intrazellulären Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezüglich der Sensitivität von Ovarialkarzinomen gegenüber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte

A switch-on mechanism to activate maize ribosome-inactivating protein for targeting HIV-infected cells

Maize ribosome-inactivating protein (RIP) is a plant toxin that inactivates eukaryotic ribosomes by depurinating a specific adenine residue at the α-sarcin/ricin loop of 28S rRNA. Maize RIP is first produced as a proenzyme with a 25-amino acid internal inactivation region on the protein surface. During germination, proteolytic removal of this internal inactivation region generates the active heterodimeric maize RIP with full N-glycosidase activity. This naturally occurring switch-on mechanism provides an opportunity for targeting the cytotoxin to pathogen-infected cells. Here, we report the addition of HIV-1 protease recognition sequences to the internal inactivation region and the activation of the maize RIP variants by HIV-1 protease in vitro and in HIV-infected cells. Among the variants generated, two were cleaved efficiently by HIV-1 protease. The HIV-1 protease-activated variants showed enhanced N-glycosidase activity in vivo as compared to their un-activated counterparts. They also possessed potent inhibitory effect on p24 antigen production in human T cells infected by two HIV-1 strains. This switch-on strategy for activating the enzymatic activity of maize RIP in target cells provides a platform for combating pathogens with a specific protease

Viscum album L. extracts in breast and gynaecological cancers: a systematic review of clinical and preclinical research

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p><it>Viscum album </it>L. extracts (VAE, European mistletoe) are a widely used medicinal plant extract in gynaecological and breast-cancer treatment.</p> <p>Methods</p> <p>Systematic review to evaluate clinical studies and preclinical research on the therapeutic effectiveness and biological effects of VAE on gynaecological and breast cancer. Search of databases, reference lists and expert consultations. Criteria-based assessment of methodological study quality.</p> <p>Results</p> <p>19 randomized (RCT), 16 non-randomized (non-RCT) controlled studies, and 11 single-arm cohort studies were identified that investigated VAE treatment of breast or gynaecological cancer. They included 2420, 6399 and 1130 patients respectively. 8 RCTs and 8 non-RCTs were embedded in the same large epidemiological cohort study. 9 RCTs and 13 non-RCTs assessed survival; 12 reported a statistically significant benefit, the others either a trend or no difference. 3 RCTs and 6 non-RCTs assessed tumour behaviour (remission or time to relapse); 3 reported statistically significant benefit, the others either a trend, no difference or mixed results. Quality of life (QoL) and tolerability of chemotherapy, radiotherapy or surgery was assessed in 15 RCTs and 9 non-RCTs. 21 reported a statistically significant positive result, the others either a trend, no difference, or mixed results. Methodological quality of the studies differed substantially; some had major limitations, especially RCTs on survival and tumour behaviour had very small sample sizes. Some recent studies, however, especially on QoL were reasonably well conducted. Single-arm cohort studies investigated tumour behaviour, QoL, pharmacokinetics and safety of VAE. Tumour remission was observed after high dosage and local application. VAE application was well tolerated. 34 animal experiments investigated VAE and isolated or recombinant compounds in various breast and gynaecological cancer models in mice and rats. VAE showed increase of survival and tumour remission especially in mice, while application in rats as well as application of VAE compounds had mixed results. <it>In vitro </it>VAE and its compounds have strong cytotoxic effects on cancer cells.</p> <p>Conclusion</p> <p>VAE shows some positive effects in breast and gynaecological cancer. More research into clinical efficacy is warranted.</p

Thrombin-mediated impairment of fibroblast growth factor-2 activity

Thrombin generation increases in several pathological conditions, including cancer, thromboembolism, diabetes and myeloproliferative syndromes. During tumor development, thrombin levels increase along with several other molecules, including cytokines and angiogenic factors. Under such conditions, it is reasonable to predict that thrombin may recognize new low-affinity substrates that usually are not recognized under low-expression levels conditions. In the present study, we hypothesized that fibroblast growth factor (FGF)-2 may be cleaved by thrombin and that such action may lead to an impairment of its biological activity. The evidence collected in the present study indicates that FGF-2-induced proliferation and chemotaxis/invasion of SK-MEL-110 human melanoma cells were significantly reduced when FGF-2 was pre-incubated with active thrombin. The inhibition of proliferation was not influenced by heparin. Phe-Pro-Arg-chloromethyl ketone, a specific inhibitor of the enzymatic activity of thrombin, abolished the thrombin-induced observed effects. Accordingly, both FGF-2-binding to cell membranes as well as FGF-2-induced extracellular signal-regulated kinase phosphorylation were decreased in the presence of thrombin. Finally, HPLC analyses demonstrated that FGF-2 is cleaved by thrombin at the peptide bond between residues Arg42 and Ile43 of the mature human FGF-2 sequence. The apparent k(cat)/K(m) of FGF-2 hydrolysis was 1.1 x 10(4) M(-1) x s(-1), which is comparable to other known low-affinity thrombin substrates. Taken together, these results demonstrate that thrombin digests FGF-2 at the site Arg42-Ile43 and impairs FGF-2 activity in vitro, indicating that FGF-2 is a novel thrombin substrate