Estudios preliminares sobre la secuencia de los aminoácidos en el citocromo c de corazón de caballo

En la primera parte se exponen brevemente los antecedentes del descubrimiento y primeros estudios sobre el citocromo c, y se resume el estado actual de los conocimientos acerca de su estructura. En la parte experimental se da cuenta de los trabajos realizados, cuyoresumen es el siguiente: 1) Se obtuvo citocromo c a partir de músculo de corazón de caballo por unmétodo clásico. La preparación obtenida se liofilizó y se purificó por cromatografía sobre columna de Amberlite IRC-50, resina de intercambio catiónico; se obtuvieron varias fracciones, empleandose para los estudios realizados la primera de ellas según el orden de elución. 2) Se llevó a cabo la hidrólisis con tripsina, en razón de los datos conocidos acerca de su especificidad con respecto a los carboxilos de lisina y arginina. Los productos de la hidrólisis fueron separados por electroforesis sobre papel de filtro a pH 6,5. Sobre los electroforetogramas se ejecutaron reacciones de péptidos en general y reacciones específicas de arginina, histidina, tirosina y triptofano. Los péptidos obtenidos fueron separados nuevamente por cromatografía bidimensional sobre papel; una vez eluidos se los sometió a la hidrólisis en medio ácido. Los productos de la hidrolisis total fueron cromatografiados bidimensionalmente sobre papel e identificados los aminoácidos componentes. Una fracción electroforética denominadaneutra fué dejada para un trabajo posterior. 3) El número total de péptidos obtenido sobrepasa al que hubiera podidoesperarse de la especificidad de la tripsina, teniendo en cuenta análisissobre número total de aminoácidos en el citocromo c. Lo mismo ocurre paragran parte de los aminoácidos. Se sometió luego la mezcla de péptidos quese obtiene de la hidrólisis tripsínica a la separación por cromatografía sobre columna de Dowex-50, resina de intercambiador catiónico, mediante una elución en gradiente continuo del pH. Se obtuvo de este modo una curva en la cual hay 17 picos. En el mismo laboratorio se hallan en progreso actualmente análisis de estructura de estos péptidos (Feitelson, Margoliash y Frowirth, comunicación personal). 4) De los resultados obtenidos por la separación electroforética y cromatográfica sobre papel puede extraerse la conclusión de que en el citocromo de músculo de corazón de caballo existen por lo menos dos residuos de cisteína aparte de los dos que se hallan presentes en el "core" de la molécula sirven para mantener la cadena peptídica unida al grupo porfirínico. El número de histidinas, por otra parte, es de cuatro: una de ellas se halla en el "core" y está directamente relacionada con la formación del hemocromógeno. El número de argininas de la molécula es de cuatro por lo menos. 5) La molécula de citocromo c fupe sometida a la degradación escalonadaa partir del aminoácido nitrógeno terminal por la acción del fenilisotiociánico. Se confirmó que el primer término de la cadena está constituido por la histidina, tal como se hallara empleando el método del fluordinitrobenceno (Margoliash, 1955) y en contradicción con otro trabajo (Matsubara, Hagihara, Horio y Okunuki, 1957) que señala la presencia de un residuo de arginina en dicho lugar de la molécula. 6) La degradación debe detenerse al llegar al segundo ciclo pues se produce una ruptura de la cadena que se atribuye al ataque del fenilisotiociánico sobre los grupos -amino de las numerosas lisinas que contiene la molécula. 7) Al estado presente de las investigaciones, la molécula de citocromo c de músculo de corazón de caballo puede ser descripta por el siguiente esquema: (ver esquema en la tesis). 8) En el laboratorio donde se realizó este trabajo se ejecutan actualmentenuevas investigaciones para completar el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del citocromo c de músculo de corazón de caballo, determinar laestructura espacial de la molécula, establecer las causas de la formacióndel hemocromógeno e interpretar, a la luz de estos resultados, el mecanismode la actividad enzimática de la molécula.Fil: Schejter, Abel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

The Redox Couple of the Cytochrome \u3cem\u3ec\u3c/em\u3e Cyanide Complex: The Contribution of Heme Iron Ligation to the Structural Stability, Chemical Reactivity, and Physiological Behavior of Horse Cytochrome \u3cem\u3ec\u3c/em\u3e

Contrary to most heme proteins, ferrous cytochrome c does not bind ligands such as cyanide and CO. In order to quantify this observation, the redox potential of the ferric/ferrous cytochrome c–cyanide redox couple was determined for the first time by cyclic voltammetry. Its E0′ was −240 mV versus SHE, equivalent to −23.2 kJ/mol. The entropy of reaction for the reduction of the cyanide complex was also determined. From a thermodynamic cycle that included this new value for the cyt c cyanide complex E0′, the binding constant of cyanide to the reduced protein was estimated to be 4.7 × 10−3 LM−1 or 13.4 kJ/mol (3.2 kcal/mol), which is 48.1 kJ/mol (11.5 kcal/mol) less favorable than the binding of cyanide to ferricytochrome c. For coordination of cyanide to ferrocytochrome c, the entropy change was earlier experimentally evaluated as 92.4 Jmol−1K−1 (22.1 e.u.) at 25 K, and the enthalpy change for the same net reaction was calculated to be 41.0 kJ/mol (9.8 kcal/mol). By taking these results into account, it was discovered that the major obstacle to cyanide coordination to ferrocytochrome c is enthalpic, due to the greater compactness of the reduced molecule or, alternatively, to a lower rate of conformational fluctuation caused by solvation, electrostatic, and structural factors. The biophysical consequences of the large difference in the stabilities of the closed crevice structures are discussed

Direct Voltammetric Observation of Redox Driven Changes in Axial Coordination and Intramolecular Rearrangement of the Phenylalanine-82-Histidine Variant of Yeast Iso-1-cytochrome c

Direct square-wave and cyclic voltammetric electrochemical examination of the yeast iso-1-cytochrome c Phe82His/Cys102Ser variant revealed the intricacies of redox driven changes in axial coordination, concomitant with intramolecular rearrangement. Electrochemical methods are ideally suited for such a redox study, since they provide a direct and quantitative visualization of specific dynamic events. For the iso-1-cytochrome c Phe82His/Cys102Ser variant, square-wave voltammetry showed that the primary species in the reduced state is the Met80-Fe2+-His18 coordination form, while in the oxidized state the His82-Fe3+-His18 form predominates. The addition or removal of an electron to the appropriate form of this variant serves as a switch to a new molecular form of the cytochrome. Using the 2 × 2 electrochemical mechanism, simulations were done for the cyclic voltammetry experiments at different scan rates. These, in turn, provided relative rate constants for the intramolecular rearrangement/ligand exchange and the equilibrium redox potentials of the participating coordination forms:  kb,AC = 17 s-1 for Met80-Fe3+-His18 → His82-Fe3+-His18 and kf,BD \u3e 10 s-1 for His82-Fe2+-His18 → Met80-Fe2+-His18; E0‘ = 247 mV for Met80-Fe3+/2+-His18 couple, E0‘ = 47 mV for His82-Fe3+/2+-His18 couple, and E0‘ = 176 mV for the cross-reaction couple, His82-Fe3+-His18 + e- → Met80-Fe2+-His18. Thermodynamic parameters, including the entropy of reaction, ΔS0‘Rxn, were determined for the net reduction/rearrangement reaction, His82-Fe3+-His18 + e- → Met80-Fe2+-His18, and compared to those for wild-type cytochrome, Met80-Fe3+-His18 + e- → Met80-Fe2+-His18. For the Phe82His variant mixed redox couple, ΔS0‘Rxn = −80 J/mol·K compared to ΔS0‘Rxn = −52 J/mol·K for the wild-type cyt c couple without rearrangement. Comparison of these entropies indicates that the oxidized His82-Fe3+-His18 form is highly disordered. It is proposed that this high level of disorder facilitates rapid rearrangement to Met80-Fe2+-His18 upon reduction