Ergothioneine Biosynthesis and Functionality in the Opportunistic Fungal Pathogen, Aspergillus fumigatus.

Ergothioneine (EGT; 2-mercaptohistidine trimethylbetaine) is a trimethylated and sulphurised histidine derivative which exhibits antioxidant properties. Here we report that deletion of Aspergillus fumigatus egtA (AFUA_2G15650), which encodes a trimodular enzyme, abrogated EGT biosynthesis in this opportunistic pathogen. EGT biosynthetic deficiency in A. fumigatus significantly reduced resistance to elevated H2O2 and menadione, respectively, impaired gliotoxin production and resulted in attenuated conidiation. Quantitative proteomic analysis revealed substantial proteomic remodelling in ΔegtA compared to wild-type under both basal and ROS conditions, whereby the abundance of 290 proteins was altered. Specifically, the reciprocal differential abundance of cystathionine γ-synthase and β-lyase, respectively, influenced cystathionine availability to effect EGT biosynthesis. A combined deficiency in EGT biosynthesis and the oxidative stress response regulator Yap1, which led to extreme oxidative stress susceptibility, decreased resistance to heavy metals and production of the extracellular siderophore triacetylfusarinine C and increased accumulation of the intracellular siderophore ferricrocin. EGT dissipated H2O2 in vitro, and elevated intracellular GSH levels accompanied abrogation of EGT biosynthesis. EGT deficiency only decreased resistance to high H2O2 levels which suggests functionality as an auxiliary antioxidant, required for growth at elevated oxidative stress conditions. Combined, these data reveal new interactions between cellular redox homeostasis, secondary metabolism and metal ion homeostasis

Peptidinhibitoren der Transpeptidase Sortase A aus Staphylococcus aureus und Untersuchungen zur Ovothiol A-Biosynthese in Erwinia tasmaniensis

Sortase A Inhibitoren: Sortase A (SrtA) aus Staphylococcus aureus ist eine membranverankerte Transpeptidase, welche Vorläufermoleküle oberflächenassoziierter Virulenzfaktoren anhand des Motivs LPXTG erkennt und an der Zelloberfläche verankert. In der vorliegenden Arbeit wurden dem LPXTG-Motiv ähnelnde zyklische Peptidsequenzen hinsichtlich ihrer Interaktion mit SrtA charakterisiert. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Relevanz der Peptidzyklisierung für diese Interaktion. Die untersuchten Peptidsequenzen wurden eindeutig als SrtA-Inhibitoren klassifiziert. Es wurden hierzu in vitro Methoden zur Ermittlung der Kd-Werte (10 -94 nM), thermodynamischen Bindungsparameter (ΔH = 10,2 kcal/mol, -TΔS = 0,3 kcal/mol), Bindungsstöchiometrien (N = 1), IC50-Werte (0,4 – 3,7 µM) und des Inhibitionsmechanismuses (langsam reversibel) entwickelt. Zudem wurde ein Flüssigkultur-Assay zur Quantifizierung der in vivo-Bindung der Peptidinhibitoren an S. aureus-Zellen etabliert. Es wurde gezeigt, dass die in vitro Eigenschaften der Untersuchten SrtA-Inhibitoren unbeeinflusst von der Peptidzyklisierung sind. Die in vivo Bindungsaffinität wird hingegen von einer vorhandenen Peptidzyklisierung erhöht. Ovothiol A-Biosynthese: Die Ovothiol A-Biosynthese in E. tasmaniensis beruht auf drei enzymatischen Schritten, einer Synthese, einer ß-Elimination und einer Methylierung (Vogt et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit wurden die Produkte eines Ovothiol A Sulfoxidsynthase Gens (OvoA) und eines Ovothiol A ß-Lyase Gens (OvoB) aus E. tasmaniensis charakterisiert. Dem Motiv His170-X3-His174-X-Glu176 der OvoA konnte die Funktion der Eisenkoordination zugewiesen werden. Hierzu wurden die Enzymmutanten OvoAH170A, OvoAH174A und OvoAE176A hergestellt und gezeigt, dass sie jeweils einen vollständigen Aktivitätsverlust aufweisen. Ergänzend wurde die Relevanz des in OvoA konservierten Arg183 untersucht. Hierzu wurden die Mutanten OvoAR183A und OvoAR183K hergestellt. OvoAR183A zeigte einen vollständigen Aktivitätsverlust und OvoAR183K einen erheblichen Aktivitätsverlust. Vermutlich sind an Position 183 also positive Ladungen erforderlich. Für OvoB wurden die Umsatzraten für diverse Substrate bestimmt. Das von OvoA gelieferte Intermediat wurde mit der höchsten Effizienz von OvoB umgesetzt. Es lässt sich schließen, dass es sich bei dem untersuchten Enzym um die gesucht ß-Lyase der Ovothiol A-Biosynthese handelt und diese jedoch eine geringe Substratspezifität aufweist