Coupling metabolic footprinting and flux balance analysis to predict how single gene knockouts perturb microbial metabolism

Tese de mestrado. Biologia (Bioinformática e Biologia Computacional). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012The model organisms Caenorhabditis elegans and E. coli form one of the simplest gut microbe host interaction models. Interventions in the microbe that increase the host longevity including inhibition of folate synthesis have been reported previously. To find novel single gene knockouts with an effect on lifespan, a screen of the Keio collection of E. coli was undertaken, and some of the genes found are directly involved in metabolism. The next step in those specific cases is to understand how these mutations perturb metabolism systematically, so that hypotheses can be generated. For that, I employed dynamic Flux Balance Analysis (dFBA), a constraint-based modeling technique capable of simulating the dynamics of metabolism in a batch culture and making predictions about changes in intracellular flux distribution. Since the specificities of the C. elegans lifespan experiments demand us to culture microbes in conditions differing from most of the published literature on E. coli physiology, novel data must be acquired to characterize and make dFBA simulations as realistic as possible. To do this exchange fluxes were measured using quantitative H NMR Time-Resolved Metabolic Footprinting. Furthermore, I also investigate the combination of TReF and dFBA as a tool in microbial metabolism studies. These approaches were tested by comparing wild type E. coli with one of the knockout strains found, ΔmetL, a knockout of the metL gene which encodes a byfunctional enzyme involved in aspartate and threonine metabolism. I found that the strain exhibits a slower growth rate than the wild type. Model simulation results revealed that reduced homoserine and methionine synthesis, as well as impaired sulfur and folate metabolism are the main effects of this knockout and the reasons for the growth deficiency. These results indicate that there are common mechanisms of the lifespan extension between ΔmetL and inhibition of folate biosynthesis and that the flux balance analysis/metabolic footprinting approach can help us understand the nature of these mechanisms.Os organismos modelo Caenorhabditis elegans e E. coli formam um dos modelos mais simples de interacções entre micróbio do tracto digestivo e hospedeiro. Intervenções no micróbio capazes de aumentar a longevidade do hospedeiro, incluindo inibição de síntese de folatos, foram reportadas previamente. Para encontrar novas delecções génicas do micróbio capazes de aumentar a longevidade do hospedeiro, a colecção Keio de deleções génicas de E. coli foi rastreada. Alguns dos genes encontrados participam em processos metabólicos, e nesses casos, o próximpo passo é perceber como as deleções perturbam o metabolismo sistémicamente, para gerar hipóteses. Para isso, utilizo dynamic Flux Balance Analysis (dFBA), uma técnica de modelação metabólica capaz de fazer previsões sobre alterações na distribuição intracelular de fluxos. As especificidades das experiências de tempo de vida em C.elegans obrigam-nos a trabalhar em condições diferentes das usadas na maioria da literatura publicada em fisiologia de E. coli, e para dar o máximo realismo às simulações de dFBA novos dados foram adquiridos, utilizando H NMR Time-Resolved Metabolic Footprinting para medir fluxos de troca de metabolitos entre microorganismo e meio de cultura. A combinação de TReF e dFBA como ferramenta de estudo do metabolism microbiano é também investigada. Estas abordagens foram testadas ao comparar E. coli wild-type com uma das estirpes encontradas no rastreio, ΔmetL, knockout do gene metL, que codifica um enzima bifunctional participante no metabolismo de aspartato e treonina, e que exibe uma taxa de crescimento reduzida comparativamente ao wild-type. Os resultados das simulações revelaram que os principais efeitos da deleção deste gene, e as razões para a menor taxa de crescimento observada, são a produção reduzida de homoserina e metionina e os efeitos que provoca no metabolismo de folatos e enxofre. Estes resultados indicam que há mecanismos comuns na extensão da longevidade causada por esta deleção e inibição de síntese de folatos, e que a combinação metabolic footprinting/flux balance analysis pode ajudar-nos a compreender a natureza desses mecanismos

Isolation, screening and characterization of microorganisms with potential for biofuels production

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Rapid global population growth has increased the demand for food and energy supply. The limited oil reserves, pollution concerns, global warming and political instability and disagreements, lead to an increased financial support for sustainable and environmental sources of energy, biofuels. In the last decades there is an increasing interest in the development of the bioethanol production from lignocellulosic residues, which do not compete directly with food. However, the low efficient conversion of cellulosic biomass to biofuels hinders its success. Alternative substrates are inulin containing plants, as Jerusalem artichoke, representing a renewable and inexpensive raw material for industry and biofuel production. In this work, the main goal was to search for new microorganisms, with high potential to produce bioethanol, due to the presence of better ethanologenic characteristics or ability to produce relevant hydrolytic enzymatic machinery. From the isolation and screening of 98 novel strains, 7 were selected and further characterized. A preliminary identification was performed using FISH. Three isolates which showed inulinase capacity gave a putative identification as Z. bailii strains, and the best (Talf1) was optimized and characterized for inulinase production. Talf1 enzymatic extract presented maximum activity (8.7 U/ml) at 45 ºC and pH 5.5, and high stability at 30ºC. Talf1 isolate was used in a Consolidated Bioprocessing (CBP) and its enzymatic extract in a Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) process, for bioethanol production, obtaining an ethanol yield of 45% and 47% from pure inulin; and a yield of 51% and 48% from Jerusalem artichoke juice, respectively. Four selected isolates from strawberry tree fruit (STF) were used in a fermentation assay using STF juice, producing 86 - 100 g/l of ethanol from this raw material, at a very high yield (47-50%). These results show the enormous potential of inulin and Jerusalem artichoke as substrates for bioethanol production and the application of these novel yeasts as ethanol and/or inulinase producers.A exploração de novos recursos energéticos foi crucial para a revolução tecnológica que ocorreu no início do século 19. Já nesse século se conhecia o enorme potencial do álcool como fonte de energia, visto que o primeiro protótipo de motor de ignição foi desenhado para funcionar com este combustível. No início do século 20, a produção de etanol foi substituída pela gasolina, devido ao baixo custo de extração. Os combustíveis fósseis têm sido, desde então, a principal fonte de energia utilizada. O rápido aumento da população tem intensificado a necessidade do aumento de produção alimentar e energética. As limitadas reservas de petróleo, preocupações ambientais, o aquecimento global e a instabilidade política renovaram o interesse e, consequentemente, o apoio financeiro direcionada para o desenvolvimento de fontes renováveis de energia, como os biocombustíveis. Vários tipos de biocombustíveis têm sido estudados, mas apenas dois são produzidos à escala industrial: o biodiesel e o bioetanol. O bioetanol apresenta as melhores qualidades para a sua utilização nos atuais motores, podendo ser utilizado como aditivo na gasolina, sendo por isso, o biocombustível mais utilizado a nível mundial (Antoni et al., 2007). A produção mundial de bioetanol à escala industrial utiliza principalmente duas fontes naturais: Saccharum officinarum (cana-de-açúcar) e Zea mays L. (milho). A cana-de-açúcar é sobretudo utilizada no Brasil, sendo o segundo maior produtor mundial de bioetanol, enquanto o milho é a principal fonte natural utilizada nos E.U.A., o maior produtor mundial. Estes dois países representam 88% da produção global (REN21). Na produção de bioetanol ocorre a fermentação alcoólica dos substratos naturais, diretamente a partir da cana-de-açúcar (que contém principalmente sacarose); para a bioconversão do milho (composto principalmente por amido) há necessidade de um passo prévio de hidrólise enzimática para a sua conversão em açúcares simples. O bioetanol obtido a partir de culturas agrícolas produzidas exclusivamente para esse fim, ocupando assim área cultivável, denomina-se Bioetanol de 1ª Geração (1G). Este tipo de produção levanta questões morais e éticas porque, deste modo, o bioetanol compete diretamente com a produção alimentar (Luo et al., 2009). Para ultrapassar este problema, tem sido proposto a utilização de resíduos lenhocelulósicos, como substratos, para produção de Bioetanol de 2ª Geração (2G). Este bioetanol não compete diretamente com a produção alimentar, apesar de consumir recursos agroindustriais. Atualmente a conversão de biomassa lenhocelulósica em bioetanol é ainda um procedimento caro e de baixa eficiência, sendo economicamente desfavorável a sua aplicação (Gibbons and Hughes, 2009). O principal obstáculo é o custo do pré-tratamento para conversão dos vários polímeros (celulose, hemicelulose, xilano, etc.) em açucares simples (glucose e xilose principalmente) que esta biomassa necessita, quer seja por degradação enzimática (com custos associados de produção de extratos enzimáticos); quer seja a aplicação de métodos químicos, como hidrólise ácida (que para além do seu custo, leva à produção de composto inibidores do crescimento microbiano). Existem vários bioprocessos propostos para a produção em larga escala de 2G nomeadamente a hidrólise separada da fermentação (SHF), em que o passo de hidrólise da biomassa lenhocelulósica antecede a fase de produção de bioetanol; a fermentação e sacarificação simultâneas (SSF), neste caso há a adição exógena de enzimas ou a co-fermentação de biomassa com um microrganismo produtor das enzimas necessárias à conversão dos polímeros nos seus monómeros, disponibilizando assim os açúcares simples para o microrganismo etanologénico os converter em etanol; e o bioprocesso consolidado (CBP), em que a produção de enzimas para a hidrólise enzimática e a produção de etanol ocorrem por ação do mesmo microrganismo (considerado o melhor processo conceptual) (Lynd, 1996). Infelizmente não está descrito nenhum microrganismo que, simultaneamente, seja capaz de produzir a maquinaria enzimática necessária para a hidrólise da biomassa lenhocelulósica e que a produção de etanol atinja valores de rendimento e produtividade economicamente viáveis. Dadas as dificuldades de implementação à escala industrial do 2G e movidos por preocupações ambientais, de utilização de solos cultiváveis e o desequilíbrio atual no ciclo de carbono, levou alguns cientistas a desenvolver o Bioetanol de 3ª Geração (3G). Este bioetanol recorre a microalgas com elevado conteúdo nutritivo para a sua produção. Ao invés de aproveitar resíduos agroindustriais como substrato, as algas são produzidas explorando os recursos hídricos para a produção de biomassa. Desta forma, não há competição com produção alimentar nem área cultivável e não há utilização de recursos agroindustriais. No entanto, o baixo rendimento de produção de biomassa torna este processo, ainda, economicamente inviável à escala industrial (Goh and Lee, 2010). Uma alternativa a estas opções é a utilização de plantas produtoras de inulina, como Helianthus tuberosus (tupinambo), que representam um recurso renovável, barato e abundante para a produção de bioetanol. O tupinambo tem várias características importantes que justificam a sua utilização, nomeadamente a tolerância a frio, à seca, ao vento e a terrenos arenosos e/ou salinos, com uma alta taxa de fertilidade e de resistência a pestes e doenças, não necessitando obrigatoriamente de terrenos férteis para se desenvolver. Estas características tornam-no numa fonte apetecível de biomassa para conversão em bioetanol que não compete pelos terrenos cultiváveis utilizados para produção alimentar (Neagu and Bahrim, 2011; Chi et al., 2011; Bajpai and Margaritis, 1982). Este trabalho teve como objetivo a procura de novos microrganismos, especialmente leveduras, a partir de isolamentos de diferentes fontes naturais, nomeadamente dos frutos de alfarrobeira (Ceratonia síliqua), ameixeira (Prunus domestica), cerejeira (Prunus avium), figueira (Ficus carica), medronheiro (Arbutus unedo) e pessegueiro (Prunus persica) e tubérculos de tupinambo (Helianthus tuberosus). Os microrganismos foram selecionados com base nas suas características etanologénicas (maior tolerância a elevadas concentrações de etanol, pH e temperatura e, por isso, capazes de fermentações alcoólicas mais longas); e/ou na capacidade de produção de enzimas relevantes, como inulinases, para posterior aplicação em bioprocessos industriais. A partir de 98 isolados, dos quais 90 eram leveduras e 8 bactérias, foram selecionados 7 isolados diferentes. Destes, 3 isolados foram selecionados porque apresentaram capacidade de converter inulina purificada em etanol; os outros 4 isolados foram selecionados porque foram capazes de produzir etanol mais rapidamente, utilizando sumo de medronho como meio completo. Às 7 estirpes foi aplicado um procedimento de identificação preliminar, utilizando sondas marcadas com um fluoróforo, para hibridação de fluorescência in situ (FISH), especificas para várias espécies de leveduras vínicas, nomeadamente: Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces marxianus, Lachancea thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii e Zygosaccharomyces bailii. As 7 estirpes apresentaram um resultado positivo para apenas uma destas sondas, distribuindo-se por três espécies diferentes: Lachancea thermotolerans (AP1), Saccharomyces cerevisiae (DP2 e GluP4) e Zygosaccharomyces bailii (GerP3, Calf2, Talf1 e Talf2). Foi realizado um controlo positivo em cada experiencia de FISH para cada sonda testada, utilizaram-se estirpes identificadas e existentes no laboratório, nomeadamente: CBS 314 (Hanseniaspora uvarum), Kluyveromyces marxianus 516F, CBS 2803 (Lachancea thermotolerans), NRRL Y-987 (Metschnikowia pulcherrima), Saccharomyces cerevisiae CCMI 885, PYCC 4478 (Torulaspora delbrueckii) e Zygosaccharomyces bailii 518F. Foi também utilizada uma sonda universal para células eucariotas (EUK516) em todas as células utilizadas, como controlo positivo, de forma a assegurar a presença de RNA acessível nas células após o procedimento de fixação, essencial na técnica de FISH. Esta identificação preliminar deverá ser validada com técnicas moleculares mais precisas, complementadas com estudos completos de morfologia e fisiologia. Das estirpes preliminarmente identificadas como Z. bailii, três (Calf2, Talf1 e Talf2) apresentaram capacidade de produção de inulinases, uma caraterística não referenciada em estirpes desta espécie (Kurtzman et al., 2011). Foi traçado um perfil metabólico das estirpes, Calf2, Talf1 e Talf2, em confronto com a estirpe Z. bailii 518F utilizando duas galerias API distintas: API ZYM and the API 20C AUX. Conclui-se que as três estirpes têm perfiz metabólicos semelhantes entre si e com Z. bailii 518F, revelando características fisiológicas importantes para aplicação futura. A produção de inulinases é uma característica essencial para a fermentação de inulina em etanol, permitindo a utilização de matérias-primas ricas em inulina como substrato para produção de bioetanol. Com esta finalidade, foi avaliada a produção de inulinases extracelulares das 3 estirpes, utilizando dois substratos indutores: a inulina (extraída de chicória) e o sumo de tupinambo. A estirpe Talf1 apresentou maior atividade enzimática extracelular quando induzida com sumo de tupinambo (8,7 U/ml) do que a estirpe Calf2 e Talf2, que atingiram 4,1 e 7,8 U/ml respetivamente. Utilizando inulina purificada como substrato indutor, todas as estirpes atingiram aproximadamente 0,6 U/ml de atividade enzimática no extrato celular, o que demonstra a fraca capacidade de indução por parte da inulina purificada. De forma a otimizar a produção de inulinases, utilizando a estirpe Talf1, foram testados outros substratos como indutores de inulinases: duas inulinas comerciais, extraídas de fontes naturais diferentes; e três matérias-primas: raízes de acelga, tubérculos de dália e o resíduo sólido de tupinambo, obtido após extração do sumo. Conclui-se que as inulinas comerciais purificadas são fracos indutores, não atingindo valores superiores a 0,6 U/ml, enquanto todas as matérias-primas naturais induziram positivamente a produção de inulinases, obtendo 1,9 U/ml com raízes de acelga, 1,5 U/ml com tubérculos de dália e 5,9 com o resíduo sólido de tupinambo. Concluiu-se que o tupinambo, em particular o sumo, é o melhor substrato indutor, para a produção de inulinases extracelulares utilizando a estirpe Talf1. Foi feita a caracterização bioquímica do extrato enzimático desta estirpe, revelando que a temperatura e o pH ótimos de atividade são 45ºC e 5,5 respetivamente. Foi determinada a estabilidade à temperatura e ao pH; o extrato enzimático manteve 57% da sua atividade inicial ao fim de 24 dias, quando mantido a 30ºC e ao pH natural (5,5). No entanto alterações de pH diminuem drasticamente a estabilidade do extrato (a 30 ºC). As características do extrato enzimático da estirpe Talf1 são promissoras para a sua posterior utilização em bioprocessos que utilizem inulina ou fontes ricas em inulina como substrato desde que ocorram a pH ácido (aproximadamente 5,5) e à temperatura de 30ºC. Dadas as características descritas, a estirpe Talf1 foi utilizada num bioprocesso consolidado (CBP) e o respetivo extrato enzimático utilizado num processo de fermentação e sacarificação simultâneas (SSF) para produção de bioetanol. Para o processo SSF foi utilizada a estirpe etanologénica S. cerevisiae CCMI 885 e o meio foi suplementado com o extrato enzimático produzido por Talf1. Na utilização de inulina como única fonte de carbono, o processo SSF apresentou maior rendimento e produtividade máximos de etanol (47% e 2,75 g.l-1.h-1) e obteve-se maior concentração de etanol no meio (78 g/l), enquanto no processo CBP produziram-se 67 g/l de etanol, com um rendimento e produtividade máximos de 45% e 1,70 g.l-1.h-1 respetivamente. Foi realizado, em paralelo, um crescimento controlo com S. cerevisiae CCMI 885 e inulina como única fonte de carbono. Nestas condições, foram produzidas apenas 50 g/l de etanol, o que demonstra que a adição do extrato enzimático levou à hidrólise de polímeros de inulina que não são utilizados naturalmente por S. cerevisiae, apesar desta estirpe conseguir produzir enzimas que degradam parcialmente polímeros de inulina. A produção de bioetanol a partir diretamente de sumo de tupinambo foi testada pelos dois bioprocessos (SSF e CBP). Neste caso obtiveram-se melhores resultados utilizando a levedura Talf1 no bioprocesso consolidado. A estirpe Talf1 atingiu melhor produtividade (3,62 g.l-1.h-1,), rendimento (51%) e concentração máximas de etanol (67 g/l), do que a estirpe S. cerevisiae CCMI 885 em sumo de tupinambo (SSF), suplementado com o extrato enzimático contendo inulinases, que produziu 62 g/l de etanol, com um rendimento e produtividade máximos de 48% e 2,40 g.l-1.h-1, respetivamente. No ensaio controlo, utilizando a levedura S. cerevisiae CCMI 885 sem adição de qualquer enzima, obtiveram-se menores resultados de rendimento e produtividade máxima (42% e 2,07 g.l-1.h-1) e apenas 55 g/l de etanol produzido, um valor inferior aos resultados obtidos com os anteriores bioprocessos. Estes resultados são consistentes com os obtidos apenas com inulina como fonte de carbono, reforçando a hipótese de que esta estirpe, S. cerevisiae CCMI 885, seja capaz de hidrolisar algumas cadeias de inulina, mas não utilizar todos os açúcares presentes no sumo de tupinambo. Estes resultados mostram o potencial da inulina e fontes naturais ricas em inulina, como o tupinambo, para fontes alternativas na produção de bioetanol. No entanto para a aplicação industrial das estirpes descritas neste trabalho, será necessária posterior otimização de todo o processo. As 4 leveduras selecionadas a partir do rastreio inicial de fermentação de sumo de medronho (L. thermotolerans AP1, S. cerevisiae DP2, S. cerevisiae GluP4 e Z. bailii GerP3), foram utilizadas num ensaio de fermentação de sumo de medronho, em comparação com S. cerevisiae CCMI 885. O melhor resultado foi obtido com a estirpe S. cerevisiae CCMI 885, atingindo-se 108 g/l de etanol, com um rendimento máximo de 51%, igual ao teórico possível, e uma produtividade máxima de 1,29 g.l-1.h-1. No entanto, a estirpe de Z. bailii GerP3, com valores máximos de etanol, produtividade e rendimento máximos de 100 g/l, 1,11 g.l-1.h-1 e 50%, respetivamente, são próximos daqueles obtidos com a levedura S. cerevisiae. A estirpe Z. bailii GerP3 obteve, por isso, os resultados mais promissores para a aplicação num sistema de fermentação em estado sólido diretamente a partir de medronho. O desenvolvimento de um processo eficiente e economicamente viável para produção de bioetanol é crucial para a sociedade atual, servindo como alternativa à utilização de combustíveis fósseis, para uma população mundial que requer cada vez mais energia. A utilização de fontes naturais como o tupinambo e o medronho, para a produção de bioetanol, pode ajudar a reduzir a dependência energética dos combustíveis fósseis. No entanto, para produzir industrialmente bioetanol a partir destas fontes naturais renováveis, e ainda necessária a otimização do processo a escala industrial

A Multi-Conjugate Adaptive Optics view of Bulge Globular Clusters

The Galactic bulge is one of the most massive and inaccessible regions of the Galaxy, where thick clouds of dust along the line of sight almost totally absorb the optical light. Bulge globular clusters (GCs) are useful tools to constrain the properties of this system, as they share the same kinematics and chemical composition with bulge field stars. However, these systems have been widely excluded from large surveys due to the huge extinction, and they remain in many cases only poorly known so far. The aim of this Thesis is to contribute to fill this gap by studying the stellar populations and structural parameters of bulge GCs by means of state-of- the-art high resolution near-infrared (NIR) instruments. We exploited the capabilities offered by the Multi-Conjugate Adaptive Optics system GeMS combined with the GSAOI imager at the Gemini South Telescope, in Chile. We mainly focused on two extreme cases. The first is Liller 1, one of the most obscured and therefore least studied systems in the Galaxy. It probe the benefit of using an Adaptive Optics system on an 8 meter telescope. The second is NGC 6624, which is well-studied and therefore allows a detailed comparison and assessment of the GeMS+GSAOI performance. Based on these data we performed an in-depth characterization of the instruments in terms of Point Spread Function modeling, Strehl Ratio and Encircled Energy distribution variations within the field of view. We derived also the first analytic solution to correct the geometric distortions of this system. Taking advantage of the exquisite quality and depth of the NGC 6624 images, in combination with deep HST NIR observations of 47 Tucanae, we performed a detailed analysis aimed at probing reliability and limits of the so-called "MS-knee" as a tool to derive accurate absolute ages in NIR CMDs of GC

GPU ACCELERATION OF THE ISO–7 NUCLEAR REACTION NETWORK USING OPENCL

We looked at the potential performance increases available through OpenCL and its parallel computing capabilities, including GPU computing as it applies to time inte- gration of nuclear reaction networks. The particular method chosen in this work was the trapezoidal BDF-2 method using Picard iteration, which is a non-linear second order method. Nuclear reaction network integration by itself is a sequential process and not easily accelerated via parallel computation. However, in tackling a problem like modeling supernova dynamics, a spatial discretization of the volume of the star necessary, and in many cases is combined with the computational technique of oper- ator splitting. Every spatial cell would have its own reaction network independent of the others, which is where the parallel computation would prove useful. The partic- ular reaction network analyzed is called the iso–7 reaction network that looks at the dynamics of 7 of the more dominant nuclides in supernovae. The computational per- formance was compared between the CPU and the GPU, in which the GPU showed performance increases of up to 8 times. This increase was realized on the small–scale, because the computations were limited to running on a single device at any given time. However, these performance gains would only increase as the problem size was scaled up to the large–scale

Calculating Highly Oscillatory Integrals by Quadrature Methods

Highly oscillatory integrals of the form $I(f)=\int_{0}^{\infty} dx f(x) e^{i \omega g(x)}$ arise in various problems in dynamics, image analysis, optics, and other fields of physics and mathematics. Conventional approximation methods for such highly oscillatory integrals tend to give huge errors as frequency ($\omega$) $\rightarrow \infty$. Over years, various attempts have been made to get over this flaw by considering alternative quadrature methods for integration. One such method was developed by Filon in 1928, which Iserles {\it et al.\ }have recently extended. Using this method, Iserles {\it et al.\ }show that as $\omega \rightarrow \infty$, the error decreases further as the error is inversely proportional to $\omega$. We use methods developed by Iserles' group, along with others like Newton-Cotes, Clenshaw-Curtis and Levin's methods with the aid of {\it Mathematica}. Our aim is to find a systematic way of calculating highly oscillatory integrals. In particular, our focus is on the oscillatory integrals that came up in earlier study of vacuum energy by Dr. Stephen Fulling

Characterization of colon cancer stem cells and their response to treatment with extracts of medical plants

Il cancro del colon-retto è una delle neoplasie più frequenti, ad alto tasso di mortalità, causato dall’interazione di fattori genetici e ambientali. Parallelamente al modello stocastico, secondo il quale tutte le cellule tumorali (CT) hanno una stessa probabilità di rigenerare un tumore, sta prendendo piede il modello che vede solamente in un piccolissimo sottogruppo di cellule staminali tumorali (CST) la capacità di dar luogo e sostenere la crescita tumorale. Dalla letteratura si evince come le CST mostrino deregolazioni a carico di geni implicati in: chemio-resistenza, transizione epitelio-mesenchimale (EMT), auto-rinnovamento incontrollato, processi peculiari delle CST, che favoriscono l’insorgenza di un fenotipo tumorale. Lo scopo del progetto di Dottorato è stato quello di isolare e caratterizzare le CST sia da linee cellulari tumorali che da biopsie di tumore al colon-retto, per identificare marcatori tumorali utili a delineare le fasi di progressione del tumore e di individuare potenziali bersagli terapeutici. Inoltre, ho sottoposto le CT e le CST di una linea di adenocarcinoma del colon-retto (HCA7), a trattamento con l’estratto naturale di T. cordifolia, pianta utilizzata della medicina Ayurvedica, ed uno dei suoi principi attivi, la berberina, allo scopo di verificarne l'efficacia antitumorale. Ho osservato importanti deregolazioni nelle popolazioni cellulari trattate, a carico di diversi geni coinvolti principalmente nella EMT, nella regolazione del ciclo cellulare e della apoptosi e nel favorire un fenotipo chemio-resistente. I livelli di espressione di questi geni sono risultati essere significativamente sotto-espressi, sia nelle CT trattate che nelle CST trattate. I risultati che ho ottenuto depongono a favore di un potenziale ruolo attivo della sostanza naturale sottoposta ad indagine, nel contrastare molti di quei processi fondamentali per lo sviluppo di un fenotipo tumorale. Inoltre, i miei dati avvallano anche l’ipotesi che vede le CST come potenziali bersagli terapeutici, per ottenere un effetto mirato su questa popolazione cellulare tumorale.Colorectal cancer is one of the most frequent cancer, with a high mortality rate, caused by the interaction of genetic and environmental factors. Parallel to the stochastic model, according to which all tumor cells (CT) have the same probability of regenerating a tumor, there is a new model that look in a very small subset of cancer stem cells (CST) the responsible of tumor growth. In the literature, CSTs shows important deregulations on genes implicated in: chemo-resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), uncontrolled self-renewal, peculiar processes of this small subpopulation, which favor the onset of a tumor phenotype . The aim of my PhD project was to isolate and characterize CSTs both from tumor cell lines and from colorectal cancer biopsies, in order to identify tumor markers useful for delineating the phases of tumor progression and identifying potential therapeutic targets. In addition, I treated the CT and CST of a line of colorectal adenocarcinoma (HCA7) with the natural extract of T. cordifolia, a plant used in Ayurvedic medicine, and one of its active ingredients, berberine, in order to verify its antitumor efficacy. I observed important deregulations in treated cell populations, dependent on several genes involved mainly in EMT, in cell cycle regulation and apoptosis, but also in promoting a chemo-resistant phenotype. The expression levels of these genes were found to be significantly under-expressed, both in the treated CTs and in the treated CSTs. The results I have obtained are in favor of a potential active role of the investigated natural substance, in countering many of those fundamental processes for the development of a tumor phenotype. Furthermore, my data also support the hypothesis that CSTs are potential therapeutic targets for the purpose of achieving a targeted effect on this cell tumor population

The use of ferroelectrics and dipeptides as insulators in organic field-effect transistor devices

Dissertation supervisor: Dr. Suchi Guha.Includes vita.While the electrical transport characteristics of organic electronic devices are generally inferior to their inorganic counterparts, organic materials offer many advantages over inorganics. The materials used in organic devices can often be deposited using cheap and simple processing techniques such as spincoating, inkjet printing, or roll-to-roll processing; allow for large-scale, flexible devices; and can have the added benefits of being transparent or biodegradable. In this manuscript, we examine the role of solvents in the performance of pentacene-based devices using the ferroelectric copolymer polyvinylidene fluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFe) as a gate insulating layer. High dipole moment solvents, such as dimethyl sulfoxide, used to dissolve the copolymer for spincoating increase the charge carrier mobility in field-effect transistors (FETs) by nearly an order of magnitude as compared to lower dipole moment solvents. The polarization in Al/PVDF-TrFe/Au metal-ferroelectric-metal devices also shows an increase in remnant polarization of ~20% in the sample using dimethyl sulfoxide as the solvent for the ferroelectric. Interestingly, at low applied electric fields of ~100 MV/m a remnant polarization is seen in the high dipole moment device that is nearly 3.5 times larger than the value observed in the lower dipole moment samples, suggesting that the degree of dipolar order is higher at low operating voltages for the high dipole moment device. This work shows that the performance of electronic devices can be improved simply by selection of fabrication materials, potentially opening up simpler fabrication processes for large scale manufacturing of organic electronics. We will also discuss the use of peptide-based nanostructures derived from natural amino acids as building blocks for biocompatible devices. These peptides can be used in a bottom-up process without the need for expensive lithography. Thin films of L,L-diphenylalanine micro/nanostructures (FF-MNSs) were used as the dielectric layer in pentacene-based FETs and metalinsulator-semiconductor diodes both in bottom-gate and top-gate structures. It is demonstrated that the FFMNSs can be functionalized for detection of enzyme-analyte interactions. This work opens up a novel and facile route towards scalable organic electronics using peptide nanostructures as scaffolding and as a platform for biosensing.Includes bibliographical references (pages 123-129)

Calcium increases Porphyromonas gingivalis biofilm formation

Orientador: Rafael Nobrega StippDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: A periodontite crônica é uma doença multifatorial causada por microorganismos, como Porphyromonas gingivalis, que afetam os tecidos de suporte dos dentes. Há poucas informações sobre as substâncias que poderiam influenciar na formação de biofilme. Por isso, o objetivo desse estudo foi avaliar a influência de proteínas, aminoácidos, elementos metálicos e vitaminas na formação do biofilme de P. gingivalis. O biofilme e a bactéria no estado planctônico foram cultivadas com e sem aditivos sob atmosfera anaeróbica a 37 ºC durante 18 horas. A biomassa total foi quantificada por ensaio colorimétrico e a estrutura 3D dos biofilmes foi caracterizada por microscopia confocal de varredura a laser. O ensaio de Arsenazo foi usado para quantificar a presença Ca+2 livre nas culturas. Um quelante extracelular foi utilizado para verificar se os reagentes testados demostram aumento do biofilme. Entre as substâncias testadas o único tratamento que resultou em um aumento significativo (p <0,001 Kruscal Wallis) na formação de biofilme foi o cálcio, quando as placas foram tratadas com, pelo menos, 0,8 mg de CaCl2/ cm2. A perda da adesão bacteriana ocorreu quando um quelante foi adicionado ao meio de cultura. Os resultados sugerem que o cálcio aumenta a formação de biofilme em P. gingivalis sem afetar o crescimento planctônico e isso pode estar relacionado com fases iniciais do desenvolvimento do biofilmeAbstract: Chronic periodontitis is caused by microorganisms such as Porphyromonas gingivalis and affects the supporting tissues of the teeth. There is few information about substances which could influence biofilm formation of this bacterium. This study aim to evaluate the influence of proteins, amino acids, metallic elements, and vitamins on P. gingivalis biofilm formation. Biofilms were grown under anaerobic atmosphere at 37 ºC for 18 hours. A colorimetry assay (safranin) was carried out to verify the ability of the bacterium to form biofilm. A Confocal microscope was used to characterize the size and structure of the biofilm. An extracellular chelator was used to verify the effect of the test reagent showing the highest values on biofilm formation. Among the substances tested only Calcium treatment resulted in a significant increase (p < 0.05) of biofilm formation when plates were treated with at least 0.8 mg of CaCl2/cm2. Bacterial attachment loss occurred when a chelator was added. The findings suggest that Ca+2 could increase the biofilm formation. It might be related to the surface bacterial attachment and initial stages of the biofilm developmentMestradoMicrobiologia e ImunologiaMestre em Biologia Buco-DentalCAPE

Reservoir Characterization and Modeling of Potash Mine Injection Wells in Saskatchewan

In the Saskatchewan potash mining industry vast quantities of brine wastewater are generated from potash processing and mine inflow water. As treatment of such waste is prohibitively expensive, disposal in deep saline aquifers is the only readily available option. However, the effects that such injection activities have on the subsurface conditions of the targeted aquifers are not well known. Additionally, the reservoir characteristics of the targeted aquifers are not well understood. The aim of my dissertation is to provide a large scale reservoir characterization study to the aquifers used for subsurface waste disposal at the potash mines in Saskatchewan, the basal clastics and the Interlake Group. The second aim of this research is to use the data from the reservoir characterization study to build analytical models of the injection wells in order to study the effects that such injection activities have had on the targeted aquifers. Characterizing deep aquifers such as the basal clastics and the Interlake Group is often difficult due to limited subsurface information available at great depths. In this investigation, available information from oil and gas exploration and development, such as geophysical logs, drill stem tests and core analysis provided valuable information on the subsurface distribution and rock characteristics (permeability) of these formations. This information allowed for a better understanding of the factors that have led to the success of injection activities at the potash mine sites and will assist future projects targeting fluid injection in the basal clastics and the Interlake Group. Through this analysis, it was found that there are great differences in the permeabilities both spatially and with respect to lithology in these aquifers, with permeability values in the Winnipeg Formation between 10-18.1-10-11.8 m2 and 10-15.9-10-11.6 m2 in the Deadwood Formation and 10-16.0-10-11.5 in the Interlake Group obtained from the various methods of analysis. Through the information gained through the reservoir characterization study, analytical models were generated in Aqtesolv (HydroSOLVE Inc. 2016) in order to simulate the reservoir response to the injection activities. History-matching was conducted in order to generate models with simulation outputs that most closely matched the falloff test pressure data. The calibrated history-matched models were able to provide insights into the pressure response as well as the extent of the pressure propagations in the aquifers. It was found some of the potash mine sites have generated significantly higher pressure responses than others and that the injection rates and aquifer permeability played a significant role in the pressure response at each mine site

Effect of organic soil amendments on carbon dynamics and productivity in saline and non-saline soils from Saskatchewan and Nigeria

Carbon storage in salt affected and low organic matter (<3%) soils may be enhanced through the use of high carbon content soil amendments along with growing salt-adapted crops. To investigate and compare carbon dynamics in low organic matter, saline and non-saline soils, a field experiment was established in the Brown soil zone in southern Saskatchewan in the spring of 2017 to assess effects of three added amendments (leonardite, humic acid, and composted steer manure) and three crops seeded that spring (AC Saltlander green wheatgrass, Invigor canola and Tully Champion willow) on total soil organic carbon, carbon fractions and crop growth via randomized complete block design (RCBD) experiments conducted in saline and non-saline areas of a farm field. The soil samples collected in the spring of 2017 prior to establishment of treatments revealed similar organic carbon levels of 1.47% and 1.23% in the saline and non-saline sites, respectively. Soil samples taken in the fall of 2017 and spring of 2018 revealed that soils from the saline site amended with leonardite had significantly more light fraction organic carbon compared to unamended control plots. Furthermore, the total soil organic carbon mass in the 0-10 cm depth was significantly greater by 23% and 16% in the leonardite amended treatment compared to all other treatments in the non-saline and saline soils, respectively. The green wheatgrass had the largest impact on soil carbon fractions measured, increasing the concentration of water extractable organic carbon by 15mg C kg⁻¹ in the plots at the saline site. After one year, the total soil organic carbon in the 0-10 cm depth in the non-saline site treatments seeded to green wheatgrass was significantly higher than that found under canola and willow. Biomass production in the 2017 growing season was less on the saline than the non-saline soil, and the organic amendments did not significantly increase growth of any of the crops. To better understand the effect of the three amendments on short-term carbon turnover, a 29-day microbial respiration experiment was conducted using soils collected within 10 m of the two field sites. A low organic matter (0.61%) degraded tropical soil collected from an agricultural field in Ogbomosho, Nigeria was included in the incubation for comparison purposes. The saline soil had significantly higher cumulative CO2-C production compared to the non-saline and Nigerian soil, but organic amendment treatment had no influence on CO2-C production in the saline soil itself. In the non-saline and Ogbomosho soil, the composted steer manure produced significantly greater cumulative CO2-C emissions compared to the control and leonardite and humic acid treatments, respectively. The results suggest saline soils from southern Saskatchewan may not be lower in soil organic carbon content than non-saline comparable, and that under ideal moisture conditions, short-term carbon dioxide release through microbial respiration may be the same or higher than in non-saline soils due to an abundance of labile soluble organic carbon. Seeding saline and non-saline areas to salt tolerant green wheatgrass and applying 10 tonnes ha-1 of a high carbon content amendment like leonardite appears to be a relatively effective means of increasing the soil organic carbon content of the surface soil over a short time period