Structure and Functional Study on HigBA from Streptococcus pneumoniae

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 약학대학 약학과, 2017. 8. 이봉진.Streptococcus pneumoniae is a gram-positive strain that causes diseases mainly through respiratory infections. Diseases caused by pneumococcal species are meningitis, bacteremia, pneumonia, otitis and sinusitis. Patients infected with s.pneumonia have developed antibiotic resistant strains, so new antibiotics need to be developed. Ultimately, developing novel antibiotic candidates through structural analysis and functional studies of proteins is a major goal. The target TA complex protein present in the s.pneumoniae TIGR4 strain is a type II toxin-antitoxin system and is classified under HigBA family. The toxin protein HigB is predicted to be a ribosome-dependent mRNA interferases, which cleave mRNAs at the ribosomal A site. The antitoxin protein HigA regulates transcription through binding of palindromic sequence to its operator region. In order to obtain the tertiary structure of the protein, the target protein was obtained by recombinant process and was over-expressed in Rosetta (DE3) pLysS of escherichia coli. Affinity chromatography was used to purify the hexa-histidine tagged protein. Further, higher purity of target protein was obtained by ion-exchange chromatography and size-exclusion chromatography. The structure of target protein was obtained using X-ray crystallography techniques.I. Introduction ····························································· 1 1.1. Streptococcus pneumoniae ···································· 1 1.2. Toxin-Antitoxin system ·········································· 2 1.3. HigBA family in type II TA system ··············· 3 1.4. Purpose of Study ························································ 4 II. Materials and Methods ····································· 5 2.1. Materials ········································································· 5 2.1.1. Reagents ············································································5 2.1.2. Apparatus ··········································································5 2.2. Methods ··········································································· 6 2.2.1. Gene cloning ·····································································6 2.2.2. Over-expression and purification ································7 2.2.3. Crystallization ···································································8 2.2.4. X-ray data collection and structure determination ···············································8 2.2.5. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) ······· 9 2.2.6. Ribonuclease activity assay ··········································9 III. Results ·································································· 11 3.1. Over-expression and purification ······················ 11 3.1.1. Over expression ·······························································11 3.1.2. Purification ········································································12 3.1.2.1. Affinity chromatography ········································12 3.1.2.2. Ion exchange chromatography ······························12 3.1.2.3. Size exclusion chromatography ····························13 3.2. Crystallization ····························································· 14 3.3. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) ····························································· 15 3.4. I n vitro ribonuclease activity assay ················· 17 V. Discussion ····························································· 19 VI. References ··························································· 23 국문초록 ········································································ 28Maste

Streptococcus pneumoniae와 Klebsiella pneumoniae에서 유래한 두가지 toxin-antitoxin system 단백질의 구조적, 기능적 연구

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 약학대학 약학과, 2021.8. 이봉진.Toxin–antitoxin (TA) systems regulate key cellular functions in bacteria. TA systems are promising drug targets because they are related to the survival of bacterial pathogens. Here, I report a unique structure of the Streptococcus pneumoniae HigBA system and a novel antimicrobial agent that activates HigB toxin, which results in mRNA degradation as an antibacterial strategy. Protein structure-based peptides were designed and successfully penetrated the S. pneumoniae cell membrane and exerted bactericidal activity. This discovery is a remarkable milestone in the treatment of antibiotic-resistant S. pneumoniae, and the mechanism of bactericidal activity is completely different from those of current antibiotics. Furthermore, I found that the HigBA complex shows a crossed-scissor interface with two intermolecular β-sheets at both the N and C terminus of the HigA antitoxin. My biochemical and structural studies provide valuable information regarding the transcriptional regulation mechanisms associated with the structural variability of HigAs. My in vivo study also revealed the potential catalytic residues of HigB and their functional relationships. In addition, toxin-mimicking or antitoxin mimicking peptides were designed to disrupt HigBA complex and thereby release toxin, providing an approach to development of new conceptional antibiotics. Overall, my results provide insights into the molecular basis of HigBA TA systems in S. pneumoniae, which can be applied for the development of new antibacterial strategies. Klebsiella pneumoniae is one of the most critical opportunistic pathogens. However, structural information on TA systems in K. pneumoniae remains lacking; therefore, it is necessary to explore this information for the development of antibacterial agents. Here, the first crystal structure of the VapBC complex from K. pneumoniae was presented at a resolution of 2.00 Å. I identified the toxin inhibitory mechanism of the VapB antitoxin through a Mg2+ switch, in which Mg2+ is displaced by R79 of VapB. This inhibitory mechanism at the active site is unique among the TA systems identified in bacteria. Furthermore, inhibitors, including peptides and small molecules, that activate the VapC toxin were discovered and investigated. These inhibitors can act as antimicrobial agents by disrupting the VapBC complex and activating VapC. My comprehensive investigation on the K. pneumoniae VapBC system will help to elucidate an unsolved information in VapBC systems and develop potential antimicrobial agents.독소-항독소(TA) 시스템은 박테리아내에서 주요한 세포 기능을 조절한다. 이번 연구를 통하여 폐렴 연쇄상구균에서 유래한 HigBA 계열 단백질의 3차원 구조를 밝히고 또한 HigB 독소를 활성화 시키면서 mRNA의 분해를 촉진하여 박테리아를 사멸할 수 있는 새로운 기전의 항생물질을 발굴하게 되었다. 단백질의 3차원 구조를 기반으로 펩타이드가 설계되었고 폐렴 연쇄상구균의 세포막을 침투하여 박테리아를 사멸하는데 성공하였다. 이번 발견은 항생제에 내성이 있는 폐렴 연쇄상구균의 치료에서 주목할 만한 이정표이며, 박테리아의 사멸 기전은 기존의 항생제와는 완전히 다르다. 또한 HigBA 복합체는 HigA 항독소의 N말단과 C말단에 존재하는 두개의 분자 간 β-평면 구조를 통하여 교차-가위 인터페이스를 보인다는 것을 발견하였다. 우리의 생화학 및 구조 연구는 HigA 항독소의 구조적 변동성과 관련된 전사 조절 기전의 관한 정보를 제공했다. 또한 HigB 독소의 촉매 활성과 관련 된 잔기들 및 그들의 기능 관계를 in vivo 실험을 통하여 밝혀냈다. 또한, HigBA 복합체를 교란시켜 독소를 방출하는 독소 모방 또는 항독소 모방 펩타이드가 고안되어 새로운 개념 항생제 개발에 대한 접근 방법을 제공하였다. 결론적으로 HigBA 복합체에 관한 구조적인 분석은 새로운 항생제 개발 전략에 발판을 마련해 주었다. 폐렴간균은 가장 중요한 기회감염균 중 하나이다. TA 시스템은 병원성 박테리아의 생존과 관련이 있기 때문에 유망한 약물 타겟이다. 그러나 현재 폐렴간균의 TA 시스템에 대한 구조적 정보는 여전히 부족하다. 따라서 항생제 개발을 위해 이에 관한 정보를 연구할 필요가 있다. 이번 연구를 통하여 우리는 2.00 Å의 해상도로 폐렴간균에서 유래한 VapBC 복합체의 첫 번째 결정 구조를 제시하게 되었다. 우리는 Mg2+ 스위치를 통해 VapB 항독소의 독소 억제 메커니즘을 규명하게 되었고 이 스위치에서 Mg2+는 VapB의 R79에 의해 변위 되는 것을 확인할 수 있었다. VapC 독소의 활성 부위의 관한 이러한 억제 메커니즘은 박테리아의 TA 시스템에서의 최초의 발견이다. 또한 VapC 독소를 활성화하는 펩타이드와 소분자 화합물을 포함한 억제제가 발견 되었다. 이러한 억제제는 VapBC 복합체를 교란시키고 VapC독소를 활성화함으로써 항생제의 역할을 할 수 있다. 폐렴간균 유래의 VapBC 시스템에 대한 이번 연구결과는 VapBC 시스템의 미해결 난제를 설명하고 잠재적인 항생제를 개발하는 데 도움이 될 것이다.General introduction 1 Chapter 1. Structure-based design of peptides that trigger Streptococcus pneumoniae cell death 6 1.1 Introduction 6 1.2 Experimental procedure 7 1.2.1 Cloning, Mutation, Expression and Purification 7 1.2.2 Crystallization, X-Ray Data Collection and Structure Determination 11 1.2.3 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) Measurements 14 1.2.4 NMR Spectroscopy and NMR Titration Experiment 15 1.2.5 In Silico HigBA-DNA Docking 16 1.2.6 In Vitro Ribonuclease Assay 17 1.2.7 Kill-and-Rescue Assay 17 1.2.8 Circular Dichroism Spectroscopy 17 1.2.9 Designed peptides Adding to the HigBA Complex and Antimicrobial Activity Test 18 1.2.10 In Vivo Cell Growth Assay 19 1.2.11 Generation of S. pneumoniae D39 Containing Mutated HigBA 20 1.2.12 Flow Cytometry and Confocal Microscopy 20 1.3 Results 21 1.3.1 Overall Structure of the HigBA Complex 21 1.3.2 Structural comparison of HigBA Structures 25 1.3.3 DNA-Binding Properties of HigBA 28 1.3.4 Active Site of HigB Deduced from Homologs 35 1.3.5 Intermolecular Interaction of HigBA 37 1.3.6 Ribonuclease Activities of HigB and Its Mutants 38 1.3.7 HigBA Complex Disruption by Mimicking Peptide 42 1.3.8 Artificial Activation of Toxin by Designed Peptides Can Exert Bactericidal Effects In Vivo 43 1.4 Discussion 46 1.4.1 Insights into the Transcription Regulation Mechanism of the HigBA System 46 1.4.2 Application of Structural Studies to the Catalytic Mechanism of HigB 47 1.4.3 HigBA Peptide Derivatives Are Promising New Antimicrobial Agents 49 1.5 Conclusion 51 Chapter 2. Structural and functional study of the Klebsiella pneumoniae VapBC toxin−antitoxin system, including the development of a substance that activates VapC 53 2.1 Introduction 53 2.2 Experimental procedure 55 2.2.1 Cloning, protein purification and mutation 55 2.2.2 Crystallization, data collection and processing 58 2.2.3 In vitro RNase assay for VapC and VapC mutants 60 2.2.4 Complex disruption assay by the peptides mimicking the VapBC interface 61 2.2.5 Structure-based pharmacophore generation and molecular docking 62 2.2.6 Assay for complex disruption of small molecules that occlude the interface pocket 63 2.2.7 Growth assay and colony forming unit measurement 64 2.2.8 Isothermal titration calorimetry 64 2.3 Results 65 2.3.1 Overall information on the VapBC complex 65 2.3.2 Structural insights into K. pneumoniae VapBC compared with its homologs 67 2.3.3 RNase activity of VapC and unveiling the inhibition mechanism of VapB 71 2.3.4 Exploration of peptides that activate VapC by disrupting the interface between VapB and VapC 73 2.3.5 Exploration of small molecules that activate VapC by occluding the interface pocket 76 2.3.6 Insights based on binding affinity 79 2.4 Discussion 82 2.4.1 Insight into the tertiary structure of K. pneumoniae VapBC complex 82 2.4.2 Insight into the mechanism of the in vitro ribonuclease activity of VapC 84 2.4.3 Insight into artificial toxin activation using small molecules and peptides 85 2.5 Conclusion 88 References 89 국문초록 104박

Partially implicit method for chemically reacting flow computations

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :항공우주공학과,2001.Docto

동아프리카 열곡대의 지각 속도구조 :

Thesis(masters) --서울대학교 대학원 :지구환경과학부,2009.2.Maste

財務時計列模型에 의한 株式收益率 豫測能力에 대한 實證 硏究 : ARIMA, GARCH, VAR, ECM을 中心으로

학위논문(석사)--서울大學校 大學院 :經營學科 經營學專攻,1996.Maste

정보스시템의 활용성과에 영향을 미치는 요인에 대한 실증적 연구

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 경영학과, 2012. 2. 안중호.다수의 조직들이 정보시스템의 도입 및 개발에는 많은 관심을 보이지만, 상대적으로 그 시스템을 사용하는 사용자들의 정서적 요인에는 관심도가 낮은 편이다. 조직에서 도입한 정보시스템의 품질과 그 조직이 수행하는 과업과의 불일치로 정보시스템의 활용성과가 낮은 경우도 있지만, 정보시스템을 사용하는 조직 구성원들의 정서적 요인으로 인하여 정보시스템을 제대로 사용하지 못함으로써 조직에서 도입한 정보시스템의 활용성과가 낮은 경우가 많을 것으로 판단된다. 그러므로 정보시스템의 활용에 영향을 미치는 조직 구성원의 정서적 요인에 지속적으로 관심을 가지고 어떤 개인적 요인이 정보시스템의 성공적인 활용에 영향을 미치는지 엄밀히 평가할 필요가 있다. 이러한 점에 착안하여 본 연구에서는 정보시스템의 활용성과를 조직 구성원의 정서적 요인관점에서 살펴보고자 하였으며, 선행연구를 바탕으로 정보시스템을 활용한 업무환경에서 조직 구성원의 정서적 특성 요인이 사용자 만족과 업무성과에 미치는 영향 관계를 실증적으로 검증하고자 하였다. 선행연구들을 토대로 조직 구성원의 정서적 특성 요인들을 발굴하였으며, 군 조직의 업무환경에 적합한 정보시스템 성공모형과 기술수용모델을 적용하여 본 연구의 모형을 개발하였다. 본 연구에서는 연구 모형의 변수들을 토대로 정보시스템을 활용한 업무환경에서 조직 구성원들의 정서적 요인(유희성, 불안감)이 사용자 만족과 개인의 업무성과에 영향을 미칠 것이라고 가정하였다. 본 연구를 위하여 군조직(공군)을 대상으로 표본을 수집하였으며, 수집된 설문지를 토대로 PLS 프로그램을 활용하여 측정모형 및 구조모형에 대한 분석을 실시하였다. 본 연구를 통하여 얻어진 결과는 다음과 같다. 첫째, 사용자들이 인지하는 시스템의 품질과 사용자의 정서적 요인(유희성, 불안감)간에 유의한 결과가 나타났다. 또한, 사용자에 의해 인지된 시스템 품질과 사용자 만족 및 인지된 업무성과간의 관계에 있어 사용자의 정서적 요인의 부분 매개효과를 확인할 수 있었다. 둘째, 시스템 유희성과 시스템 불안감은 시스템 사용에 대한 사용자의 만족과 시스템을 사용함으로써 개인이 느끼는 업무 성과에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 셋째, 시스템 사용에 대한 만족이 개인의 업무성과에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.Maste

구형 연소기 내의 음향 간섭에 의한 연소 불안정

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :항공우주공학과,1995.Maste

백색광 위상 천이 간섭계에서 두 대의 카메라를 이용한 위상 오차 보정

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 기계항공공학부, 2014. 2. 박희재.백색광 위상 천이 간섭계에서 두 대의 카메라를 이용한 위상 오차 보정 본 논문에서는 백색광 위상 천이 간섭계에서의 위상 오차에 의한 왜곡을 최소화하기 위한 연구를 수행하였다. 간섭계에서는 이송 기구물의 비선형 이송 및 광원의 중심 파장에 따른 이상적인 위상 이송 간격과 실제 이송 간격 간의 차이로 인한 선형 위상 오차, 기계 진동에 의한 위상 오차 등이 발생하며, 간섭계에 의해 복원된 3차원 형상을 왜곡하게 된다. 위상 오차를 검출하고 이를 이용하여 측정 결과를 개선하는 기존 연구들은 불연속 구간을 가지고 있는 측정 대상물에 진동 등의 왜란이 유입될 경우에는 적용이 불가능하였다. 본 논문에서는 백색광 위상 천이 간섭계에 밴드 패스 필터와 카메라를 추가한 2C-WLPSI(2 Camera White Light Phase Shifting Interferometer)를 제안하여 연속적인 영역 평균 위상 오차를 추가로 검출하도록 하였다. 그리고 이를 이용하여 기존 연구들이 해결하지 못 한, 불연속 구간을 가지고 있는 측정 대상물에 유입되는 위상 오차를 보정하는 방안을 제시하였다. 추가된 카메라를 이용하여 위상 오차를 검출하는 과정에서 측정용 카메라로부터 검출된 위상 오차와 추가된 카메라로부터 검출된 위상 오차가 일치하지 않는 문제가 있음을 확인하고 이 문제를 해결하기 위해 위상 비율 일치법(PRM - Phase Ratio Matching) 과 위상 오차 오프셋 일치법(PEOM - Phase Error Offset Matching) 을 제안하였다. 간섭 신호를 모의 실험 하는 프로그램을 제작하여 제안된 시스템과 위상 오차 일치법이 타당함을 검증하였다. 그리고 실제 제작된 2C-WLPSI와 압전 구동기(PZT Stage)를 이용한 가진 시스템으로 구성된 실험 장치를 통해 성능을 평가하였다. 2~50 Hz 이내의 진동 조건 안에서, 보정이 없는 상태와 제안된 2C-WLPSI 의 시스템과 보정 방안을 이용한 결과를 비교하여, 5 um 이내의 불연속 구간을 갖는 측정 대상물에 대해서 진동에 의한 오차를 상당히 제거할 수 있음을 보였다. 특히, 주파수10Hz 대의 진동에 대해서는 최대 7 %까지 형상 왜곡을 줄일 수 있었다.Correction of Phase Error Using 2 Cameras in White-Light Phase-Shifting Interferometer In this thesis, research to minimize the distortion caused by the phase error in white light phase shifting interferometer was conduct. Phase error caused by the nonlinear movement of a scanner and the difference between an ideal interval and the actual interval according to the central wavelength of the light source as well as phase error caused by the mechanical vibration can both occur. These error types affect the quality of reconstructed 3D surfaces. Existing research which used the phase error to improve the measurement results cannot be applied to discontinuous samples distorted by disturbance such as vibration. In this thesis, 2C-WLPSI (2 Camera White-Light Phase-Shifting Interferometer), i.e., a white-light phase-shifting interferometer added to a band-pass filter and a camera is proposed to get a continuous area average phase error. A phase error correction method applicable to samples containing discontinuous regions up to 5 um in height is proposed. In the effort to correct this phase error detected from the measurement camera and additional phase error detected from a 2nd camera which does not match that of the first was found. To address this issue, a Phase Ratio Matching (PRM) method and a Phase Error Offset Matching (PEOM) method are proposed. By producing a program that simulates an interference signal, the proposed system and the phase matching methods were verified. With the actually fabricated 2C-WLPSI and a vibration generator using a piezoelectric actuator (PZT Stage), the performance was evaluated. Under 2 ~ 50 Hz vibrating condition, the results obtained by the proposed correction method and the 2C-WLPSI system were compared with the results with no correction method. When measuring an object with a discrete interval of 5 um, the error caused by significant vibration can be removed. In particular, at a vibration frequency of 10 Hz the proposed method was able to reduce the distortion of the shape to a maximum of 7%.Docto

Effect of high extracellular Ca²+ Concentration on the formation of osteoclast-like cells and the functions of osteoblastic cells

학위논문(박사)--서울대학교 :치의학과 치과약리학 전공,1999.Docto