Induction of tolerogenic lung CD4+ T cells by local treatment with a pSTAT-3 and pSTAT-5 inhibitor ameliorated experimental allergic asthma

Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 inhibitors play an important role in regulating immune responses. Galiellalactone (GL) is a fungal secondary metabolite known to interfere with the binding of phosphorylated signal transducer and activator of transcription (pSTAT)-3 as well of pSTAT-6 dimers to their target DNA in vitro. Intra nasal delivery of 50 μg GL into the lung of naive Balb/c mice induced FoxP3 expression locally and IL-10 production and IL-12p40 in RNA expression in the airways in vivo. In a murine model of allergic asthma, GL significantly suppressed the cardinal features of asthma, such as airway hyperresponsiveness, eosinophilia and mucus production, after sensitization and subsequent challenge with ovalbumin (OVA). These changes resulted in induction of IL-12p70 and IL-10 production by lung CD11c+ dendritic cells (DCs) accompanied by an increase of IL-3 receptor α chain and indoleamine-2,3-dioxygenase expression in these cells. Furthermore, GL inhibited IL-4 production in T-bet-deficient CD4+ T cells and down-regulated the suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS-3), also in the absence of STAT-3 in T cells, in the lung in a murine model of asthma. In addition, we found reduced amounts of pSTAT-5 in the lung of GL-treated mice that correlated with decreased release of IL-2 by lung OVA-specific CD4+ T cells after treatment with GL in vitro also in the absence of T-bet. Thus, GL treatment in vivo and in vitro emerges as a novel therapeutic approach for allergic asthma by modulating lung DC phenotype and function resulting in a protective response via CD4+FoxP3+ regulatory T cells locall

The role of Tyrosine kinase 2 in a murine model of allergic asthma

In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle der Tyrosinkinase 2 (Tyk2) in einem murinen Modell allergischen Asthmas genauer beschrieben werden und dabei besonders Wert auf die Interaktion der einzelnen T-Lymphozyten Populationen gelegt werden. Im Vordergrund standen dabei Th2 , Th17 sowie regulatorische T Lymphozyten (Treg). Tyk2 ist als Mitglied der Janus Protein Tyrosin Kinasen (JAK) entscheidend an der Signaltransduktion einer Reihe von Zytokinen beteiligt, darunter sind „Interferon“ IFNalpha, IFNbeta und IFNlambda sowie „Interleukin“ IL-6, IL-10, IL-12, IL-13 und IL-23. Dabei wird durch die Aktivierung der „signal transducers and activators of transcription“ (STAT) Moleküle der so genannte JAK STAT Signalweg benutzt. In Tyk2-defizienten Mäusen werden nach der Induktion allergischen Asthmas Infiltrate eosinophiler Granulozyten sowie erhöhte Konzentrationen IgE sowie Th2- und Th9-Zytokinen gemessen. Dies ist für die Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 bereits in der Literatur beschrieben. Ähnlich verhält es sich mit der Ausprägung des Atemwegswiderstands (AHR), die sich sowohl bei unbehandelten als auch bei Allergen behandelten Tyk2-defizienten Mäusen nicht von der bei Wildtyp Mäusen gemessenen AHR unterscheidet. Hierfür können verschiedene Gründe angeführt werden. Zum einen ist die Signaltransduktion von IL-13 bei Tyk2-Defizienz beeinträchtigt, so dass nur eine geringe Effizienz bei der Verarbeitung der durch dieses Zytokin induzierten pathophysiologischen Reaktionen auftritt. Zum anderen ist die Produktion des Zytokins IL-17A in Tyk2-defizienten Mäusen stark reduziert, so dass dessen AHR induzierende Wirkung nur vermindert eintreten kann. Treg spielen in dieser Maus nur eine untergeordnete Rolle bei der Regulation der AHR, da in der Lunge Tyk2-defizienter Mäuse keine Veränderung des Anteils der CD4+CD25+Foxp3+ T-Lymphozyten im Vergleich zu Wildtyp Mäusen erkennbar ist. Eine bestimmte Subpopulation der Treg, CD4+CD25+Foxp3+GITR+ T-Lymphozyten, findet sich jedoch vermehrt in Tyk2-defizienten Mäusen. Durch die Stimulation des „glucocorticoid-induced tumournecrosis-factor-receptor-related protein“ (GITR) in vivo lässt sich der Anteil der Treg reduzieren, während gleichzeitig die Effektorfunktionen von CD4+ T-Lymphozyten gesteigert werden. Da dieser Effekt verstärkt in Tyk2-defizienten Mäusen auftritt, stützt dies die Hypothese, dass Treg dieses Mausstamms nicht ausreichend in der Lage sind, die Funktionen von Effektor-T-Lymphozyten zu unterdrücken. Die Produktion des Zytokins IL-17A ist in Tyk2-defizienten Mäusen sowohl in vitro als auch in vivo gegenüber Wildtyp Mäusen deutlich reduziert. Die exogene Gabe dieses Zytokins in vivo zusätzlich zum Allergen führt bei beiden untersuchten Mausstämmen zu einem Anstieg der AHR, somit kann hier grundsätzlich nachgewiesen werden, dass IL-17A für die Induktion der AHR eine entscheidende Rolle spielt. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob dieses Zytokin wichtiger für die Ausprägung dieses Merkmals ist, als Th2-Zytokine wie IL-13. Außerdem kommt es zu einer Reduktion der Treg in Tyk2 defizienten Mäusen. Hierbei spielt IL-21 eine Rolle, das die Fähigkeit hat, die Expression von Foxp3 zu unterdrücken. IL-17A wird eine zweiseitige Funktion bei der Pathogenese allergischen Asthmas zugesprochen. Die protektive Rolle des Zytokins manifestiert sich bei Tyk2-defizienten Mäusen in einer reduzierten Produktion Th2 spezifischer Zytokine. In weiteren Studien muss untersucht werden, ob die Rolle von IL-17A in allergischem Asthma insgesamt positiv oder negativ für den Krankheitsverlauf ist. Für IL-17F kann hingegen gezeigt werden, dass zwischen Tyk2-defizienten Mäusen und Wildtyp Mäusen keine Differenz besteht, hier also eine normale Produktion vorliegt. In weiterführenden Untersuchungen muss gezeigt werden, inwiefern IL-17F die Rolle von IL-17A übernehmen kann, also ein Fehlen dieses Zytokins kompensieren kann. Durch die Verwendung desselben Signaltransduktionsweges und der Ausbildung von Heterodimeren kann davon ausgegangen werden, dass eine gewisse funktionelle Überlappung besteht. Das Zytokin IL-1beta ist an der Differenzierung naiver T-Lymphozyten zu Th17-Zellen beteiligt. Durch die Wirkung dieses Zytokins kann in vitro der Mangel Tyk2-defizienter Mäuse hinsichtlich der IL-17A Produktion ausgeglichen werden. Bei der Gabe von IL-1beta in vivo zusätzlich zum Allergen kommt es zu einer Induktion von IL-17A und auch der AHR. IL-1beta ist daher in der Lage, die IL 17A Defizienz Tyk2 defizienter Mäuse zu reduzieren. Zusammenfassend kann in dieser Arbeit die protektive Rolle von Tyk2 bei der Ausbildung allergischer Erkrankungen gezeigt werden, da das Fehlen dieser Kinase zu einem deutlich schwereren pathologischen Phänotyp führt. Außerdem ist Tyk2 für die suppressorische Funktion regulatorischer T-Lymphozyten und für die Differenzierung von Th17-Zellen von großer Bedeutung.The aim of this thesis was to analyse the role of Tyrosine kinase (Tyk2) in a murine model of allergic asthma, especially regarding the interaction of T lymphocyte populations with the most relevant being Th2, Th17 and regulatory T lymphocytes (Treg). Tyk2 is a member of the Janus Protein Tyrosine Kinase family (JAK) and thus important in regulating cytokine signal transduction. Tyk2 is associated with the receptors for IFNalpha, IFNbeta and IFNgamma as well as IL-6, IL-10, IL-12, IL-13 and IL-23. After the respective cytokine has bound to the receptor STAT transcription factors are recruited. This leads to the activation of the so-called JAK-STAT-signalling pathway. Asthmatic Tyk2 deficient mice show elevated levels of eosinophils, serum IgE and Th2 as well as Th9 cytokines (IL-3, IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13) compared to wild type mice. An increased production of IL-4, IL-5 and IL-13 in Tyk2 deficient mice has already been described in the literature. Another hallmark of allergic asthma is AHR which is not different between Tyk2 deficient mice and wild type mice irrespective of the treatment. This has also been described. It may be due to several reasons. On the one hand IL-13 signalling is affected in Tyk2 deficient mice leading to a reduced signal transduction and thus to reduced IL-13-induced pathophysiology. On the other hand, a decreased IL-17A-production can be observed in Tyk2 deficient mice after allergen treatment compared to wild type mice. This leads to a reduced AHR inducing effect in these mice. Treg are not as important in AHR regulation compared to these two cytokines since no difference in CD4+CD25+Foxp3+ T lymphocytes could be observed in the two mouse strains. However, Tyk2 deficient mice showed an increased population of CD4+CD25+Foxp3+GITR+ T lymphocytes which have elevated suppressive capacity. Stimulation with GITR in vivo leads to a reduction of Treg while it simultaneously induces effector functions of CD4+-T-lymphocytes. This effect occurs predominantly in Tyk2 deficient mice supporting the hypothesis that Treg cells from this mouse strain are not as capable to suppress effector T cells as wild type cells. IL-17A production is reduced in vitro as well as in vivo in Tyk2 deficient mice compared to wild type mice irrespective of the treatment. Exogenous IL-17A was applied to the mice in vivo together with the allergen which lead to an increased AHR in both mouse strains. This means that IL-17A plays an important role in the induction of AHR. Further analyses will have to show whether this cytokine is more important for the establishment of AHR than Th2 cytokines like IL-13. Additionally, IL-17A treatment leads to a reduction of Treg only in Tyk2 deficient mice. IL-21, a cytokine produced by Th17 cells, is known to suppress the expression of Foxp3, the Treg defining transcription factor. Thus, IL-17A plays a two-sided role in the pathogenesis of allergic asthma. The protective role of this cytokine manifests in Tyk2 deficient mice in a reduction of Th2 specific cytokines. Further studies will have to show whether IL-17A has a more protective or deleterious role in allergic asthma. Tyk2 deficient mice and wild type mice did not show differences regarding IL-17F production. It has to be shown to what extent IL-17F can substitute IL-17A functionally and thus compensate the loss of this cytokine. Since both cytokines use the same signal transduction pathway and are able to form heterodimers a functional overlap certainly exists. IL-1beta plays a role in the differentiation of naive T lymphocytes to Th17 cells. This cytokine can compensate the deficit of Tyk2 deficient mice to produce this cytokine in vitro. When IL-1beta was applied in vivo together with the allergen an increased AHR as well as IL-17A production could be observed in both mouse strains. Thus, IL-1beta is able to reduce the IL-17A production deficiency in Tyk2 deficient mice in vivo. Taken together, this work shows the protective role of Tyk2 during the manifestation of allergic diseases since the lack of this kinase leads to a more severe phenotype. Additionally, Tyk2 is essential for the suppressive function of regulatory T lymphocytes as well as for the differentiation of Th17 cells

Induction of tolerogenic lung CD4+ T cells by local treatment with a pSTAT-3 and pSTAT-5 inhibitor ameliorated experimental allergic asthma.

Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 inhibitors play an important role in regulating immune responses. Galiellalactone (GL) is a fungal secondary metabolite known to interfere with the binding of phosphorylated signal transducer and activator of transcription (pSTAT)-3 as well of pSTAT-6 dimers to their target DNA in vitro. Intra nasal delivery of 50 μg GL into the lung of naive Balb/c mice induced FoxP3 expression locally and IL-10 production and IL-12p40 in RNA expression in the airways in vivo. In a murine model of allergic asthma, GL significantly suppressed the cardinal features of asthma, such as airway hyperresponsiveness, eosinophilia and mucus production, after sensitization and subsequent challenge with ovalbumin (OVA). These changes resulted in induction of IL-12p70 and IL-10 production by lung CD11c(+) dendritic cells (DCs) accompanied by an increase of IL-3 receptor α chain and indoleamine-2,3-dioxygenase expression in these cells. Furthermore, GL inhibited IL-4 production in T-bet-deficient CD4(+) T cells and down-regulated the suppressor of cytokine signaling-3 (SOCS-3), also in the absence of STAT-3 in T cells, in the lung in a murine model of asthma. In addition, we found reduced amounts of pSTAT-5 in the lung of GL-treated mice that correlated with decreased release of IL-2 by lung OVA-specific CD4(+) T cells after treatment with GL in vitro also in the absence of T-bet. Thus, GL treatment in vivo and in vitro emerges as a novel therapeutic approach for allergic asthma by modulating lung DC phenotype and function resulting in a protective response via CD4(+)FoxP3(+) regulatory T cells locally