Metabolik Mühendislik ve Reaksiyon Mühendisigi Prensipleriyle Insan Büyüme Hormonu Üretimi Için Yeni Biyoteknolojik Proses Gelistirilmesi

TÜBİTAK KBAG Proje01.05.2018Insan büyüme hormonu (hGH), 22 kDa molekül agırlıgında, 191 amino asitten olusan, beyninön lobundaki hipofiz bezi tarafından üretilen bir proteindir. Hipofiz bezlerindeki somatotropikhücreler tarafından dogal olarak sentezlenen, kanda bulunan hGH?nin, insan organizmasındaeksik, bozuk (defective) üretiminin neden oldugu problemlerin düzeltilmesi için dısarıdanverilme ihtiyacı ?diger hormonlar gibi- bu farmasötik temel maddenin biyoteknolojik prosesleendüstriyel üretimini önemli yapmaktadır. Bu proje kapsamında, gliseraldehit-3-fosfatdehidrojenaz baslatıcısının (promotör) (PGAP) üzerinde bulunan transkripsiyon faktörlerininbaglanma bölgelerini transkripsiyon mühendisligi ile modifiye ederek rekombinant protein (rprotein)üretimini artırmak hedeflenmistir. Pichia pastoris?te en çok kullanılan baslatıcılardanbiri olan PGAP, olası transkripsiyon faktörlerinin (TF) baglanma bölgeleri açısından analizedilmistir. Bulunan TF baglanma bölgeleri silinerek ya da dogal konumlarında duplike edilerekPGAP varyant kütüphanesi olusturulmustur. Aynı zamanda, seçilen TF?ler asırı-ekspresedilerek ya da silinerek, bu faktörlerin r-protein üretimine etkisi arastırılmıstır. GelistirilenPGAP varyantları altında modifiye yesil floresan proteini üretiminin ekspresyon seviyeleri,dogal PGAP?a kıyasla 0.35-3.10 kat arasında degisim göstermistir. En yüksek ekspresyonseviyelerine ulasan baslatıcı varyantları olan Pro9 (Gal4-benzeri TF baglanma bölgesininduplike edildigi) ve Pro10 (Rfx1 baglanma bölgesinin silindigi) kontrolü altında ikinci modelprotein, rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH), ekspres edilmis; dogal PGAP?a kıyasla,sırasıyla, 2.4 ila 1.6 kat daha fazla rhGH üretilmistir. Yarı-kesikli biyoreaktör isletimkosullarında, Pro9 kontrolü altında ve Gal4-benzeri TF?nin asırı-ekspres edildigi sus ile rhGHüretiminde birim hücre basına 2.2 kat artıs elde edilmistir. Gelistirilen hibrit yarı-kesikli isletimile en yüksek rhGH derisimi t = 8 st?te, CrhGH = 611 mg dm-3 elde edilmistir.Human growth hormone (hGH), an important human therapeutic protein, is synthesized andsecreted by the anterior lobe of the pituitary gland during the entire life of the individual, and inhigher quantities in the pre-adult period. Pichia pastoris, a methylotrophic yeast, is a strongalternative for hGH production, having the ability of producing foreign proteins at high levels. Inthis project, to enhance the expression strength of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasepromoter (PGAP) for improved recombinant protein (r-protein) production through modifying thetranscription factors (TF) that regulate the functioning of PGAP by transcriptional engineering. PGAPwas analyzed in terms of putative TF binding sites. A synthetic library was constructed withdistinct regulatory properties through deletion and duplication of these putative transcription factorbinding sites and selected TFs genes were overexpressed or deleted to understand their roles onr-protein production. Using enhanced green fluorescent protein as the first model protein, anexpression strength in a range between 0.35- and 3.10-fold of the wild-type PGAP was obtained inP. pastoris. Recombinant human growth hormone (rhGH) was produced under control of selectedpromoter variants, and 2.4- to 1.6-fold higher product titers were reached compared to wild-typePGAP. The specific glucose consumption rate and ethanol production rates were increased by 1.7-and 8-fold in P. pastoris Gal4-like transcription factor overexpression mutants compared to wildtypeP. pastoris, respectively. The hybrid fed-batch bioreactor-operation was developed for theproduction of recombinant human growth hormone (rhGH) in Pichia pastoris under GAP promoter.The highest rhGH production was attained as 611 mg dm-3 at 8 h

Metabolik+genetik+biyokimyasal reaksiyon mühendisliği prensipleriyle rekombinant enzim üretimi

TÜBİTAK MAG Proje01.06.200

Yemezzade Süleyman Rüşdi ve Pend-İ Attar tercümesi

Fars edebiyatı şâirlerinden Ferîdüddin Attâr’ın Pendnâme adlı eserinin Türk edebiyatında pek çok tercüme ve şerhleri yazılmıştır. Dinî ve ahlâkî konuları içerisinde barındıran bu eser, günlük yaşantımızda bizlere rehber olabilecek öğütler vermektedir. Yemezzâde Süleyman Rüşdî ve Pend-i Attâr Tercümesi adlı çalışmamızın amacı, daha önce tespit edilmemiş olan bu manzûm Pendnâme tercümesini ortaya koymaktır. Çalışmamız giriş ve üç bölümden oluşmaktadır. Giriş kısmında Türk edebiyatındaki öğüt geleneğine değinilerek Pendnâme ’ninedebiyatımızdaki tercüme ve şerhlerine yer verilmiştir. Pendnâme ’nin Attâr’a ait olup olmadığı ile ilgili görüşlere dikkat çekilip Pendnâme ile ilgili Türk edebiyatında yapılan kitap, tez, makale, bildiri gibi çalışmalar tespit edilmiştir. Çalışmamızın birinci bölümünde Yemezzâde Süleyman Rüşdî Efendi’nin hayatı, edebî şahsiyeti ve eserleri hakkında bilgi verilmiştir. İkinci bölümde eserin şekil ve muhtevâ özellikleri incelenmektedir. Çalışmamızın üçüncü bölümünde Yemezzâde Süleyman Rüşdî Efendi’nin Tercüme-i Kitâb-ı Pend-i Attâr isimli eserinin transkripsiyonlu metni bulunmaktadır.--------------------Many translations and commentaries were written in Turkish literature about, who work of Persian literature poet, Feridüddin Attar’s Pendname. This study, which contains religious and ethical issues, gives us advice that can guide us in our everyday life. The aim of the study Yemezzâde Suleyman Ruşdi and Translation of Pend-i Attar reveals the Pendname interpretation of this poetry which has not been determined before. Our study consists of introduction and three parts. In the introduction, the tradition of Turkish literature was mentioned and Pendname’s translation and commentaries in our literature are included. Attention was drawn to the views on whether Pendname belongs to Attâr and studies such as books, theses, articles, reports made in Turkish Literature related to Pendname have been determined. In the first part of our study, information about Yemezzâde Suleyman Rusdi Efendi’s life, literary personality and studies were given. In the second part, the shape and content characteristics of the study are examined. In the third part of our study, there is the transcriptional text of Yemezzâde Suleyman Rusdi Efendi’s study named Tercüme-i Kitâb-ı Pend-i Attâr

Biyokimyasal Reaksiyon Mühendisliği Prensipleriyle Rekombinant Pichia Pastoris İle Terapik Peotein Üresiminde Hücreiçi Tepkime Hızlarının Stratejik Analizi

Bu proje kapsamında rekombinant Pichia pastoris ile biyokimyasal reaksiyon mühendisliği prensipleri ile hücreiçi tepkime hızları analiz edilecek ve potansiyel darboğaz oluşturan tepkimeler belirlendikten sonra tepkime sistem uyarı-cevap yöntemi ile pertürbe edilerek hücreiçi tepkimelerin metabolik kontrol özellikleri araştırılacak ve terapatik protein üretimi için tepkimelerin yönlendirilmesi için stratejiler geliştirilecektir. RhGH üretiminde ürün seçimliliğini ve verimi artırmak için, hücreiçi tepkime hızlarının bulunmasıyla hız kısıtlayan tepkimelerin araştırılması, potansiyel darboğaz oluşturan tepkimeler belirlenmesi ve tepkime sisteminin uyarı-cevap yöntemi ile pertürbe edilerek hücreiçi tepkimelerin metabolik kontrol özellikleri araştırılması bu projenin kapsamını oluşturmaktadır. Bu kapsamda; 1. Alt Proje: Kütle korunum temelli “genom scale” stokiyometrik denklemlerden oluşan matematik model kurulması, 2. Alt Proje: RhGH üretimi için besleme stratejisinin araştırılması, 3. Alt Proje: Besleme stratejisinin hücreiçi tepkime hızlarına etkisinin araştırılması, ve potansiyel hız kısıtlayıcı basamakların belirlenmesi, ve 4. Alt Proje: Prosesin karakteristik zamanlarında, rhGH, AOX ve metanol tüketim yolizindeki enzimlerin ve modelin çözümünde bulunacak diğer enzimlerin ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi, 5. Alt Proje: Tepkime sisteminin uyarı-cevap yöntemi ile pertürbe edilerek hücreiçi tepkimelerin metabolik kontrol özelliklerinin belirnemesidir. P. pastoris hücreiçi tepkimeleri ile kurulacak genom scale kütle korunum temelli stokiyometrik denklemlerden oluşan matematik model ve deney verileri kullanılarak yapılacak çözüm ile üretim parametrelerinin hücreiçi tepkime hızlarına etkisi, ve hücreiçindeki darboğazlar araştırılacaktır. Microarray ve RT-PCR sonuçları ile genom scale model çözümüyle elde edilecek sonuçlarla üretimin artırılması için stratejiler geliştirilecektir. Bu proje sonuçları, diğer terapatik proteinlerin yüksek verim ve seçimlilikte hücre- dışı üretimi için de önemli bir başlangıç noktası olacaktır. Hücreiçi protein olarak yıllık toplam üretimi 10 kg'ın altında ve satış değeri kilogram başına yaklaşık $3,000,000 olarak hesaplanmakta olan rhGH'ın önerilen proje ile hücre-dışı üretimi başarıldığında üretim miktarı artacak ve üretim maliyeti azalacağından, yukarıda özetlenen ve çoğalmakta olan tıptaki tedavi alanlarındaki kullanımı daha da yaygınlaşarak insanların sağlıklı yaşam kalitesine katkı yapacaktır

Beta-laktamaz enzim üretimi için endüstriyel biyoteknolojik proses geliştirilmesi

TÜBİTAK MİSAG Proje01.12.200

Serin alkali proteaz üretiminde hücreiçi darboğazların belirlenmesi ve prosesin geliştirilmesi

TÜBİTAK MİSAG Proje01.03.2003Mikrobiyal serin proteazlar içinde serin alkali proteazlar farmasötik sanayinde, gıda endüstrisinde (et, içecek, süt vd.), deri sanayinde, fotoğraf endüstrisinde (filmden gümüşün geri kazanımı), deterjan katkı maddesi olarak büyük öneme sahiptir. Beş alt-programdan oluşan projenin birinci evresinde SAP üretim potansiyelinin, verim ve seçimliliğin artırılması için üç alt programdan oluşan genetik mühendisliği (GM) araştırma programı ile B.licheniformis'de SAP üretiminden sorumlu gen subC önce pRS316 E.coli-yeast shuttle plasrnide klonlanmış sonra da pHV1431 E.coli-Bacillus shuttle plasmide sub-klonlama yapılmış ve rekombinant DNA swöC+pHV1431 dokuz Bacillus türü hücreye aktarılarak rekombinant mikroorganizmalar elde edilmiştir. Mikroorganizmaların performansı tanımlanmış ortamda kıyaslanmış ve SAP üretimi için en uygun mikroorganizmanın B.licheniformis pHV1431::subC olduğu bulunmuştur. İkinci alt-programda Metabolik yolizi mühendisliği (MYM) analizi ile hücreiçi tepkimeler stokiyometrik denklemleriyle birlikte araştırılarak 147 tepkimeden oluşan tepkime yolizleri belirlenmiş, 147 tepkimede yer alan 105 bileşik için kütle korunum denklemlerinden oluşan matematik model kurulmuş, ve rekombinant hücrelerin hücreiçi tepkime hızlanndaki değişimler incelenmiş ve üretim hızı açısından da en uygun konak hücrenin recombinant B.licheniformis olduğu bulunmuştur. Üçüncü alt-programda hücreiçi metabolit derişimlerinin belirlenmesi için yöntem geliştirilmiş ve hücreiçi valin derişiminin SAP üretimini kısıtladığı bulunmuş; dördüncü alt-programda alanin grubu amino asitlerin SAP üretimine etkisi araştırılmıştır. Son alt-programda kompleks ortamda (melas temelli) rekombinant mikroorganizmaların üretim potansiyelleri kıyaslanmış; kompleks ortamda SAP üretimi için en uygun konak hücre B.subtilis pHV143l::subC olarak bulunmuş ve melas içeren ortamda oksijen aktarımının etkisi incelenmiştir. S.on aşamada soya temelli ortam tasannu yapılarak SAP üretim prosesi geliştirilmiştir

Glukoz İsomeraz Enzim Üretiminin Kinetik Modellenmesi

Glukoz izomeraz (EC 5.3.1.5) enziminin üretimi için, termofilik bir bakteri olan Thermus thermophilus hücresinden izole edilen glukoz izomeraz geninin Escherichia coli'e ve Pichia pastoris'e rekombine edilmesi ve iki mikroorganizma ile ayrı ayrı üretimi, iki mikroorganizmanın üretim potensiyellerinin kıyaslanması ve en iyi üretim yapan mikroorganiza ile GI üretiminin kinetik modelinin oluşturulması bu araştırma projesinin amacını oluşturmaktadır. Endüstride önemli bir yeri olan glukoz izomeraz enzimi, fruktoz şurubu ve hemiselülozdan etanol üretiminde kullanılmaktadır. Günümüzde mezofilik mikroorganizmalardan elde edilmiş glukoz izomeraz enzimi fruktoz şurubu üretiminde düşük reaksiyon sıcaklığı sebebiyle düşük fruktoz içeriği elde edilmesine sebep olmaktadır. Termofilik mikroorganizmalar kullanılarak elde edilen glukoz izomeraz enzimi maliyetleri düşürdüğü ve reaksiyondaki fruktoz verimini artırdığı için fruktoz şurubu üretiminde tercih edilmektedir. Bu çalışmada, glukoz izomeraz geni termofilik bir mikroorganizma olan Thermus thermophilus'dan alınarak üretimi artırmak amacıyla genetik açıdan daha iyi karakterize olmuş E.coli ve P.pastoris konak hücresine rekombine edilecektir