Geometrical Calibration of X-Ray Imaging With RGB Cameras for 3D Reconstruction

(c) 2016 IEEE. Personal use of this material is permitted. Permission from IEEE must be obtained for all other users, including reprinting/ republishing this material for advertising or promotional purposes, creating new collective works for resale or redistribution to servers or lists, or reuse of any copyrighted components of this work in other works.We present a methodology to recover the geometrical calibration of conventional X-ray settings with the help of an ordinary video camera and visible fiducials that are present in the scene. After calibration, equivalent points of interest can be easily identifiable with the help of the epipolar geometry. The same procedure also allows the measurement of real anatomic lengths and angles and obtains accurate 3D locations from image points. Our approach completely eliminates the need for X-ray-opaque reference marks (and necessary supporting frames) which can sometimes be invasive for the patient, occlude the radiographic picture, and end up projected outside the imaging sensor area in oblique protocols. Two possible frameworks are envisioned: a spatially shifting X-ray anode around the patient/object and a moving patient that moves/rotates while the imaging system remains fixed. As a proof of concept, experiences with a device under test (DUT), an anthropomorphic phantom and a real brachytherapy session have been carried out. The results show that it is possible to identify common points with a proper level of accuracy and retrieve three-dimensional locations, lengths and shapes with a millimetric level of precision. The presented approach is simple and compatible with both current and legacy widespread diagnostic X-ray imaging deployments and it can represent a good and inexpensive alternative to other radiological modalities like CT.This work was carried out with the support of Information Storage S.L., University of Valencia (grant #CPI-15-170), CSD2007-00042 Consolider Ingenio CPAN (grant #CPAN13-TR01) as well as with the support of the Spanish Ministry of Industry, Energy and Tourism (Grant TSI-100101-2013-019).Albiol Colomer, F.; Corbi, A.; Albiol Colomer, A. (2016). Geometrical Calibration of X-Ray Imaging With RGB Cameras for 3D Reconstruction. IEEE Transactions on Medical Imaging. 35(8):1952-1961. https://doi.org/10.1109/TMI.2016.2540929S1952196135

Evolution and functional morphology of ptychoidy in Ptyctima (Acari, Oribatida)

Oribatida (Acari, Arachnida) are diverse and abundant in temperate forest litter. As particle feeding saprophages or mycophages, their food is of relatively low quality, which supposedly results in slow movement, prolonged generation time and reduced reproductive potential. Hence, oribatid mites developed a number of different defensive mechanisms. The most complex mechanical defensive mechanism is ptychoidy, where the animals can retract their legs and mouthparts into a secondary cavity in the idiosoma and encapsulate by deflecting the prodorsum. In this state the animals do not exhibit soft membrane but only—through biomineralization—hardened, thick cuticle, and are therefore well protected against many predators. Certain prerequisites have to be met for the evolution of ptychoidy: the coxisternum must be free from solid exoskeletal connections, i.e. embedded in soft membrane; the cuticle of the opisthosoma has to be hardened; the coxisternum must be foldable; and a system able to accommodate huge volume changes is needed. Despite this complexity, ptychoidy evolved three times independently, once in the Ptyctima and twice in the Enarthronota (Mesoplophoridae and Protoplophoridae). We used synchrotron X-ray microtomography (SRµCT), scanning electron microscopy and high-speed videography to investigate the morphological and functional characteristics of ptychoidy in both superfamilies of the Ptyctima (Euphthiracaroidea and Phthiracaroidea). At first glance Euphthiracaroidea and Phthiracaroidea considerably differ in the arrangement of the ventral plates. Phthiracaroidea posses fused anal and adanal (anal valves) as well as fused genital and agenital plates (genital valves). The genital and anal valves are separated from each other and are embedded in soft membrane (anogenital membrane). Euphthiracaroidea posses either completely fused holoventral plates (complete fusion of anal and genital valves) or retain only a suture between anal and genital valves. In both cases the ventral plates are elongated and surrounded by the plicature plates, a sclerotization of the surrounding membrane. The musculature associated with the ventral plates differs accordingly. In Euphthiracaroidea the notogaster lateral compressor connects the notogaster and the junction between the ventral and plicature plates on the complete length and combined with the ventral plate adductor and ventral plate compressor bridges the ventral plates in the area of the preanal apodeme. A simultaneous contraction of these muscles leads to a transmission of forces via the preanal apodeme onto the notogaster resulting in a lateral compression. In Phthiracaroidea on the other hand the notogaster lateral compressor is restricted to the last third of the ventral plates, inserting on the anogenital membrane. A contraction of the notogaster lateral compressor—along with the postanal muscle—leads to a retraction of the temporarily unified ventral plates into the idiosoma. Other differences concern for example the manubrium (present in Euphthiracaroidea, absent in Phthiracaroidea), and the sensillus ridge allowing for an un-pinched stowage of the sensillus in encapsulated state (absent in Euphthiracaroidea, present in Phthiracaroidea). The coxisternal protractor, which is able to act as retractor as well as protractor of the legs, could only be found in the investigated species of Phthiracaroidea, but in none of the species of Euphthiracaroidea. In conclusion, the mode of pressure build-up associated with ptychoidy is functionally different in the two groups of Ptyctima, but morphologically based on the same characters. Molecular data and for example the location of the taenidiophore also suggest a common origin. A comparison to a potential sister group of Ptyctima, the Collohmannioidea, indicates that the mode of pressure build-up of Euphthiracaroidea is ancestral (based on the elongated state of the ventral plates and the associated musculature). This is also affirmed by molecular studies showing that the Phthiracaroidea are a derived group originating from euphthiracaroid ancestors. Further investigations regarding ptychoidy should include the two remaining— unexamined—ptyctime groups, Synichotritiidae (Euphthiracaroidea) and Steganacaridae (Phthiracaroidea), and the two groups that have evolved ptychoidy independently within the Enarthronota, Mesoplophoridae and Protoplophoridae. Especially the two enarthronote groups are of particular interest since they developed ptychoidy on a different phylogenetic basis. External observation of the Mesoplophoridae for example leads to the assumption that their mode of pressure build-up might be similar to that of the Phthiracaroidea. However, anal and genital valves of Mesoplophoridae are embedded in a single ventral plate of partially notogastral origin. In Protoplophoridae the anal and genital valves are not observable externally in encapsulated state. They are covered by cuticular plates that were converted from static notogastral plates into moveable and retractable plates that potentially function as system for the build-up of pressure. These observations support the assumption of a convergent evolution of ptychoidy in the three groups.Hornmilben (Oribatida) sind in der Laubstreu gemäßigter Wälder arten- und zahlreich vertreten. Sie sind detritivor oder fungivor und verzehren diese Nahrung in Form von festen Partikeln. Diese relativ niederwertige Nahrung soll zu einer langsamen Bewegungsweise, einer verlängerten Generationsdauer und einer verminderten Reproduktionsrate führen. Deshalb haben Hornmilben zahlreiche verschiedene und sehr effektive Mechanismen zum Schutz vor Prädation entwickelt. Der wohl komplexeste mechanische Defensivmechanismus ist die Ptychoidie, welche es den Tieren erlaubt ihre Beine und das Gnathosoma in einen sekundären Hohlraum im Idiosoma einzuziehen und mit dem Prodorsum zu verschließen. In diesem eingekapselten Zustand präsentieren die Tiere nach außen hin nur noch feste, durch Sklerotisierung und Biomineralisierung gehärtete, Kutikula und keine weichhäutigen Membranen mehr. Dadurch erlangen sie einen effektiven Schutz vor zahlreichen Fressfeinden. Für die Evolution der Ptychoidie müssen bestimmte Vorbedingen erfüllt sein: das Coxisternum muss frei beweglich sein, darf also mit keiner anderen kutikulären Struktur fest verbunden sein; die Kutikula des Notogaster muss gehärtet sein; das Coxisternum muss zusammenklappbar sein; und es muss ein System geben, welches die mit der Ptychoidie assoziierte Volumenänderung kompensieren kann. Trotz dieser Komplexität ist die Ptychoide vermutlich dreifach unabhängig entstanden: einmal bei den Ptyctima und zweimal innerhalb der Enarthronota (bei den Mesoplophoridae und Protoplophoridae). Zur Untersuchung der morphologischen und funktionellen Merkmale der Ptychoidie in den beiden Überfamilien der Ptyctima (Euphthiracaroidea und Phthiracaroidea), verwendeten wir Synchrotron-Röntgen-Mikrocomputertomographie (SRµCT), Rasterelektronenmikroskopie und Hochgeschwindigkeitsaufnahmen. Schon auf den ersten Blick unterscheiden sich Euphthiracaroidea und Phthiracaroidea in der Ausprägung der Ventralplatten-Morphologie. Die Phthiracaroidea besitzen verschmolzene Anal- und Adanalplatten (Analklappen) sowie verschmolzene Genital- und Agenitalplatten (Genitalklappen). Die Anal- und Genitalklappen sind dabei voneinander abgegrenzt und sind in einer umlaufenden weichhäutigen Membran eingebettet (Anogenitalmembran). Die Euphthiracaroidea besitzen entweder Holoventralplatten (vollständig verschmolzene Anal- und Genitalklappen) oder behalten nur eine feine Naht zwischen den beiden Klappen. In beiden Fällen sind die Platten stark verlängert und sind umrahmt von den Holoventralfalten, die eine Sklerotisierung der Anogenitalmembran darstellen. Die mit den Ventralplatten assoziierte Muskulatur unterscheidet sich dementsprechend ebenfalls. Der Lateralkompressor des Notogaster (nlc) verbindet bei den Euphthiracaroidea über die gesamte Länge den Notogaster mit der Gelenkstelle zwischen den (Holo-) Ventralplatten und Holoventralfalten. Die Gruppe bestehend aus nlc, Ventralplatten-kompressor (vpc) und Ventralplattenadduktor (vpa) überspannt dabei auf Höhe des präanalen Apodems wie eine Brücke die ventralen Platten. Die simultane Kontraktion dieser Muskeln bewirkt eine Übertragung der Kräfte via des präanalen Apodems auf den Notogaster und führt somit zu einer lateralen Kompression desselben. Bei den Phthiracaroidea hat der nlc seinen Ursprung zwar ebenfalls am Notogaster, jedoch nur im letzten Drittel des Körpers und inseriert, anders als bei den Euphthiracaroidea, auf der Anogenitalmembran. Die Kontraktion des nlc führt hier aber in Kombination mit der Kontraktion des postanalen Muskels (poam) zu einem Einziehen der Ventralplatten in das Idiosoma. Weitere Unterschiede betreffen beispielsweise das Manubrium (nur bei den Euphthiracaroidea vorhanden) und eine Nut, die ein Einklemmen des Sensillus’ zwischen Notogaster und Prodorsum im eingekapselten Zustand der Tiere verhindert (in dieser Ausprägung nur bei den Phthiracaroidea vorhanden). Der Protraktor des Coxisternum (csp) kommt nach dem bisherigen Stand unserer Forschung nur bei den Phthiracaroidea vor. Er ist in der Lage sowohl als Pro- wie auch als Retraktor der Beine zu fungieren. Das Druck-Kompensationssystem für die Volumenänderung unterscheidet sich funktionell deutlich zwischen den zwei Gruppen, obwohl zum großen Teil dieselben morphologischen Strukturen involviert sind. Molekulare Untersuchungen und zum Beispiel die Position der Taenidiophore sprechen ebenfalls für einen gemeinsamen Ursprung der beiden Überfamilien. Durch den Vergleich mit einer potentiellen Außengruppe der Ptyctima, den Collohmannioidea, kann angenommen werden, dass die laterale Kompression wie sie bei den Euphthiracaroidea zu finden ist den ursprünglichen Zustand darstellt (basierend zum Beispiel auf der in die Länge gezogenen Form der Ventralplatten und der damit assoziierten Muskulatur). Dies wird auch durch molekulare Studien belegt, die zeigen, dass die Phthiracaroidea eine abgeleitete Gruppe darstellen die ihren Ursprung in den Euphthiracaroidea haben. Weitere Forschungsvorhaben zur Ptychoidie sollten den Fokus auf die zwei verbleibleibenden (bisher nicht untersuchten) Gruppen der Ptyctima, Synichotritiidae und Steganacaridae, sowie die zwei Gruppen, die den Defensivmechanismus Ptychoidie innerhalb der Enarthronota entwickelt haben (Mesoplophoridae und Protoplophoridae), richten. Die beiden Gruppen der Enarthronota sind dabei von besonderem Interesse, da sie die Ptychoidie auf einer gänzlich anderen phylogenetischen Basis evolviert haben. Schon eine äußerliche Betrachtung der Mesoplophoridae lässt den Schluss zu, dass der Druckaufbau ähnlich wie bei den Phthiracaroidea funktioniert. Allerdings sind hier die Anal- und Genitalklappen anders als bei den Phthiracaroidea in eine unpaare ventrale Platte eingebettet, die zum Teil aus Platten des Notogaster aufgebaut ist. Bei den Protoplophoridae sind die Ventralplatten (Anal- und Genitalklappen) durch eine äußerliche Betrachtung eingekapselter Tiere nicht auszumachen. Sie sind durch ehemals statische Platten des Notogaster verdeckt, die zu beweglichen und einziehbaren Strukturen umgewandelt worden sind und jetzt potentiell dem Druckaufbau dienen. Diese äußerliche Betrachtung festigt die Annahme konvergenter Evolution der Ptychoidie bei den drei Gruppen

Mitral Valve Imaging and Biomechanics: A Workflow Towards Computational Modeling and Validation

The mitral valve serves a critical role in healthy cardiac function by ensuring the unidirectional flow of oxygenated blood from the left atrium into the left ventricle. It experiences the highest pressures found within the heart and its closure is the result of a complex interaction of several different structures that, furthermore, are unique to each individual. Despite the valve’s vital role however, the specific function of these constituent structures is not fully understood. This, confounded by its asymmetric, personalized nature, make surgical interventions for the mitral valve far less effective than for its neighboring aortic valve. Efforts to overcome this have been made through the lens of computational simulation, in which the valve is studied virtually and procedures may be planned. The quality and reliability of these simulation results are only as good as the inputs that the simulation model receives. This study proposes and evaluates a workflow by which high-quality biomechanical inputs are obtained for computational input and validation. To account for individual variation, all steps are performed on the same valve such that a direct correspondence is made between geometry, stress/load distribution and the resulting coaptation. Ultrasound in vivo measurements are made so that custom tailored mounting hardware can be manufactured. This hardware is used to support the valve in a physiologically appropriate manner for µCT imaging in both the open and closed configurations. Scanning within a fluid medium, to prevent tissue desiccation and other detrimental effects, is made possible through a DiceCT tissue staining procedure. High resolution, 3D imagery is obtained for the open valve whereas only a relatively quick set of projection images is obtained for the closed configuration. Registration between open and closed imagery is accomplished by localizing aluminum oxide fiducial markers that are bound to the leaflet surface. Subsequent image analysis is performed to isolate the tissue and place the data in the proper format for computational use. The valve is then closed under known pressure while chordal forces/strains are simultaneously recorded to provide loading conditions. The effectiveness of the workflow is illustrated through two animal experiments. Incomplete results were obtained from the first experiment as the tissue degraded significantly during a prolonged period of µCT downtime. The second experiment resulted in good quality ultrasound imagery, leading to the creation of customized mounting hardware, yet the remainder of the process was still in progress at the final stages of this document. Computational modeling is still ongoing, yet some preliminary results are presented which show the geometry from the first animal experiment tending towards closure

Mitral Valve Imaging and Biomechanics: A Workflow Towards Computational Modeling and Validation

The mitral valve serves a critical role in healthy cardiac function by ensuring the unidirectional flow of oxygenated blood from the left atrium into the left ventricle. It experiences the highest pressures found within the heart and its closure is the result of a complex interaction of several different structures that, furthermore, are unique to each individual. Despite the valve’s vital role however, the specific function of these constituent structures is not fully understood. This, confounded by its asymmetric, personalized nature, make surgical interventions for the mitral valve far less effective than for its neighboring aortic valve. Efforts to overcome this have been made through the lens of computational simulation, in which the valve is studied virtually and procedures may be planned. The quality and reliability of these simulation results are only as good as the inputs that the simulation model receives. This study proposes and evaluates a workflow by which high-quality biomechanical inputs are obtained for computational input and validation. To account for individual variation, all steps are performed on the same valve such that a direct correspondence is made between geometry, stress/load distribution and the resulting coaptation. Ultrasound in vivo measurements are made so that custom tailored mounting hardware can be manufactured. This hardware is used to support the valve in a physiologically appropriate manner for µCT imaging in both the open and closed configurations. Scanning within a fluid medium, to prevent tissue desiccation and other detrimental effects, is made possible through a DiceCT tissue staining procedure. High resolution, 3D imagery is obtained for the open valve whereas only a relatively quick set of projection images is obtained for the closed configuration. Registration between open and closed imagery is accomplished by localizing aluminum oxide fiducial markers that are bound to the leaflet surface. Subsequent image analysis is performed to isolate the tissue and place the data in the proper format for computational use. The valve is then closed under known pressure while chordal forces/strains are simultaneously recorded to provide loading conditions. The effectiveness of the workflow is illustrated through two animal experiments. Incomplete results were obtained from the first experiment as the tissue degraded significantly during a prolonged period of µCT downtime. The second experiment resulted in good quality ultrasound imagery, leading to the creation of customized mounting hardware, yet the remainder of the process was still in progress at the final stages of this document. Computational modeling is still ongoing, yet some preliminary results are presented which show the geometry from the first animal experiment tending towards closure

The ant abdomen: The skeletomuscular and soft tissue anatomy of Amblyopone australis workers (Hymenoptera: Formicidae)

Recent studies of insect anatomy evince a trend towards a comprehensive and integrative investigation of individual traits and their evolutionary relationships. The abdomen of ants, however, remains critically understudied. To address this shortcoming, we describe the abdominal anatomy of Amblyopone australis Erichson, using a multimodal approach combining manual dissection, histology, and microcomputed tomography. We focus on skeletomusculature, but additionally describe the metapleural and metasomal exocrine glands, and the morphology of the circulatory, digestive, reproductive, and nervous systems. We describe the muscles of the dorsal vessel and the ducts of the venom and Dufour\u27s gland, and characterize the visceral anal musculature. Through comparison with other major ant lineages, apoid wasps, and other hymenopteran outgroups, we provide a first approximation of the complete abdominal skeletomuscular groundplan in Formicidae, with a nomenclatural schema generally applicable to the hexapod abdomen. All skeletal muscles were identifiable with their homologs, while we observe potential apomorphies in the pregenital skeleton and the sting musculature. Specifically, we propose the eighth coxocoxal muscle as an ant synapomorphy; we consider possible transformation series contributing to the distribution of states of the sternal apodemes in ants, Hymenoptera, and Hexapoda; and we address the possibly synapomorphic loss of the seventh sternal–eighth gonapophyseal muscles in the vespiform Aculeata. We homologize the ovipositor muscles across Hymenoptera, and summarize demonstrated and hypothetical muscle functions across the abdomen. We also give a new interpretation of the proximal processes of gonapophyses VIII and the ventromedial processes of gonocoxites IX, and make nomenclatural suggestions in the context of evolutionary anatomy and ontology. Finally, we discuss the utility of techniques applied and emphasize the value of primary anatomical research

Synthesis, characterization, and biological evaluation of peptides capable of interfering with RANK-TRAF6 pathway using nuclear imaging

Tese de mestrado, Engenharia Biomédica e Biofísica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasThe RANK-RANKL interaction, and consequently, the RANK-TRAF6 pathway, is involved in several fundamental biological cycles, such as cell growth, apoptosis, osteosteoclastogenesis and inflammatory responses. As a result of partaking in such important processes, it is also implied that this pathway is related to severe pathologies, such as osteoporosis and breast or prostate cancer-induced bone metastasis. Currently, one of the therapeutic approaches to treat such diseases lies in the inhibition of RANK-RANKL interaction. Nonetheless, considerable interest arose in an alternative route, namely the inhibition of the RANK-TRAF6 pathway. This process is achievable, for example, by the interference of RANK’s interaction with TRAF6 using decoy peptides (e.g., L-T6DP-1). 8 Thus, the objective of this project was to synthesize, purify and biologically evaluate two peptides (3A and its negative control, 3B) containing a cell penetrating sequence (KLFMALVAFLRFLT), combined with sequences designed in silico to interfere with the RANK-TRAF6 pathway (RQMATADEA and RQMPTEDEY). Furthermore, biodistribution studies of peptides 3A and 3B, modified with a gallium-67 chelator were aimed to be achieved, in in vivo animal models, by micro-PET-SPECT-CT imaging. The aforementioned studies were not performed, as during the process, several issues arose. Some include long amino acid coupling times and difficulty radiolabeling peptide 3A. These adversities led to an overall unsuccessful procedure, requiring further optimization. Although the image acquisition of the synthesized peptides was impossible at this time, it was deemed that the equipment validation should still be made using an alternative compound that is currently being investigated by the C2TN-IST group: a 67Ga-radiolabeled gold nanoparticle named 67Ga-AuNP-BBN-Pt1.A interação RANK-RANKL, e consequentemente a via RANK-TRAF6, encontra-se envolvida em diversos ciclos biológicos fundamentais, tais como o crescimento celular, apoptose, osteoclastogénese, e respostas inflamatórias. No seguimento da interferência em tais processos, é implícito que a disrupção do normal funcionamento desta interação possa resultar em patologias severas, das quais se destacam osteoporose, ou, em casos mais extremos, metástases ósseas resultantes de cancro da mama ou da próstata. Considerem-se, por exemplo, pacientes diagnosticados com cancro da mama ou da próstata. As células tumorais deste tipo de cancros expressam fatores osteoclastogénicos capazes de alterar o microambiente do osso, como interleucinas(IL)-6 e IL-8, proteínas relacionadas com a hormona paratiroideia (PTHrP), fatores de necrose tumoral-α (TNF-α), entre outros. PTHrP e IL-11 induzem expressão de RANKL, enquanto suprimem a atividade do seu fator inibitório, a osteoprotegerina (OPG). Tal favorece a interação de RANKL com o seu recetor, RANK. A interação de RANK com o seu ligando, desencadeia uma cascata de eventos, que culmina com a ativação do fator nuclear kappa-β (NFkβ), um complexo proteico que regula mecanismos de resposta inflamatória, crescimento celular e apoptose. Dentro destes mecanismos, encontra-se a expressão genética osteoclástica e consequente osteoclatogénese que leva à reabsorção óssea. Encontramo-nos assim perante um loop de feedback positivo, no qual a alteração no microambiente do osso promove o crescimento de células cancerosas, que, por sua vez, promovem a expressão de RANKL e inibição da osteoprotegerina, desencadeando assim a via RANK-TRAF6, que ativa NF-κB, promovendo a expressão genética osteoclástica.16, 23-24 Atualmente, uma alternativa terapêutica para o tratamento de patologias que promovam degradação óssea (e.g. osteoporose) baseia-se na inibição da interação RANK-RANKL por ação do anticorpo monoclonal humano Denosumab. Este anticorpo mimetiza a função da osteoprotegerina (OPG), impedindo o RANKL de interagir com o seu recetor, RANK. Ao inibir a interação de RANK com RANKL, favorece-se o mecanismo de remodelação óssea. Apesar de ser uma terapia inovadora, a paragem na administração de Denosumab pode levar a uma reversão rápida da sua ação farmacológica, turnover, muitas vezes para níveis ainda mais críticos que os anteriores ao tratamento – também designado como ‘efeito rebound’.31 Não obstante, e tendo como inspiração o mecanismo de atuação do Denosumab, tem surgido um interesse crescente por vias alternativas. De entre as várias possibilidades, uma opção exequível passa pela inibição da via RANK-TRAF6. Este processo pode ser alcançado pela inibição da interação de RANKL com TRAF6, utilizando-se por exemplo decoy peptides (e.g., L-T6DP1). 8 Adicionalmente, considerando o nosso interesse no uso de péptidos como potenciais fármacos para terapia-alvo, ou como vetores de metalofármacos para várias aplicações biomédicas, o objetivo deste projeto contempla a síntese, purificação e avaliação biológica de um péptido (3A; KLFMALV AFLRFLTRQMPTEDEY-NH2) e o seu controlo negativo (3B; KLFMALVAFLRF LTRQMATADEANH2) que contêm uma sequência capaz de interferir com a interação proteína-proteína RANK-TRAF6 bem como sequências “penetradoras” (do inglês: cell penetrating sequence; KLFMALVAFLRFLT). Após a preparação dos péptidos 3A (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY-NH2) e 3B (KLFMAL VAFLRFLTRQMATADEA-NH2), o objetivo final do estudo consistia na obtenção de imagens SPECT da biodistribuição dos péptidos radioativos sintetizados em ratinhos saudáveis, pela técnica de imagiologia multimodal micro-PET-SPECT-CT. Numa fase inicial do projeto, experimentaram-se três tipos diferentes de síntese peptídica em fase sólida: (i) síntese ‘clássica’ (‘Classical’ SPPS); (ii) síntese com assistência de ultrassons (‘US-assisted SPPS’), e (iii) síntese com assistência de micro-ondas (‘MW-assisted SPPS’). Nesta fase, procedeu-se à síntese de um segmento do péptido 3B (S3B; RQMATADEA-NH2), com o objetivo de comparar os métodos de síntese peptídica em fase sólida ‘clássica’ e o mais recente método com auxílio a ultrassons. Ao finalizar a síntese pelos dois processos, verificou-se por análise RP-HPLC analítico que os rendimentos dos “resíduos brutos” eram de 84% para o método ‘clássico’, e 72% para o método com auxílio a ultrassons. Apesar de se ter obtido um menor rendimento de síntese, deve ser salientado que a síntese pelo método com auxílio de ultrassons foi finalizada em cerca de um quarto do tempo. Como tal, para a realização das sínteses subsequentes (dos péptidos 3A e 3B, e dos seus conjugados), escolheu-se o método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio de ultrassons. Para a síntese do péptido 3A (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY), foram realizadas duas tentativas: a primeira com um suporte polimérico MBHA Rink Amide, e a segunda com a resina NovaPEG Rink Amide. No primeiro procedimento (com MBHA Rink Amide), a síntese foi terminada. No entanto, após análise com RP-HPLC analítico (ver figura 4.4), verificou-se que mesmo que o péptido tivesse sido sintetizado, que o processo foi concluído com um rendimento muito baixo. Visando otimizar a síntese do péptido 3A, optou-se por utilizar, numa segunda instância, um novo suporte polimérico com um maior loading (LoadingMBHA= 0.38 mmol/g versus LoadingNovaPEG = 0.47 mmol/g). Durante a síntese com a nova resina, verificou-se que nos primeiros 12 aminoácidos os acoplamentos foram mais rápidos. Contudo, ao acoplar a segunda arginina do péptido (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY), decidiu-se dar como terminado o procedimento, dado que o tempo de acoplamento ultrapassava 8 h. Tendo chegado a um impasse, optou-se por realizar as sínteses dos péptidos 3A e 3B, consecutivamente, pelo método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio a micro-ondas. Por fim, os péptidos foram sintetizados por este método, com um rendimento moderado (53% para 3A, e 47% para 3B). Após purificação por RP-HPLC semi-preparativo, procedeu-se ao acoplamento do linker (PEG2) e do quelante bifuncional (NODAGA), seguindo o método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio a ultrassons. Subsequentemente, realizou-se a clivagem dos péptidos, purificação, e por fim, espectrofotometria UV-Vis para determinação de concentrações, em preparação para radiomarcação. Durante o procedimento de espectrofotometria UV-Vis, verificou-se que o péptido precipitava subitamente e frequentemente, a temperatura ambiente. O baixo rendimento da primeira síntese, e uma precipitação súbita a temperatura ambiente durante, levou a atribuir ao péptido 3A uma tendência a agregar, característica de péptidos com certas sequências. Apesar de não ter sido realizada uma análise detalhada a tal fenómeno, adotaram-se medidas preventivas, tal como a adição de uma pequena quantidade de ácido trifluoracético à solução durante UV-Vis, e realização da técnica flash freeze após cada utilização do péptido. A dificuldade em manusear o péptido 3A e o seu conjugado, tornou-se especialmente evidente durante a radiomarcação com 67Ga, a qual em condições standard se mostrou como uma impossibilidade. Devido a restrições de tempo, não foi possível realizar a otimização do processo de síntese dos péptidos 3A e 3B, bem como dos correspondentes conjugados, em quantidades suficientes para se fazerem estudos de otimização da radiomarcação. Como tal, tomou-se a decisão de suspender a utilização dos mesmos na fase final do projeto, até que as metodologias fossem revistas e otimizadas, processo esse que se encontra de momento a ser realizado. Para além deste trabalho experimental de síntese, procedeu-se paralelamente à validação do equipamento pré-clínico de imagem FLEXTM TriumphTM micro-PET-SPECT-CT, recentemente adquirido e instalado no C2TN-IST. O processo de validação envolveu duas fases, tendo-se iniciado com a utilização de diversos fantomas, tais como tubos de Eppendorf e seringas contendo soluções radioactivas. Este trabalho preparatório culminou numa segunda fase, na aquisição de uma imagem SPECT-CT de ratinhos com tumor (Balb/c com xenotransplantes celulares PC-3 de adenocarcinomas da próstata de origem humana) após administração localizada de nanopartículas radiomarcadas com 67Ga ( 67Ga-AuNP-BBN-Pt1). Os resultados das imagens pré-clínicas adquiridas (figuras 4.25 e 4.26) mostram uma diferença substancial na migração do composto 24 h p.i, que parece fixar-se durante um longo período (> 24 h) no tumor.O trabalho descrito nesta dissertação, teve como objetivo a síntese de um péptido e a sua conjugação a um agente quelante bifuncional, visando a sua marcação radioativa com 67Ga e posterior avaliação da sua biodistribuição em ratinhos por imagiologia pré-clínica multimodal FLEXTM TriumphTM microPET-SPECT-CT. Em simultâneo, pretendeu-se validar e calibrar o equipamento pré-clínico multimodal micro-PET-SPECT-CT recentemente adquirido pelo C 2TN-IST. Uma vez que não foi possível a aquisição de imagens nucleares com radiopéptidos inicialmente propostos, em alternativa, e após validação do equipamento, fez-se um estudo imagiológico de nanopartículas radiomarcadas com 67Ga ( 67Ga-AuNP-BBN-Pt1), em ratinhos Balb/c com xenotransplantes celulares PC-3 de adenocarcinomas da próstata de origem humana. Em conclusão, pode dizer-se que o trabalho experimental realizado contemplou a utilização de inúmeras diferentes técnicas e metodologias, englobando diversos métodos de síntese peptídica em fase sólida, purificação, técnicas de radiomarcação e muito mais. Adicionalmente, foram também realizadas aquisições e tratamentos de imagens multimodais SPECT-CT de modelos animais. Esta abrangência permitiu ao mestrando tomar contacto com muitos aspetos essenciais da Medicina Nuclear, mais especificamente com os relacionados com a radioquímica farmacêutica e equipamento de imagiologia pré-clínica

Mechanical Impacts of Embedded Fibre Optics in 3D Printed Structures via Fused Deposition Modelling

This project explores the mechanical effects of embedded optical fibres in additively manufactured structures using the fused deposition modelling method. The aim is to develop a new and broad understanding of the effects these fibres have on the tensile and flexural properties of 3D printed polylactic acid. The bonding strength between the fibre and matrix material is also investigated by way of a fibre pull-out test. Micro-CT X-ray scanning is also used to visualise the internal structures of printed specimens and how different printing parameters; specifically infill pattern and infill density, impact the quality of the embedded fibre. Infill patterns cubic, grid and triangles were examined as plain samples without fibre at low, medium, high, and maximum density. Triangle infill was chosen to be the underlying infill pattern for samples containing fibre. A concentric infill was also selected to see behaviours when infill raster lines are coaxial to an embedded optical fibre. Manual fibre laying was found to be the most suitable method for producing fibre samples. Fibre sample variables were devised to investigate how different print settings may alter the quality of fibre embedding and mechanical properties. These included: adding extra material around the fibre, rotating the fibre, and altering the direction of raster lines over a central fibre. The type of buffer coating the optical fibre was also altered for micro-CT imaging and fibre pull-out testing. It was found that, in most cases, a single embedded optical fibre improves tensile and flexural mechanical properties

The Fra Allergens and their Role in the Control of Flavonoid Biosynthesis in Strawberry Plants

La fresa (Fragaria xananassa) es un fruto altamente consumido y apreciado por su delicado sabor, aroma y valor nutritivo (Tulipani et al., 2008; Giampieri et al., 2012). El cultivo de fresa se ha extendido por todo el mundo ocupando en la actualidad una superficie de 254.000 hectáreas y una producción aproximada de 4 millones de toneladas con una distribución global del 42.8%, 29.2%, 18.4%, 8.8% and 0.8% en América, Europa, Asia, África y Oceanía, respectivamente (FAOSTAT, 2012; http://faostat3.fao.org). España ocupa el primer lugar mundial dentro de los exportadores de fresas y el cuarto en relación a producción (FAOSTAT, 2012), siendo la provincia de Huelva, comunidad autónoma de Andalucía, el principal productor, en donde se concentra aproximadamente el 95% de la producción nacional. España ocupa un puesto privilegiado no sólo en producción sino también en exportación y desarrollo de programas de mejora de variedades, lo que genera retornos importantes tanto en la comercialización de fruta en fresco como los generados por "royalties". En los últimos años, los programas de mejora se han centrado en caracteres tales como productividad y morfología, entre los que destacan el tamaño de fruto, la dureza y el color. Sin embargo, en la actualidad el consumidor está demandando frutos con mayor valor en compuestos saludables (conocidos como nutracéuticos) debido a los efectos beneficiosos de éstos en la salud, lo que influye en toda la cadena de distribución y producción. Este hecho ha producido un giro en la selección de nuevas variedades buscando, además de los aspectos agronómicos, una mejora en la calidad organoléptica y nutricional. Estos esfuerzos buscan, entre otras cosas, un incremento en la sostenibilidad y competitividad de este cultivo en España, que le permita seguir liderando las exportaciones y e incrementando su producción. En este escenario, nuestro grupo lleva varios años liderando proyectos de investigación basados tanto en la identificación de genes implicados en la regulación del desarrollo y maduración del fruto de fresa como en la caracterización de herramientas biotecnológicas dirigidas a la mejora de dichos frutos. Uno de los principales intereses del grupo y objetivo de esta tesis doctoral, es el estudio y determinación de la función biológica de los alérgenos Fra de fresa (Fragaria xananassa), que se sabe están involucrados en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides (Muñoz et al., 2010). Los flavonoides son compuestos que, además de ser responsables del color y aroma del fruto de fresa (Fait et al., 2008; Muñoz et al., 2011), son actualmente de gran interés biotecnológico debido a las propiedades nutricionales, farmacéuticas y medicinales que presentan para el consumo humano (Hichri et al., 2011; Giampieri et al., 2013). La identificación de estos alérgenos fue resultado de los estudios de Emanuelsson y colaboradores que, motivados por la observación de que ciertas variedades blancas de fresa eran bien toleradas por individuos que presentaban reacciones alérgicas a variedades rojas, realizaron un estudio proteómico de variedades comerciales de ambos tipos de frutos (Karlsson et al., 2004; Hjerno et al., 2006). Finalmente, pusieron de manifiesto que las variedades blancas de fresa presentaban un contenido en la proteína FaFra1, potencial alérgeno de fresa, significativamente inferior al de las variedades rojas. Posteriormente, en nuestro laboratorio se identificaron dos genes codificantes de nuevas isoformas del alérgeno Fra (FaFra2 y FaFra3) y se estableció una relación entre la expresión de dichos genes y la ruta de biosíntesis de flavonoides que sugería un papel regulador de las proteínas FaFra en esta ruta biosintética (Muñoz et al., 2010). Las proteínas Fra de fresa pertenecen a la familia de proteínas PR-10 ("pathogenesis-related 10 proteins"), denominadas de esta forma por su relación con la respuesta de las plantas frente a patógenos (Markovic-Housley et al., 2003). A su vez, las proteínas Fra, también forman parte de la superfamilia de proteínas Bet v 1, cuyo principal representante es el alérgeno del polen de abedul (que da nombre al grupo), y que engloba una variedad de alérgenos, no sólo de polen, sino también de frutas y alimentos (Markovic-Housley et al., 2003; Fernandes et al., 2013). Sin embargo, aunque las propiedades alergénicas de este tipo de proteínas han sido ampliamente estudiadas, sus funciones y mecanismos de actuación en las plantas que las producen permanecen prácticamente desconocidos (Mogensen et al., 2007). Para investigar la función biológica desempeñada por los alérgenos FaFra en el fruto de fresa y poder establecer el papel que estas proteínas juegan en la regulación de la biosíntesis de flavonoides y, finalmente, obtener información sobre la funcion de las proteínas de tipo PR-10 ampliamente distribuidas en el reino vegetal, en este trabajo se abordaron los siguientes objetivos: I. Caracterización de la familia multigénica Fra de fresa (Fragaria xananassa), para profundizar en el estudio de su efecto en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides. II. Búsqueda de potenciales ligandos naturales de las proteínas FaFra mediante el empleo de técnicas bioquímicas y biofísicas. III. Análisis estructural de las proteínas FaFra para obtener detalles sobre su mecanismo de actuación a nivel molecular. INTRODUCCIÓN La Fresa La fresa pertenece a la familia Rosaceae y al género Fragaria. En Fragaria, existen cuatro grupos básicos de fertilidad que se asocian principalmente con el número de ploidía o número de cromosomas. La especie silvestre más común, F. vesca L., presenta 14 cromosomas, es diploide y sirve de modelo experimental para el género (Shulaev et al., 2011). La fresa cultivada es, sin embargo, una especie octoploide de 56 cromosomas que procede del cruce de las especies F. chiloensis y F. virginiana, ambas especies octoploides (Rousseau-Gueutin et al., 2009). Uno de los cultivares más ampliamente extendido en todo el mundo es “Camarosa”, ideal para inviernos suaves, como es el caso de Huelva en España. Siendo esta la variedad donde hemos realizado mayoritariamente nuestras investigaciones. De forma general, los frutos pueden clasificarse como climatéricos o no-climatéricos en función del patrón de respiración y la producción de etileno que tienen lugar a lo largo del proceso de maduración (Grierson, 2013). El fruto de fresa sirve como modelo para el estudio de los frutos no-climatéricos; en estos, no se observa un aumento drástico en la tasa de respiración durante la maduración ni tampoco una elevada producción de etileno (Iannetta et al., 2006). La fresa es, además, un fruto muy particular ya que, a diferencia de otros frutos botánicamente definidos como resultado de la expansión del ovario, la fresa es en realidad un receptáculo floral engrosado, compuesto de una médula central o corazón, un receptáculo carnoso, la epidermis y un conjunto de haces vasculares que conectan los aquenios, que son los verdaderos frutos de la fresa. Los aquenios, que son una combinación de tejido del ovario y de la semilla y se originan en la base de cada pistilo, se disponen de forma helicoidal en la superficie del fruto y se encuentran insertados en la capa epidérmica del receptáculo (Perkins-Veazie, 1995). Todo esto hace que el estudio del fruto de fresa sea especialmente interesante tanto desde el punto de vista genético como fisiológico. Composición Fenólica del Fruto de Fresa La fresa se caracteriza por ser un fruto con un alto contenido en metabolitos secundarios, muchos de ellos considerados como compuestos “bioactivos”, ya que se ha demostrado que presentan efectos beneficiosos para la salud humana (Diamanti et al., 2012; Giampieri et al., 2013). En particular, las fresas son ricas en minerales, vitamina C, folato y compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos no sólo poseen propiedades antioxidantes y anti-carcinogénicas (Scalzo et al., 2005, Tulipani et al., 2008; Giampieri et al., 2013) sino que además, juegan un papel esencial en la biología del fruto, puesto que no sólo son los principales responsables del color y sabor de la fresa, sino que también desempeñan funciones tan importantes como la defensa frente a patógenos y a condiciones ambientales adversas, como puede ser la exposición a la radiación ultravioleta (Aaby et al., 2005, 2007). Los compuestos fenólicos se sintetizan a partir de L-fenilalanina a través de las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides y flavonoides (Tohge et al., 2013). Entre la gran variedad de compuestos fenólicos presentes en la fresa, los mayoritarios son los flavonoides. La síntesis de estos compuestos tiene lugar en dos fases durante el desarrollo del fruto de fresa, lo cual está íntimamente relacionado con la función que cada uno de estos metabolitos desempeña a lo largo de la maduración (Halbwirth et al., 2006; Aaby et al., 2007; Fait et al., 2008). Durante las primeras etapas del desarrollo del fruto, los flavonoides principalmente acumulados en la fresa son de tipo flavan-3-ols y proantocianidinas; estos metabolitos, son responsables del sabor astringente de los frutos inmaduros. En las etapas más tardías del desarrollo, cuando el fruto comienza a madurar, se incrementa la síntesis de otros compuestos flavonoides, entre ellos, antocianinas y flavonoles, que contribuyen a la coloración de frutos y flores (Halbwirth et al., 2006, Fait et al., 2008). Las antocianinas son, cuantitativamente, los polifenoles más importantes en el fruto de fresa maduro y están principalmente representados por derivados glucosilados de pelargonidina y cianidina; estos metabolitos son los pigmentos que confieren a la fresa su color característico (Tulipani et al., 2008; Muñoz et al., 2011). De este modo, la composición fenólica de la fresa no sólo afecta a su valor nutricional sino también a la calidad final del fruto, lo que actualmente se traduce en la existencia de muchas líneas de investigación enfocadas al estudio del desarrollo y maduración del fruto de fresa, incluyendo la síntesis de flavonoides, lo que hace que éste sea un ámbito científico muy relevante. Proteínas PR-10 Las proteínas relacionadas con patogénesis PR ("Pathogenesis-Related proteins") están ampliamente distribuidas en el reino vegetal y se clasifican en 17 familias (PR1-PR17) en función de su estructura primaria y las propiedades biológicas y bioquímicas que presentan (van Loon et al., 2006; Sels et al., 2008; Fernandes et al., 2013). En un inicio, las proteínas PR se clasificaron en base a la respuesta que inducían frente a patógenos. Sin embargo, más tarde, este término se amplió y se incluyeron en esta familia aquellas proteínas no sólo relacionadas con la defensa a patógenos, sino también aquellas relacionadas con la respuesta a condiciones que mimetizaban el efecto frente a agentes patogénicos, como el estrés abiótico o el daño mecánico (Sels et al., 2008; Lebel et al., 2010). A pesar de que la familia de proteínas PR ha sido ampliamente estudiada, la función de la mayoría de ellas sigue siendo desconocida y, en particular, el papel biológico de las proteínas PR-10 no está bien definido. Entre las proteínas de tipo PR-10 se encuentra un grupo de alérgenos que pertenece a la superfamilia de proteínas Bet v 1 (Markovic-Housley et al., 2003). Las proteínas Bet v 1 se caracterizan por presentar una estructura muy conservada que encierra una cavidad central que es capaz de unir ligandos hidrofóbicos (Mogensen et al., 2002; Markovic-Housley et al., 2003; Seutter von Loetzen et al., 2013). Actualmente en fresa se conocen tres miembros de la familia Bet v 1: FaFra1, FaFra2 y FaFra3 (Hjerno et al., 2006; Muñoz et al., 2010). Se sabe que las proteínas FaFra están relacionadas con la formación de compuestos coloreados en la fresa (Muñoz et al., 2010), lo que principalmente depende de la producción de ciertos flavonoides como el cianidin-3-O-glucósido y el pelargonidin-3-O-glucósido. Estudios previos desarrollados en nuestro laboratorio (Muñoz et al., 2010), permitieron establecer una relación directa entre las proteínas FaFra y la ruta de biosíntesis de flavonoides. El silenciamiento transitorio (mediado por RNAi) de los genes FaFra en frutos de fresa (cv. Elsanta), puso de manifiesto que el contenido de aquellos metabolitos responsables del color del fruto (cianidin-3-O-glucósido y pelargonidin-3-O-glucósido) se veía reducido en los frutos silenciados. Además de la acumulación de estos compuestos, también se vio afectada la de otros como el kaempferol-3-O-glucósido y el pelargonidin-3-malonil-glucósido que mostraron niveles reducidos en comparación a los frutos control. Sin embargo, no sólo se observó la disminución en la acumulación de estos compuestos sino que también otros metabolitos, como la catequina y ciertas proantocianidinas, aumentaron sus niveles en los frutos silenciados (Muñoz et al., 2010). De forma paralela, se observó que el silenciamiento de los genes FaFra tenía un efecto a nivel transcripcional sobre genes fundamentales de la ruta de biosíntesis de flavonoides, específicamente, fenilalanin-amonio-liasa (PAL) y chalcona sintasa (CHS) aparecían co-silenciados junto a los alérgenos FaFra (Muñoz et al., 2010). Estos resultados indicaban la posibilidad de un papel regulador de las proteínas FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides. Sin embargo, se carece de información sobre el mecanismo molecular por el cual estas proteínas podrían estar ejerciendo su función. La estructura conservada de las proteínas PR-10 y su habilidad para unir distintos tipos de ligandos en su cavidad hidrofóbica central indican que la función de la proteínas FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides podría estar íntimamente relacionada con su unión a un compuesto flavonoide y que, cabría la posibilidad de que cada uno de los miembros de la familia pudiesen unir distintos intermediarios de la ruta. Debido a la presencia de cavidades conservadas en las proteínas PR-10 y su capacidad de unir ligandos, se han propuesto varias funciones para esta familia de proteínas y, en particular para las proteínas de la familia Bet v 1, se han planteado principalmente dos posibilidades: un posible papel como transportadores celulares de metabolitos y una posible función como componentes esenciales en cascadas de señalización (Mogensen et al., 2002; Liu y Ekramoddoullah, 2006; Radauer et al., 2006; Mogensen et al., 2007). Mediante la caracterización de la familia multigénica FaFra y el estudio bioquímico, biofísico y estructural de las proteínas FaFra en presencia y ausencia de intermediarios de la ruta de biosíntesis de flavonoides, este trabajo tiene como objetivo principal aclarar el papel de las proteínas FaFra de fresa en la regulación de la ruta de biosíntesis de antocianos. Este trabajo debería también contribuir al el entendimiento general del la función biológica de las proteínas PR-10, que se encuentran ampliamente distribuidas en el reino vegetal. RESULTADOS Y DISCUSIÓN I. Caracterización de la Familia Multigénica Fra de Fragaria xananassa Recientemente ha sido publicado el genoma de la especie Fragaria vesca (F. vesca) que sirve como modelo para el género Fragaria (Shulaev et al., 2011). Esto ha generado un conjunto de herramientas muy valiosas que, en nuestro caso, han sido muy útiles para profundizar en el estudio de la familia de genes Fra de Fragaria xananassa (FaFra). Por otro lado, los grandes avances alcanzados en los últimos años en el campo de la secuenciación masiva de RNA (RNA-Seq), han hecho que el RNA-Seq se haya convertido en un método muy efectivo para obtener grandes cantidades de datos transcriptómicos de muchos organismos y distintos tipos de tejidos y que, además, se considere como una potente herramienta para estimar tanto la abundancia de los genes expresados en una circunstancia determinada como su expresión diferencial en distintas condiciones de estudio (Grabherr et al., 2010; Trapnell et al., 2010). En base a estos avances científicos y tecnológicos y para caracterizar la familia multigénica FaFra, se plantearon dos estrategias metodológicas principales, ambas basadas en la secuenciación masiva de RNA mensajero (RNA-Seq) extraído de plantas de fresa. La primera de ellas tenía como objetivos principales la identificación de las secuencias FaFra expresadas en fresa y la determinación de sus perfiles de expresión. Para ello, se recurrió a una experiencia de RNA-Seq que nuestro laboratorio ha desarrollado en plantas pertenecientes al cultivar Camarosa, no solo a lo largo de la maduración de los frutos de fresa en los estadios verde, blanco, viraje blanco-rojo y rojo (en aquenios y receptáculos por separado) sino también en tejidos vegetativos (hoja y raíz). El análisis de datos de RNA-Seq puede llevarse a cabo mediante dos metodologías principales: 1) Alineamiento de las lecturas a un genoma de referencia; 2) Ensamblado del transcriptoma de novo (Martin et al., 2013). Aunque el genoma de la especie F. vesca (diploide) sirve de modelo para el género Fragaria, y el genoma de la especie cultivada Fragaria xananassa (octoploide) presenta un alto grado de conservación con el de la especie salvaje (Bombarely et al., 2010), el hecho de que el genoma de F. vesca es aún incompleto y su anotación necesita mejoras, nos llevó a analizar los datos de RNA-Seq de nuestra experiencia de maduración y tejidos vegetativos de fresa utilizando un ensamblado del transcriptoma de novo, utilizando el método Trinity (Grabherr et al., 2010). El análisis del transcriptoma realizado por nuestro grupo, en colaboración con el Dr. José. F. Sánchez Sevilla del centro IFAPA de Churriana (Málaga), ha permitido obtener una ingente cantidad de datos de expresión de genes. El análisis de los datos de RNA-Seq ha resultado en la identificación de 10 genes putativos principales que conforman la familia Fra (Fragaria xananassa) y ha permitido establecer sus correspondientes homólogos en F. vesca. Los genes FaFra, se han nombrado de forma consecutiva desde FaFra1 a FaFra10 (Tabla 1, Figuras 4-8, Capítulo 1). Además, se han identificado variedades alélicas para muchos de ellos, en particular, FaFra1c1-c2, FaFra2b, FaFra4a1-a2 y FaFra4b1-b2, FaFra7a-b y FaFra9a1-a2. A su vez, las proteínas FaFra se han clasificado en cuatro grupos principales, de acuerdo a su nivel de homología con los alérgenos FaFra1, FaFra2 y FaFra3 previamente publicados (Muñoz et al., 2010); el cuarto grupo, sin embargo, engloba las secuencias FaFra8, FaFra9 y FaFra10 que conforman el conjunto más divergente de proteínas FaFra (Figuras 9 y 10, Capítulo 1). Adicionalmente, se ha obtenido información detallada sobre los niveles de expresión de los genes FaFra tanto en tejidos vegetativos de fresa como a lo largo de los estadios de maduración del fruto, siendo los niveles de mensajeros observados distintos para cada una de los genes identificados. De forma general, los transcritos más representados corresponden a los genes FaFra1c1, FaFra1c2, FaFra2b y FaFra4a1 (Tabla 2, Figura 11-12, Capítulo 1). El tejido donde la expresión de FaFra resultó ser más importante fue la raíz, seguido de receptáculo, donde los genes más representativos fueron FaFra1c1 y FaFra2b; estos genes, mostraron perfiles de expresión complementaria ya que, mientras que FaFra1c1 disminuía a lo largo de maduración, FaFra2b aumentaba su expresión (Figura 11d, Capítulo 1). Además, los niveles de expresión de estos genes, se corresponden con los niveles de proteína observados mediante Western-blot en los frutos de fresa (Figura 3, Capítulo 1). La segunda experiencia de RNA-Seq, se diseñó con el fin de identificar aquellos genes que se expresaban de forma diferencial en receptáculos control y receptáculos donde se había silenciado de forma transitoria los genes FaFra inyectados con soluciones de Agrobacterium tumefaciens portadoras de construcciones RNAi del gen diana (Hoffmann et al., 2006; Muñoz et al., 2010). En este caso, el análisis de datos de RNA-Seq se llevó a cabo mapeando las lecturas obtenidas al genoma de referencia F. vesca utilizando los programas TopHat2 para el mapeado de secuencias (Kim et al., 2013) y Cufflinks para la cuantificación de lecturas y determinación de la expresión diferencial de genes entre los frutos control y los frutos Fra-RNAi silenciados (Trapnell et al., 2012). Como resultado, 4426 genes se vieron afectados, de los cuales 2528 resultaron sobre-expresados y 1898 reprimidos. Enfocando nuestra atención en la familia de genes Fra y en los genes involucrados en la biosíntesis de flavonoides, concluimos que el silenciamiento de FaFra2A (principal gen FaFra en receptáculo rojo) y FaFra6, afectaba a genes primordiales de la ruta de biosíntesis de flavonoides tales como fenilalanina-amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS), cinamato-4-hidroxilasa (C4H), 4-cumarato-CoA-ligasa (4CL), chalcona isomerasa (CHI), dihidroflavonol-reductasa (DFR), flavanona-3-hidroxilasa (F3H) y 3-O-glucosiltransferasa (3-GT), algunos de los cuales se verían sobre-expresados y otros silenciados, siendo los reprimidos los más importantes en cuanto a expresión en receptáculo. Asimismo, los factores de transcripción de tipo R2R3-Myb, FaMYB1 y FAMYB10, aparecieron co-silenciados junto a FaFra2A y FaFra6. Nuestros resultados, de este modo, confirman el papel esencial regulador que ejercen los genes FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides. Finalmente, para obtener información sobre la localización subcelular de las proteínas FaFra, se llevaron a cabo ensayos de microscopía confocal en plantas de Nicotiana benthamiana (expresión transitoria) y de Arabidopsis thaliana (generación de líneas transgénicas) expresando proteínas FaFra a fusionadas a la proteína GFP (Fra-GFP). Los ensayos de localización subcelular de las prote

Improved micro-contact resistance model that considers material deformation, electron transport and thin film characteristics

This paper reports on an improved analytic model forpredicting micro-contact resistance needed for designing microelectro-mechanical systems (MEMS) switches. The originalmodel had two primary considerations: 1) contact materialdeformation (i.e. elastic, plastic, or elastic-plastic) and 2) effectivecontact area radius. The model also assumed that individual aspotswere close together and that their interactions weredependent on each other which led to using the single effective aspotcontact area model. This single effective area model wasused to determine specific electron transport regions (i.e. ballistic,quasi-ballistic, or diffusive) by comparing the effective radius andthe mean free path of an electron. Using this model required thatmicro-switch contact materials be deposited, during devicefabrication, with processes ensuring low surface roughness values(i.e. sputtered films). Sputtered thin film electric contacts,however, do not behave like bulk materials and the effects of thinfilm contacts and spreading resistance must be considered. Theimproved micro-contact resistance model accounts for the twoprimary considerations above, as well as, using thin film,sputtered, electric contact