Analyse der Struktur, Funktion und Evolution der Astacin-Protein-Familie

Astacin (E.C. 3.4.24.21) aus dem Magen des Flusskrebses Astacus astacus ist der Prototyp einer Familie von Zink-Endopeptidasen, deren Mitglieder bei Vertebraten, Invertebraten und Bakterien gefunden werden. Bei dem Nematoden Caenorhabditis elegans konnte die überraschend große Zahl von 40 Astacin-homologen Genen identifiziert werden. Eine Transkriptom-Analyse ergab, dass mit Ausnahme eines Pseudogens alle anderen Astacine tatsächlich exprimiert werden. GFP-Reporter-Proteine zeigten für zwei Astacine eine Verdauungsfunktion und eine entwicklungsrelevante Rolle. Bei einer Proteom-Analyse durch 2D-Elektrophorese konnten neue Proteine der C. elegans Proteinkarte zugeordnet werden. Bei dem Modellorganismus Hydractinia echinata konnten zwei neue Astacin-homologe Gene charakterisiert werden, die als HEA-1 und HEA-2 bezeichnet wurden. In situ Hybridisierungen deuten eine Rolle bei der Kopfbildung und bei der Differenzierung von Tentakelzellen an. Durch BLAST- und FASTA-Suchen in den Datenbanken konnten insgesamt 106 verschiedene Astacin-homologe Proteine gefunden werden. Die phylogenetische Analyse und die Analyse der Domänenstruktur ließen ein allgemeines Evolutions-Prinzip erkennen, wonach die katalytische Kette des Astacins nach Anhängung von regulatorischen Einheiten als ein Modul in unterschiedlicher Umgebung und mit neuen Funktionen eingesetzt werden kann. Weiterhin erlaubte die Stammbaum-Analyse eine Einteilung der Astacine in mehrere phylogenetische Gruppen. Als Modellprotein für die Untersuchung des Aktivierungsmechansimus von Pro-Astacinen wurde das Flusskrebs-Astacin verwendet. Die immunhistochemischen, proteinbiochemischen und die massenspektrometrischen Untersuchungen von Substrat-Peptiden zeigten, dass Pro-Astacin in Astacus astacus autokatalytisch im proximalen Bereich des Hepatopankreas vor Übertritt in den Magen aktiviert wird. Darüber hinaus konnte auch gezeigt werden, dass die Mehrzahl der Pro-Astacine ebenfalls autokatalytisch aktiviert werden kann

Annotation und Klassifikation nuklearer Domänen

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Großteil aller nuklearen Proteine annotiert und klassifiziert. Aus Literatur, Proteinsequenz- und Domänendatenbanken wurden bekannte nukleare Domänen ermittelt, ihre Grenzen unter Zuhilfenahme von Tertiärstrukturen oder Sekundärstrukturvorhersagen bestimmt und multiple Sequenzalignments erstellt. Die handgerfertigten Aligments wurden zur Anfertigung von Hidden Markov Models herangezogen und in das Domänenvorhersageprogramm Simple Modular Architecture Research Tool (Schultz et al. 1998, Schultz et al. 2000) (http://smart.embl-heidelberg.de/) implementiert. Hier sind umfassend Informationen über Literatur, phylogentische Verteilung, Anzahl beteiligter Proteine und Funktion für 164 Domänen (118 entstammen dieser Arbeit) mehr als 35000 Proteine abdeckend zusammengefasst. Aufbauend auf der vollständigen Kollektion nuklearer Proteine wurden ausgewählte nukleare und nicht-nukleare Proteine auf der Grundlage homologiebasierender Sequenzanalyseverfahren untersucht. Die Arbeit führte zur Entdeckung von vier biologisch relevanten neuen Domänen: - L27, eine neue Hetero-Dimer bildende Domäne in den Rezeptor-Targeting-Proteins Lin-2 and Lin-7 (Doerks et al. 2000) - GRAM, eine neue Domäne in Glucosyltransferasen, Myotubularinen und anderen Membran-assoziierten Proteinen (Doerks et al. 2000) - DDT, eine neue DNA-bindende Domäne in unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, Chromosom-assoziierten und anderen nuklearen Proteinen (Doerks et al. 2001) - BSD, eine neue putativ DNA-bindende Domäne in Transkriptionsfaktoren, Synapsen-assozierten und anderen hypothetischen Proteinen (Doerks et al. submitted) Abschliessend erfolgte die automatische Analyse von 24000 nuklearen Proteinen, aus denen 550 hypothetisch neue Domänen hervorgingen. Die intensive Aufarbeitung dieser 550 konservierten Sequenzbereiche erbrachte die Entdeckung von 28 neuen nuklearen oder teilweise nuklearen Domänen unterschiedlicher Speziesverbreitung, Funktion und biologischer Relevanz (Doerks et al. accepted)

Die Co-Evolution der Cytochrom c Reduktase und der mitochondrialen Prozessierungsprotease

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Neurogenese in Zentralen Nervensystem der Wirbeltiere – Molekulare Mechanismen zur regionsspezifischen Expression von neurogenin1 im Embryo des Zebrafischs Danio rerio

Während der Embryonalentwicklung von Vertebraten kontrollieren drei hoch konservierte Enhancer die raumzeitliche Expression orthologer neurog1-Gene. In Anamniota wie dem Zebrafisch wird die Transkription des proneuralen Gens nach Bildung der Neuralplatte durch zwei dieser cis-regulatorischen Elemente gesteuert. Transgenanalysen zeigen, dass der distale LSE-Enhancer neurog1 im Telencephalon und der proximale LATE-Enhancer im Diencepha-lon der Gehirnanlage aktiviert (Blader et al., 2003). Pax6 aktiviert die diencephale neurog1-Expression durch direkte Interaktion mit LATE, und es wird vermutet, dass diese Interaktion zur Kooption von neurog1 im lateralen Telencephalon der Maus und damit zur Evolution des Neocortex in Amniota entscheidend beigetragen hat. Jedoch müssen andere mit Pax6 kooper-ierende Faktoren an diesem Prozess beteiligt sein, einerseits, weil neurog1 in anderen Regio-nen auch unabhängig von Pax6 exprimiert wird, andererseits, weil Pax6 allein zur neurog1-Aktivierung nicht ausreicht, etwa im Telencephalon des Zebrafischs (Blader et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und wie weitere Transkriptionsfaktoren (TFs) in die Regulation der regionsspezifischen neurog1-Expression im Diencephalon des Zebra-fischs durch Interaktion mit dem LATE-Enhancer involviert sind. Eine Kombination aus Sequenzanalyse, Mutationsanalyse mit Reportertransgenen und Koexpressionsanalyse poten-tieller TF-Kandidaten weist auf eine Beteiligung von Homeodomänen-TFs der POU-Klasse (POU-TFs) an der LATE-vermittelten Regulation von neurog1 hin: Bioinformatische Analysen identifizieren POU-Bindestellen im stromabwärts der Pax6-Bindestelle benachbarten und in Vertebraten vollkommen konservierten LATE-Fragment, die selektiv mit rekombinantem Pou50-Protein physisch interagieren. Deletion dieses Fragments im LATE-Reporter induziert ektopische Transgenaktivität spezifisch im Telencephalon, was beweist, dass die anzestrale LATE-Funktion nicht auf diencephale Aspekte der neurog1-Expression beschränkt ist. LATE kooperiert hierbei mit dem LSE-Enhancer. Eine eigens für die Koexpressionsanalyse entwickelte Methode zur virtuellen 3D-Visualisierung von Genaktivitäten konnte nachweisen, dass in der ektopischen Transgendomäne neurog1, Pax6 und POU-TFs koexprimiert sind. Überdies kann die ektopische Transgen- und endogene neurog1-Aktivität spezifisch im Telencephalon durch HDAC-Inhibition reproduziert bzw. verstärkt werden. Die präsentierten Daten zeigen eindeutig, dass LATE ein direktes Ziel nicht nur positiv, sondern auch negativ regulierender Signale darstellt, und weisen darauf hin, dass neben transkriptioneller Aktivierung durch Kooption auch die Aufhebung transkriptioneller Repression für die Evolution des Neocortex entscheidend war

Analyse des Genoms von Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum ist eine soziale Amöbe, deren Eigenschaften sie zu einem Model für verschiedene zelluläre Prozesse gemacht haben. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Analyse des Genoms dieses meist einzelligen Protisten und wertet die herausragendsten Erkenntnisse aus der Analyse aus. Einige Eigenschaften des Genoms sind ungewöhnlich, wie z.B. der hohe anteil an A und T Nukleotiden oder auch die Organisation der chromosomenenden, der Telomere. Andererseits sind in diesem Organismus Gene vorhanden, die bis jetzt nur mehrzelligen Tiere zugeordnet wurden. Die Genomanalyse dieses Organismus ist die Grundlage für die weitere Beschäftigung mit diesem Organismus als Modell

Die Entwicklung des Wurzelkortex während der Arbuskulären Mykorrhiza-Symbiose wird durch den neuen GRAS-Transkriptionsfaktor MIG1 kontrolliert

Die Arbuskuläre Mykorrhiza-Symbiose ist die erfolgreichste Pflanzen-Mikroben Interaktion unter Landpflanzen. Für ihre Etablierung sind enorme tranksriptionelle Umprogrammierungen nötig. Durch eine funktionelle Charakterisierung konnte das GRAS-Protein MIG1 als neue Komponente dieser pflanzlichen Transkriptionsmaschinerie identifizieren werden. Zusammen mit DELLA1, einem Repressor des GA-Signalweges, konnte MIG1 eine Funktion im radialen Wachstum kolonisierter Kortexzellen zugewiesen werden

The evolution of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis: investigations in different species belonging to the Boraginaceae

Die Homospermidinsynthase (HSS) katalysiert die erste stoffwechselspezifische Reaktion innerhalb der Pyrrolizidinalkaloidbiosynthese. Während der Angiospermenevolution wurde die HSS aus der Desoxyhypusinsynthase (DHS), einem ubiquitären und hochkonservierten Enzym rekrutiert. Die DHS katalysiert den ersten Schritt der posttranslationalen Aktivierung des eukaryotischen Transkriptionsinitiationsfaktors 5A (eIF5A). Da die PAs innerhalb der Angiospermen ungleichmäßig verteilt nur in einigen Familien vorkommen, sollte die Frage beantwortet werden, ob die HSS aus der DHS während der Angiospermenevolution nur einmal oder mehrmals unabhängig entstanden ist. Identifizierte DHS- und HSS codierende cDNAs einiger Boraginaceae (Cynoglossum officinale, Heliotropium indicum und Symphytum officinale) und der Asteraceae (Petasites hybridus) wurden geklont und in E. coli heterolog expremiert um die Enzymaktivitäten zu bestätigen. Ein phylogenetischer Baum, der aus den entsprechenden HSS- und DHS- kodierenden cDNA-Sequenzen generiert wurde ergab einen monophyletischen Ursprung der HSS innerhalb der Boraginaceae und einen polyphyletischen Ursprung der HSS innerhalb der Angiospermen. Weiterhin konnte erstmalig durch radioaktive Tracerexperimente gezeigt werden, dass auch in den Blättern von Symphytum officinale die PA-Biosynthese möglich ist.In pyrrolizidine alkaloid (PA) biosynthesis, homospermidine synthase (HSS) catalyzes the first pathway specific reaction. HSS was recruited during angiosperm evolution from deoxyhypusine synthase (DHS), an ubiquitous and highly conserved enzyme involved in the first step of the posttranslational modification of the eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A). Because PAs show a scattered occurrence within a few families of the angiosperms I try to answer the question whether the recruitment of HSS from DHS occurred only once or several times independently during angiosperm evolution. Identified cDNAs encoding DHS and HSS from PA-producing plants belonging to the family of the Boraginaceae (Cynoglossum officinale, Heliotropium indicum and Symphytum officinale) and Asteraceae (Petasites hybridus) were cloned and expressed heterologously in E. coli to confirm the enzyme activities. A phylogenetic tree generated with the sequences of the two enzymes indicates a monophyletic origin of HSS within the Boraginaceae and a polyphyletic origin of HSS within the angiosperms. Furthermore biochemical tracer experiments within the Boraginaceae Symphytum officinale showed for the first time that PA-biosynthesis could be possible in the leaves

Identifizierung und Charakterisierung sekretierter Proteine mit Bezug zur Pathogenität in Ustilago maydis

Unter der Vielzahl pilzlicher Moleküle und Faktoren, die sowohl für den Übergang in die parasitäre Phase, als auch für den Befall und das Überleben innerhalb der Wirtspflanze von Bedeutung sind, spielen sekretierte Proteine eine entscheidende Rolle. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung bisher unbekannter, sekretierter Proteine mit Bezug zur Pathogenität in U. maydis und konnte, unter Durchführung experimenteller und bioinformatischer, funktioneller Genomanalysen, erreicht werden

Evolution of specifier proteins in the order Brassicales

Das Glucosinolat-Myrosinase-System ist ein pflanzliches Abwehrsystem der Brassicales. Spezifizierende Proteine sind Teil dieses aktivierten chemischen Abwehrsystems. Bei Gewebeverletzung kommt es zur Hydrolyse der Glucosinolate durch Myrosinasen. Die entstehenden Hydrolyseprodukte lagern sich entweder spontan in toxische, als Abwehrstoffe dienende Isothiocyanate um oder werden durch spezifizierende Proteine in Epithionitrile, einfache Nitrile oder organische Thiocyanate mit weitgehend unbekannter biologischer Funktion umgewandelt. Ziel dieser Arbeit war die Klonierung, Charakterisierung und phylogenetische Analyse spezifizierender Proteine unterschiedlicher Produktspezifität. Durch ein phytochemisches Screening konnten von Isothiocyanaten abweichende Hydrolyseprodukte in 14 Spezies der Brassicaceae sowie in einer Spezies der Tropaeolaceae nachgewiesen werden. Ergänzend zu acht bekannten spezifizierenden Proteinen konnten Full-length cDNAs von drei NSPs, sechs ESPs und zwei TFPs isoliert und die codierten Proteine biochemisch charakterisiert werden. Für die phylogenetischen Analysen standen unter Einbeziehung von drei einer Datenbankrecherche entnommenen und nicht charakterisierten Proteinen 22 Full-length cDNAs und die homologe Sequenz At3g07720 aus A. thaliana zur Verfügung. Die phylogenetischen Stammbäume wurden auf Basis von Nukleotid? und Aminosäuresequenzen mittels verschiedener Verfahren erstellt. Die grundlegend identische Topologie der ermittelten phylogenetischen Stammbäume sowie die Berechnungen von Datenmatritzen für Sequenzdivergenzen und -identitäten als Maß evolutionärer Distanz und die strukturellen Merkmale der spezifizierenden Proteine bestätigen At3g07720 als Vertreter einer Gruppe von Vorläuferproteinen der spezifizierenden Proteine. Ausgehend von At3g07720 und homologen Sequenzen entwickelten sich die NSPs des AtNSP5-Clusters. Eine Aufsplittung dieser NSPs führte zu den NSPs des AtNSP1-Clusters. Eine Duplikation der NSPs des AtNSP1-Clusters führte dann zu den ESPs des ESP/TFP-Clusters. Die Auffächerung der ESPs konnte auf einen Zeitpunkt nach der Auffächerung der Kerngruppe der Brassicaceae in die Abstammungslinien I und II geschätzt und die vorausgehende Genduplikation auf ein Alter von mindestens 35,6 Mill. Jahre datiert werden. Die weitere Evolution ergab eine zweifach unabhängige Entstehung von TFPs ausgehend von ESPs, welche nach der Auffächerung der Kerngruppe der Brassicaceae in die Abstammungslinien stattgefunden haben muss.The glucosinolate-myrosinase system of the Brassicales is a plant defense system. Specifier proteins are part of this activated chemical defense system. Upon tissue disruption glucosinolates are hydrolysed by myrosinases. The arising hydrolysis products rearrange spontaneously to form toxic isothiocyanates which serve as defense compounds. In the presence of specifier proteins, epithionitriles, simple nitriles or organic thiocyanates are formed. The biological activity of the alternative products is largely unknown. The aim of this work was the cloning, characterisation and pyhlogenetic analyses of specifier proteins with different product specificities. Based on a phytochemical screening it was possible to detect hydrolyses products others than isothiocyanates in 14áspecies of the Brassicaceae and in one species of the Tropaeolaceae. Additional to the eight already known specifier proteins it was possible to isolate full-length cDNAs of three NSPs, six ESPs and two TFPs and to biochemically characterize the corresponding proteins.For the phylogenetic analyses of the specifier proteins and with comprehension of three not characterized proteins identified in a database, it was possible to include 22 full-length cDNAs and the homologous sequence At3g07720 from A. thaliana. The phylogenetic trees were calculated based on nucleotide and amino acid sequences using different methods. The obtained basal topology was identical for all investigated phylogenetic trees and together with the estimated data for sequence divergences and sequence identities as a measurement for evolutionary distances as well as together with the structural features of the specifier proteins it was possible to confirm At3g07720 as a member of a group of ancestral proteins. Based on At3g07720 and homologs the NSPs of the AtNSP5-cluster have evolved. A split of these NSPs lead to the NSPs of the NSP1-cluster. A following duplication of NSPs of the AtNSP1-cluster caused the ESPs and TFPs of the ESP/TFP-cluster. The expansion of ESPs could be estimated to a point in time after the expansion of the core group of the Brassicaceae in lineage I and lineage II and the preliminary gene duplication could be estimated to date back to at least 35,6 million years ago. The further evolution yielded to a twice independent genesis of TFPs from ESPs which could be dated after the expansion of the core group of the family Brassicaceae in the two lineages I and II

Isolierung, Charakterisierung und phylogenetischer Vergleich von Serpinen basaler Vertebraten

Kutzner TJ. Isolierung, Charakterisierung und phylogenetischer Vergleich von Serpinen basaler Vertebraten. Bielefeld: Universitätsbibliothek; 2013