Interventionsstudie zur Rolle von Isoflavonen im Fettstoffwechsel gesunder postmenopausaler Frauen

In postmenopausalen Frauen (PMF) gehen hormonelle Veränderungen mit charakteristischen Wechseljahrsbeschwerden und Veränderungen der Körperfettverteilung sowie der Lipoprotein- und Serumlipidkonzentrationen einher und stehen in Zusammenhang mit einem gesteigerten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen (KVE). Epidemiologische- und Querschnittsstudien deuten auf ein niedrigeres Risiko für u. a. KVE in PMF aus asiatischen Ländern hin, was mit einem höheren Konsum an Soja und Sojaisoflavonen (IF) in Zusammenhang gebracht wird. IF werden in westlichen Ländern als Nahrungsergänzungsmittel für PMF als Alternative zu einer Hormonersatztherapie postuliert und von vielen Frauen konsumiert. Allerdings sind Studienergebnisse zu Wirkungen der IF z. B. auf die Lipoprotein- oder Serumlipidkonzentrationen oder weitere Risikofaktoren für KVE uneinheitlich. Modulierende Faktoren auf die Wirkungen der IF sind denkbar, welche ursächlich für diese uneinheitlichen Studienergebnisse sein könnten. So erfolgt der Transport der IF zu ca. 50 % an Lipoproteine assoziiert und Lipoproteinprofile können sich in Abhängigkeit des Körperfettgehaltes- bzw. der Körperfettverteilung unterscheiden, sodass ein Zusammenhang zwischen Körperfettgehalt- bzw. Verteilung und IF-Wirkungen angenommen wurde. Ziel der Arbeit war es, einen umfassenden Überblick über die Rolle der IF im Fettstoffwechsel der PMF zu geben. Die 12 wöchige, randomisierte, doppelblinde und Placebo-kontrollierte Studie im Paralleldesign wurde mit 179 gesunden PMF durchgeführt, die 117,4 mg/d IF-Extrakt konsumierten. Untersucht wurde einerseits der Einfluss der Inter-vention auf Serumlipidkonzentrationen und die Expression des LDLR und Scavenger-rezeptors CD36 (CD36) auf den Leukozyten und andererseits, ob modulierende Einflüsse durch den Körperfettgehalt bzw. die Viszeralfettmenge (VAT) oder den Equolbildnerstatus (EBS) auf die Intervention mit IF bestehen. Eine Genexpressionsanalyse in Biopsaten des subkutanen Bauchfettgewebes (SAT) wurde durchgeführt, um differentiell exprimierte Gene des Energie- und Fettstoffwechsels in diesem aufzuzeigen. Zudem wurde untersucht, ob die Intervention sich auf die Körperfettverteilung auswirkt und ob IF und IF-Metabolite im SAT nachgewiesen werden können. Die Intervention erhöhte die LDL-Cholesterolkonzentrationen (LDL-Chol) um ca. 3,4 %. Die weiteren Serumlipidkonzentrationen, die LDLR- und CD36-Expression auf den Leukozyten sowie die Parameter der Körperzusammensetzung wurden durch die Intervention nicht verändert. Ein Effekt des Körperfettanteils- bzw. der Menge an VAT oder des EBS auf die Intervention hinsichtlich der Serumlipidkonzentrationen und der LDLR- und CD36-Expression konnte ebenfalls nicht festgestellt werden. Im SAT waren keine Gene differentiell zwischen der Placebo- und IF-Gruppe exprimiert, auch wenn hier nach der Intervention IF nachzuweisen waren. Interventionsunabhängig kam es durch die Durchführung der Studie in zwei unterschiedlichen Jahreszeiten u. a. zu einem Anstieg der LDL Chol um 3,5 %. Die 12-wöchige Intervention mit IF-Extrakt hatte somit, mit Ausnahme des moderaten Anstiegs der LDL-Chol, keinen Einfluss auf Parameter des Fettstoffwechsels gesunder PMF. Dieser leichte Anstieg kann jedoch dadurch relativiert werden, dass ein Anstieg der LDL-Chol in vergleichbarer Höhe interventionsunabhängig auch allein durch die Durchführung der Studie in einer bestimmten Jahreszeit hätte auftreten können. Auch modulierende Effekte durch den Körperfettgehalt, die Viszeralfettmenge oder den EBS lagen nicht vor. Die Ergebnisse dieser randomisierten, doppelblinden und Placebo-kontrollierten Studie lassen den Schluss zu, dass IF im Fettstoffwechsel PMF eher eine untergeordnete Rolle spielen.The role of isoflavones in lipid metabolism of healthy postmenopausal women - an intervention study Menopause is accompanied by hormonal alterations as well as changes in lipid and lipoprotein metabolism and is furthermore associated with alterations in body fat distribution. These alterations lead to an increased risk of cardiovascular diseases (CVD) in postmenopausal women (PMW). Epidemiological and cross sectional studies indicate lower incidence of CVD and menopausal symptoms in PMW in Asian countries. This is assumed to be associated with a higher amount of soy and soy isoflavones (IF) in Asian diets. In Western countries, IF are over-the–counter supplements and represent a potential alternative to hormone replacement therapies for PMW suffering from menopausal symptoms. However, studies regarding the effects of IF on e.g. lipoprotein or serum lipid concentrations or other risk factors concerning CVD show heterogeneous results. It is conceivable that modulating factors exist, which are responsible for these disparate results. It is known that approx. 50 % of the IF transport is associated with lipoproteins. Lipoprotein profiles can vary due to different body fat contents or body fat compositions. Therefore, a direct interaction between body fat content or the amount of visceral adipose tissue and effects of IF can be assumed. The objective of the presented work was to give a comprehensive overview about the role of IF in the lipid metabolism of PMW. A randomized, double-blind and placebo-controlled study with 179 healthy PMW was conducted over a period of 12 weeks. An over-the-counter IF extract was used as the intervention product with a daily dose of 117.4 mg. Effects of IF on serum lipid concentrations and the expression of LDLR and CD36 receptors on leukocytes were examined. Moreover, a modulating effect of body fat content or rather the amount of visceral adipose tissue (VAT) or the ability to produce equol on effects of IF was investigated. Biopsies of subcutaneous adipose tissue (SAT) were used to perform a gene expression analysis to show differentially expressed genes of lipid and energy metabolism due to the intervention. Furthermore, IF and their metabolites were determined in these samples. Effects of IF on body fat content and body composition were also investigated. An effect of IF on serum lipid concentrations was only shown for LDL-cholesterol concentrations (LDL-chol), which rose around 3.4 % after 12 weeks of IF intervention. No effects were shown for total cholesterol and HDL-cholesterol concentrations. Expression of LDLR and CD36 receptors as well as body composition parameters were not affected through the intervention. The postulated effect of body fat content or rather the amount of VAT on IF effects on serum lipid concentrations and receptor expressions could not be proved. The ability to produce equol did not contribute to potential IF effects in these women compared to women not able to produce equol. In subcutaneous adipose tissue, genes of lipid or energy metabolism were not differentially expressed between the placebo and IF group. However, IF could be found in this tissue after 12 weeks of intervention. As the study was conducted during two different seasons, effects on e. g. LDL-chol occurred independently of the intervention with IF. This seasonal effect increased LDL-chol by 3.5 %. Summarizing the aforementioned results, the intervention with 117.4 mg IF extract per day for 12 weeks did not affect parameters of lipid metabolism in healthy PMW, except for a moderate rise in LDL-chol. A similar increase of LDL-chol can also occur independently of the IF intervention by simply conducting a study in a particular season. Therefore, the moderate effect of IF on LDL-chol can be qualified. A modulating effect of body fat content or rather the amount of VAT regarding IF effects was not observed. It can be concluded that IF only play a minor role in the lipid metabolism of healthy PMW

The role of different GFI1-expressionlevel in the progression of MDS and AML

The presented data of this doctoral thesis suggest that the transcription factor GFI1/Gfi1 plays an important role in the progression and manifestation of AML. AML patients with low GFI1 expression in their blasts showed an inferior prognosis and a shortend EFS and OS. Furthermore, the KD of GFI1 resulted in a block of differentiation in the bone marrow of mice. The KO and the KD of GFI1/Gfi1 lead to an enhanced AML progression in the MLL-AF9 mouse model. In addition, upregulation of Gfi1 resulted in an increase of differentiation of bone marrow cells and a decrease of monocytosis in a persisting AML. It could be shown that the KO of Gfi1 impeded AML progression whereas the KD of GFI1 accelerated AML progression in the NUP98/HOXD13 mouse model. In cooperation with the the IRCM in Canada it could also be shown that H3K9 acetylation at GFI1 target genes is increased in the bone marrow of GFI1-KD-NUP98/HOXD13 mice. Further analysis of gene expression (Gene Set Enrichement Analysis) showed an upregulation of those genes that belong to "cluster 5" which were defined by Valk et al. as a subgroup of AML patients with poor prognosis. These data suggest, that the GFI1-KD-NUP98/HOXD13 mice recapitulate the situation of AML patients with an inferior prognosis very well. Moreover, the essential role of GFI1/Gfi1 for AML progression and manifestation in AML1-ETO9a- and CBFB-MYH1- mouse models could be demonstrated. Furthermore the here depicted results open up new vistas in treating AML patients with epigenetic drugs. As well as in murine as in human leucemic bone marrow cells it could be shown that cells with low GFI1 expression responded better to the treatment with the HATi CTK7a. This could be also confirmed in first in vivo experiments. Taken together, the presented data suggest that GFI1/Gfi1 plays a level- and dose-dependent role in progression of AML in the here used mouse models and that different GFI1/Gfi1 expression levels could be exploited as new prognostic factor in order to establish a new epigenetic therapy for MDS/AML patients

Proteomics in modern toxicology : identification, characterization and prevalidation of protein biomarkers for improved prediction of hepatocarcinogenicity

Die heutige moderne Toxikologie ist dem 3-R-Prinzip (Russel und Burch, 1959), einem Konzept zur Verminderung und Verkürzung von Tierversuchen, verpflichtet. Allerdings stellt insbesondere die für die Zulassung und Registrierung neuer Arzneistoffe oder Chemikalien behördlich geforderte Prüfung von Substanzen auf kanzerogene Eigenschaften immer noch einen langwierigen Prozess mit einem hohen Bedarf an Versuchstieren dar. Daher sollte unter dem Einsatz von Methoden der Proteomforschung eine Identifizierung und Charakterisierung neuer Protein-Biomarker erfolgen, die eine verbesserte Vorhersage von Prozessen der chemisch induzierten Leberkanzerogenese erlauben. Motivation für diese Arbeiten war die Annahme, dass durch chemische Substanzen angestoßene molekulare Prozesse mit proteinanalytischen Methoden früher detektierbar sind als dies mit konventionellen toxikologischen Methoden möglich ist, welche vor allem die Prüfung von Substanzen im Tierversuch mit anschließender histopathologischer und klinisch-biochemischer Bewertung der toxischen Effekte vorsehen. Die Untersuchungen sollten Aufschluss darüber geben, ob Proteomstudien die traditionelle Toxikologie mit einer verbesserten, insbesondere verkürzten Erkennung und Aufklärung toxischer Wirkmechanismen unterstützen können. In der Zukunft würde dies eine signifikante Verkürzung und Verbesserung von Tierversuchen bedingen, verbunden mit einer Verringerung der Anzahl an Versuchstieren und letztlich einer Einsparung von Kosten und Zeit. N-Nitrosomorpholin (NNM), ein bekanntes Leberkanzerogen, diente als Modellsubstanz zur Abbildung des Kanzerogeneseprozesses. Zur Induktion von Lebertumoren sowie frühen präneoplastischen Veränderungen wurden Ratten in zwei Tierstudien über definierte Zeiträume mit zwei unterschiedlichen Dosierungen NNM behandelt. Das nach verschiedenen Behandlungszeitpunkten gewonnene Lebergewebe diente als Ausgangsmaterial für die nachfolgenden proteomischen Analysen. Dazu kam vor allem die zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) zum Einsatz, gefolgt von MALDI-Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung differentiell exprimierter Proteine. Ausserdem wurden aus den Leberproteinextrakten unter Einsatz der SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption and Ionisation)-Technologie Proteinprofile erstellt und für die verschiedenen durch NNM-Behandlung aufgetretenen Leberveränderungen charakteristische Signalmuster ermittelt. Das Potential der iTRAQ-Technologie, einer MS-basierten Quantifizierungsstrategie wurde in einem weitergehenden Schritt ermittelt. Mittels 2-DE/MS-Analyse konnten einerseits Proteine identifiziert werden, deren vermehrte Expression die nach einem Tag der Behandlung mit NNM ausgelösten akut toxischen Effekte der Chemikalie in der Leber reflektierten. Andererseits lieferte die Analyse von Proben, in denen nach 25 Wochen Lebertumore diagnostiziert wurden, differentiell exprimierte Proteine, die als Tumor-spezifische Markerproteine charakterisiert werden konnten. Im Hinblick auf das vorrangige Ziel der Arbeit, neue Biomarker zu identifizieren, die schon zu einem frühen Zeitpunkt des Tierversuchs bereits einsetzende kanzerogene Prozesse aufzeigen und damit in der Zukunft einen Beitrag leisten könnten, konventionelle toxikologische Prüfmethoden zu unterstützen oder gar zu verkürzen, erfolgte eine Fokussierung der Analyse auf Proben von Tieren, die drei Wochen lang mit NNM behandelt wurden. Bereits zu diesem Zeitpunkt wurden Proteine detektiert, deren Deregulation mit frühen Prozessen der Leberkanzerogenese in Einklang gebracht werden konnte. Vor allem 18 Proteine, die sich in den Proben nach drei Wochen der NNM-Behandlung wie auch in dem Gewebe von Tieren mit Tumoren als dereguliert erwiesen, wurden als potentielle frühe Biomarker mit einem enormen Potential zur verbesserten Vorhersage von Leberkanzerogenese charakterisiert. Um die durch 2-DE/MS-Analyse ermittelten potentiellen frühen Biomarker in ihrem detektierten Regulationsmuster zu bestätigen und damit das Vertrauen in die 2-DE/MS-Ergebnisse zu erhöhen, erfolgte eine Prävalidierung der Markerproteine mit unabhängigen Methoden. Hierfür wurde der immunologische Nachweis der Proteine in Form des Western Blottings sowie eine MS-basierte Quantifizierung unter Anwendung der iTRAQ-Technik herangezogen. Des Weiteren eröffnete die Integration der Arbeit in ein Verbundprojekt die Möglichkeit zum Vergleich der Proteinexpressionsdaten mit den Ergebnissen der globalen Genexpressionsanalyse, die bei einem Projektpartner durchgeführt wurde. Während durch Western Blotting nur wenige der 18 potentiellen frühen 2-DE/MS-Biomarker in ihrer nach drei Wochen Behandlung beobachteten Regulation bestätigt werden konnten, wurden durch Einsatz der iTRAQ-Technik 11 der Biomarker verifiziert und damit der Wert dieser Quantifizierungsstrategie für den Ansatz der Prävalidierung unterstrichen. Der Abgleich mit den Genexpressionsdaten legte für 63% der Proteine eine übereinstimmende Deregulation auf Genniveau offen. Insgesamt wurden 13 der 18 potentiellen frühen 2-DE/MS-Biomarker durch mindestens eine weitere unabhängige Technologie in ihrer im 2-DE-Gel beobachteten Expressionsveränderung bestätigt. Zusammenfassend lieferte die 2-DE/MS-Analyse des durch NNM veränderten Lebergewebes zahlreiche Protein-Biomarker, die auf molekularer Ebene sowohl frühe als auch späte Stadien der Leberkanzerogenese reflektieren. Vor allem die charakterisierten potentiellen frühen Biomarkern weisen ein signifikantes Potential auf, in der Zukunft konventionelle toxikologische Prüfsysteme zu unterstützen und möglicherweise einen Beitrag zur Verkürzung von Tierstudien und damit zur Einsparung von Versuchstieren zu leisten. Durch Prävalidierung der meisten der frühen Markerproteine durch unabhängige Methoden wurde dieses Potential als auch der Wert von Methoden der Proteomforschung zur allgemeinen Unterstützung der prädiktiven Toxikologie noch einmal unterstrichen.Today, modern toxicology is committed to the 3Rs concept which states to replace, to refine and to reduce animal testing whenever possible. Nevertheless, the evaluation of risk for human health arising from toxic effects of new drug candidates, as well as chemical compounds, is still largely based on animal studies combined with histopathological and biochemical methods. Investigation of carcinogenicity is usually performed using two-years studies in rodents. Carcinogenicity studies are time- and cost-intensive and, additionally, animals might suffer due to the chronic treatment. Therefore, in the current work proteomic technologies were implemented for identification and characterization of new protein biomarkers which allow an improved prediction of molecular processes of chemically induced hepatocarcinogenicity. This work was motivated by the assumption that the induced molecular processes might be detectable earlier by proteomic techniques than by conventional toxicology methods. The investigations should reveal if proteome studies might be able to support traditional toxicology with an improved and shortened recognition of toxic effects. This would contribute to significantly shorten and improve animal testing in the future, combined with a reduced amount of animals required and a decrease in time and costs. N-nitrosomorpholine (NNM), a well characterized liver carcinogen, was used as model compound for induction of liver tumors as well as early preneoplastic lesions in rats. In two studies animals were treated over defined time periods with two different doses of NNM. The liver samples, taken at different timepoints of treatment, were used for the following proteome analyses. These were performed using two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by MALDI mass spectrometry (MS) for identification of differentially expressed proteins. Futhermore, SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption and Ionisation) technology was utilized for analysis of rat liver proteins in order to generate protein profiles which can be used as signal patterns characteristic for the different phases of NNM treatment. In addition, the usefulness of iTRAQ-technology, an MS based quantitation strategy, for prevalidation of identified 2-DE/MS biomarkers was evaluated. After one day of NNM exposure, 2-DE/MS analysis revealed several differentially expressed proteins which reflect a cellular response to acute toxic effects of NNM. Furthermore, after 25 weeks, when tumors were detected in most of the liver samples, several of the identified deregulated proteins were characterized as marker proteins specific for neoplastic tissue. Regarding the main target of this work, the identification of new biomarkers, which reflect molecular carcinogenic processes at an early timepoint during the animal study, the following 2-DE/MS analysis focused on rat liver tissue which was exposed to NNM for only three weeks. The deregulation of most of the proteins, identified at this timepoint, could be correlated with molecular changes involved in early processes of liver carcinogenicity. Specifically, 18 proteins which showed a differential expression after three weeks of exposure as well as after 25 weeks, were characterized as potential early protein biomarkers with an enourmous impact for imoproved prediction of liver carcinogenicity in the future. A verification/prevalidation of the 18 potential 2-DE/MS biomarkers was performed by using Western Blot analysis as well as iTRAQ reagent technology, an MS-based quantitation strategy. Furthermore, integration of this work in a cooperative project allowed the comparison of protein expression data with the results of global gene expression analysis performed by a project partner. Whereas only little correlations could be observed by Western Blot analysis, the regulation of 11 of the 2-DE/MS biomarkers could be verified by using iTRAQ reagents so that this quantitation strategy turned out as useful approach for biomarker prevalidation. In addition, comparison with gene expression data revealed a correlation of 63% so that in summary, 13 of the 18 potential early 2-DE/MS biomarkers could be verified by more than one independent technology. Taken together, these 13 proteins might act as robust early biomarkers with the power to support conventional toxicology routine studies in order to improve and shorten animal studies in the future