Interactive simulation and visualisation for the computerised biochemistry

Die moderne Biochemie ist eine Wissenschaft, die sich im Wandel befindet. Während die bisherige Forschung sehr stark experimentell geprägt ist, existiert eine theoretische Biologie, analog zur theoretischen Chemie, nur in Ansätzen. Trotzdem wandelt sich auch diese Wissenschaft hin zu einer stärkeren Einbindung theoretischer Ansätze. Der Grund hierfür liegt in der Betrachtung von zunehmend komplexeren Systemen. So beschäftigt man sich in der Systembiologie, einem Teilbereich der Biochemie, unter anderem mit der Aufklärung komplexer Reaktionsnetzwerke. Während Ausschnitte dieser Netzwerke weiterhin experimentell aufgeklärt und verstanden werden, lässt sich das zusammenhängende Bild zunehmend nur noch durch eine theoretisch geprägte Modellbildung fassen. Darüber hinaus zeigen neuere Forschungsergebnisse die Bedeutung der Tatsache, dass Moleküle, Zellen und Zellhaufen, also wichtige Forschungsubjekte der Biochmie, dreidimensionale Gebilde sind – eine Tatsache, die bei der Modellbildung berücksichtigt werden muss. Eine Antwort auf die genannten Herausforderungen ist der konzertierte Einsatz von Simulation und Visualisierung als Mittel des Erkenntnisgewinns. Damit ist die Informatik gefordert entsprechende dedizierte Werkzeuge zu entwickeln, die Simulation, Visualisierung und Interaktion im Kontext des von der Anwendungsdisziplin gesetzten räumlich-zeitlichen Problemkreises miteinander verbinden. In dieser Arbeit wird ein integriertes Konzept zu Simulation, Interaktivität und Visualisierung vorgelegt, das auf einer Anforderungsanalyse in Bezug auf Anforderungen an die Simulation und Anforderungen an die Interaktivität und Visualisierung basiert. Zur Lösung der aufgeworfenen Probleme wird ein „Baukastensystem“ auf Basis von Multi-Agenten-Systemen vorgeschlagen. Die Auswahl des geeigneten Simulationsverfahrens, z. B. die Auswahl eines stochastischen Verfahrens gegenüber einem deterministischen Verfahrens, wird so zur Auswahl eines Bausteins, wobei gezeigt wird, wie z. B. mit Hilfe von Regeln die Auswahl auch automatisiert werden kann. Ebenso wird gezeigt, wie man „Baussteine“ auch im räumlichen Sinne verstehen kann, als Dinge, die in einem dreidimensionalen Kontext einen bestimmten Raum einnehmen und die, in ihrer Gesamtheit betrachtet, den Beobachtungsraum der Simulation ausfüllen. Diese Bausteine finden sich entsprechend ebenfalls im Kontext der Interaktion wieder. Ein wichtiger Aspekt in diesem Baukastenkonzept ist die Frage der Kommunikationsstruktur und des Kommunikationsprotokolls, für den ein Vorschlag erarbeitet wird. Das entwickelte Gesamtkonzept besteht aus zwei Teilen: Einem Konzept für Ein- und Ausgabegeräte mit einer gemeinsamen Metapher, die die Geräte logisch in den Anwendungskontext einbettet und einem Simulations- und Visualisierungskonzept auf der Basis der Kopplung heterogener intelligenter Agenten in eine gemeinsame Simulationsumgebung. Hierfür wurde ein spezieller Dialekt einer Agentenkommunikationssprache entwickelt, der dabei insbesondere den Aspekt der dreidimensionalen Visualierung einer solchen Simulation berücksichtigt.Modern biochemistry is a science is changing rapidly. While traditional research in this field is characterised by experimental studies, there is a growing interest in the inclusion computerised, model and simulation based methodologies. Although the objects of research are three dimensional entities, like molecules, cells etc. and a number of phenomena within these entities are identified as three dimensional, many models used nowadays abstract from this three-dimensionality. This is, at least to a significant part, due to the lack of dedicated visualisation and simulation tools. This thesis presents an integrated concept for the interactive simulation and visualisation in the biochemistry domain of molecular modelling, systems biology and multi-cellular structures which is based on a thorough requirements analysis. The concept consists of a modular system based on multi-agent methodologies. It is shown how this system can be used to couple heterogeneous simulation models and how three-dimensional structures can be represented in a modular way. These modular building blocks are revisited in the context of the inteactive visulisation of simulation studies. The concept is based on a newly developed agent communication language dialect. The implementation of the concept is twofold: a new I/O device, the virtual glove box, allowes for an intuitive approach to the simulation infrastructure, while several integrated software systems built on the communication structure provide a suited simulation and visualisation infrastructure wich caters for the needs of simulating three-dimensional phenomena

Analyse der frühen Schritte der HIV-1-Zell-Interaktion mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie

Der erste Schritt einer HIV-Infektion ist die Fusion des Virus mit der Plasmamembran der Zielzelle. Eine Blockade dieses Schritts, z.B. durch Medikamente, verhindert eine Neuinfektion von Zellen im menschlichen Organismus. Für die Entwicklung neuer Medikamente ist ein genaueres Verständnis der Fusionsreaktion erforderlich. Die bisherigen Analysen der Fusionskinetik beruhen nahezu ausschließlich auf biochemischen und virologischen Ensemblemessungen, die nur eine vergleichsweise geringe Zeitauflösung (im Minutenbereich) ermöglichen. Außerdem bedürfen diese Experimente einer artifiziellen Synchronisation des Ablaufs (z.B. Virusbindung an die Wirtszelle bei 4°C). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Virus-Zell-Fusionsreaktion fluoreszenzmikroskopisch in Echtzeit auf Einzelpartikelebene zu beobachten und deren Kinetik zu analysieren. Dazu wurden Viruspartikel verwendet, deren Hülle und Kern mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert waren (MA.eGFP und mRFP1.Vpr). Das infektiöse, reife HI-Virus besteht aus einer Lipidhülle assoziiert mit Matrixproteinen (MA) und einem inneren Kapsid, das u.a. das virale RNA-Genom und das akzessorische Protein Vpr enthält. Bei Fusion sollte sich das Matrixprotein vom verbleibenden subviralen Partikel trennen, was als Farbtrennungsereignis im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden sollte. Darüberhinaus könnte der Transport des subviralen Partikels über mRFP1.Vpr im Zytosol weiter verfolgt werden. Basierend auf dieser Strategie sollte ein experimentelles System etabliert werden, das die Beobachtung einzelner Fusionsereignisse in Echtzeit auflöst. Die Charakterisierung der doppelt fluoreszenzmarkierten Viruspräparationen zeigte, dass die Virussuspension monodispers war und die Viruspartikel einen hydrodynamischen Durchmesser von ungefähr 170 nm besaßen. Die fluoreszenzmarkierten Viruspartikel waren zu über 90 % zweifarbig und wiesen eine um 80 % reduzierte Infektiosität im Vergleich zum Wildtyp auf. Die Fusionskompetenz war jedoch nicht beeinträchtigt. Die biochemische Analyse ergab, dass die Inkorporation von mRFP1.Vpr in die Viruspartikel die Prozessierung des Gag-Polyproteins und damit eventuell die Virusreifung leicht beeinträchtigte. Die Beobachtung der Interaktion der fluoreszenzmarkierten Viruspartikel mit der Zellmembran von adhärenten Modellzelllinien wie HeLaP4 erfolgte durch Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Als störend für die mikroskopische Analyse erwies sich eine starke Virusanheftung an den Adhäsionsfaktor Heparansulfat auf der Zelloberfläche. Es konnte gezeigt werden, dass der Beitrag von Heparansulfat auf die Infektiosität nur gering war. Daher wurde Heparansulfat in den folgenden Experimenten durch enzymatische Behandlung von der Zelloberfläche entfernt. Mehr als 10.000 Trajektorien von HIV-Partikeln, die an die Wirtszelle gebunden waren oder diese berührten, wurden manuell analysiert, aber es konnte kein Farbtrennungsereignis detektiert werden. Zur verbesserten und beschleunigten Datenauswertung wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Karl Rohr (Biomedical Computer Vision Gruppe, IPMB, Universität Heidelberg) eine Tracking-Software entwickelt. Um die Wahrscheinlichkeit der Detektion eines Fusionsereignisses zu erhöhen, wurden hochfusogene VSV-G pseudotypisierte Viruspartikel eingesetzt. Im Gegensatz zur vom HIV-Hüllprotein vermittelten Fusion an der Plasmamembran fusionieren die pseudotypisierten Viruspartikel im sauren Milieu des Endosoms. Mit den VSV-G pseudotypisierten Viruspartikeln gelang es ein Farbtrennungsereignis zu detektieren, das den Erwartungen für eine Fusion entsprach. Die Analyse des Farbtrennungsereignisses ergab, dass das Partikel nach der Farbtrennung eine gerichtete Bewegung ausführte, die auf die Interaktion des potentiell subviralen Partikels mit Motorproteinen hinweist. Obwohl nur dieses eine Farbtrennungsereignis direkt mikroskopisch nachweisbar war, konnte indirekt in den Zellen eine effiziente Fusion der VSV-G pseudotypisierten Viruspartikel gezeigt werden. Die Zellen zeigten nach Inkubation mit den Viruspartikeln im Zytosol eine diffuse Färbung hervorgerufen durch MA.eGFP, während im Zellkern eine diffuse mRFP1.Vpr-Fluoreszenz zu detektieren war. Eine mögliche Ursache für die schwierige Detektion von einzelnen Fusionsereignissen könnte die experimentell nachgewiesene Stabilisierung der Viruspartikel durch inkorporiertes mRFP1.Vpr sein, die eine Trennung von Matrix und Viruskapsid beeinträchtigte. In dieser Arbeit wurden die technischen Grundlagen für eine effiziente Detektion von Virus-Zell-Interaktionen durch Etablierung der Mikroskopie- und Auswertetechnik geschaffen. Die hierfür entwickelte Tracking-Software erlaubt eine schnelle und quantitative Auswertung großer Experimentreihen. Die dazu notwendigen zweifarbig fluoreszenzmarkierten Viruspartikel wurden ausführlich charakterisiert, so dass zukünftig die Fusion auf Einzelpartikelebene mit verbesserten Systemen effizienter untersucht werden kann