Image Processing Methods for Automatic in-vitro Morphology Analysis

The study of male infertility has become a priority for biologists and researchers in the last decades as a consequence of the declining birth rates. This problem has also become a major public health with economic and psychosocial consequences. Analysis of human sperm cells, for instance, is widely used in investigations related to male infertility and assisted conception. Sperm samples are usually analysed by health professionals using microscope devices following a manual process to count and describe their morphology. Nevertheless, this practice is prone to errors and time consuming. This thesis proposes a novel framework based on image processing and machine learning methods to automate the analysis of sperm cells. The proposed method presented an average accuracy performance of 96.4% classify automatically sperm cells in three classes: normal, abnormal and non sperm cell. Performance results have been obtained in challenging conditions: presence of uneven illumination, unwanted noise and blurring caused by the focus drift and occlusion of objects as a result of the overlapping of sperm cells, among others. The object of interest, sperm cells, captured in the images used in this research did not receive any staining or fixation treatment prior to their capture. A novel and robust methodology based on deep neural learning is developed as part of the automatic feature selection prior to the classification. Also, video and image database of sperm samples was produced at the Andrology laboratory of the University of Sheffield as part of this work. The database was used to validate the proposed framework for the segmentation and classification of in-vitro cells

A review onquantification learning

The task of quantification consists in providing an aggregate estimation (e.g. the class distribution in a classification problem) for unseen test sets, applying a model that is trained using a training set with a different data distribution. Several real-world applications demand this kind of methods that do not require predictions for individual examples and just focus on obtaining accurate estimates at an aggregate level. During the past few years, several quantification methods have been proposed from different perspectives and with different goals. This paper presents a unified review of the main approaches with the aim of serving as an introductory tutorial for newcomers in the fiel

Supervised and unsupervised spermatozoa detection, classification and tracking in imaging data

Tese de mestrado. Bioinformática e Biologia Computacional (Biologia Computacional). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A aplicação da matemática na pesquisa em biologia tem vindo a ganhar relevância nas últimas décadas. Vários estudos teóricos e quantitativos têm contribuído para o progresso da biologia celular, da biologia do desenvolvimento e da imunologia. Os modelos matemáticos são particularmente úteis em casos onde a regulação genética afecta as propriedades biofísicas da célula e um exemplo é o estudo da biomecânica e hidrodinâmica dos espermatozóides. No entanto, a inexistência de comparações quantitativas rigorosas entre estes modelos e os dados experimentais torna este processo difícil e enviesado. Isto é devido à comparação maioritariamente qualitativa e visual, onde os parâmetros são mudados até o modelo e os dados serem semelhantes. As simulações de células contêm toda a informação geométrica dos objectos que descrevem pelo que podem ser rigorosamente comparadas com as imagens e filmes. Por outro lado, a reconstituição de células é dificultada pelos processos de análise de imagens actuais, que têm um fraco desempenho e que necessitam de supervisão humana. Este último ponto torna a análise de grande quantidade de dados difícil e introduz subjectividade e enviesamento na análise. Desta forma, os avanços na biologia celular quantitativa dependem do desenvolvimento de novos métodos automáticos de análise de imagem. Os sistemas de análise de espermatozóides assistida por computação (CASA) são um bom exemplo onde a bioimagiologia e a sua análise automática foram combinadas com sucesso. Estes sistemas apareceram nos anos 70 e são baseados na análise populacional dos parâmetros de motilidade dos espermatozóides. A sua popularidade advém da sua importância nos sectores médico e económico, uma vez que um em cada seis casais é subfértil e metade dos casos são de origem masculina. A motilidade espermática é essencial para a fertilização. Na viagem até ao ovo, as células espermáticas têm que nadar numa extensão milhares de vezes o seu comprimento através de uma geometria interna complexa cheia de fluídos altamente viscosos e de células imunes potencialmente hostis. Começando com uma população de centenas de milhões, a grande maioria não chegará às trompas de Falópio e muito menos chegarão ao local onde ocorre a fertilização. Adicionalmente, a capacitação espermática e a reacção acrossómica são dois eventos que ocorrem durante esta viagem que podem ser usados para definir a capacidade de fertilização, uma vez que também são essenciais para que esta ocorra. A capacitação prepara a membrana do espermatozóide para receber futuras pistas de localização do óvulo enquanto que a reacção acrossómica liberta enzimas para que o espermatozóide possa penetrar na camada protectora do óvulo enquanto também prepara a membrana espermática para a fusão das duas células. Para além da motilidade espermática, uma abordagem prática para estudar a fertilização tem sido medir a taxa de resposta dos espermatozóides à indução da reacção acrossómica. Actualmente, esta habilidade é medida manualmente em preparações de células espermáticas fixadas e coradas de forma a visualizar o acrossoma, um complexo derivado do Golgi localizado no ápice da célula. Sendo um parâmetro comum e frequentemente usado em pesquisa científica, neste trabalho desenvolvemos um processo automático de classificar os espermatozóides de acordo a reacção acrossómica. O nosso classificador baseia-se na análise de discriminantes, um método que define funções de fronteira entre duas ou mais classes, de acordo com os factores providenciados. Definimos duas classes: Capacitadas, que são células que sofreram capacitação mas que ainda não passaram por nenhum estado de reacção acrossómica, e Reagidas, que já reagiram ou que ainda estão a reagir. Como características escolhemos a intensidade média de sete sub-áreas da cabeça do espermatozóide, dispostas ao longo do seu eixo maior. Primeiro testámos se a Análise de Discriminantes Lineares (LDA) e Análise de Discriminantes Quadráticos (QDA) seriam aceitáveis para classificar este tipo de reacção em células detectadas manualmente. A classificação por QDA teve resultados melhores do que a por LDA, classificando correctamente 98.0% das células, tendo sido seleccionado como modelo de classificação. Tendo em vista uma verdadeira automatização, testámos o mesmo método com células detectadas por segmentação automática da imagem, onde estimámos os parâmetros do módulo de detecção (filtragem de objectos) e classificámos correctamente 94.7% dos objectos que correspondiam a um e apenas um espermatozóide cuja classe era conhecida. No entanto, o processo automático classifica todos os objectos detectados resultando numa classificação todos esses objectos obtivemos um erro de 28.1% na frequência relativa de espermatozóides Reagidos, que é uma diferença significativa. Este erro é maioritariamente devido aos espermatozóides anotados manualmente cuja classe era dúbia, pelo que não foram atribuídos a nenhuma classe. É razoável assumir que todos os espermatozóides dúbios sejam na verdade células que começaram recentemente a reagir e que deverão pertencer à classe Reagidos. Desta forma o erro na frequência de Reagidos obtido é de apenas -2.4%. A eficiência na classificação dos objectos detectados automaticamente cujas classes eram conhecidas e o facto de o classificador ter classificado as dúbias como Reagidas apoia esta hipótese. Provavelmente, é necessário treinar o modelo de classificação com dados anotados por um especialista na área da reacção acrossómica para poder generalizar o nosso modelo correctamente. É ainda de salientar que, pelo nosso processo, detectámos apenas 49.0% das células, uma vez que muitas detecções tratavam-se de facto de agregados celulares. Este agregados foram filtrados antes da classificação pois iriam enviesar a classificação. Para evitar este problema, propomos o uso de preparações com menos densidade celular, diminuindo o número e tamanho das agregações e permitindo melhor detecção e resultados mais fiáveis. A maioria dos métodos actuais de detecção de espermatozóides (i.e. incluindo o nosso) sofrem do mesmo problema: resolver as células quando estão agregadas. Com o intuito de ultrapassar as suas limitações, desenvolvemos um novo algoritmo de detecção. O nosso método visa tirar partido da informação do espermatozóide, como conhecimento a priori, e da informação contida em imagens de série temporal, podendo ser também aplicado em imagens isoladas, como demonstramos. A ideia base é aplicar uma função que descreva a forma e movimento do espermatozóide ao longo do tempo à célula na imagem, estimando os parâmetros dessa função através da posição e forma de potenciais objectos nessas imagens. Se o melhor ajuste da função for bom, é muito provável que um espermatozóide se encontra nas posições e com as formas modeladas. Devido à complexidade em desenvolver, ajustar e validar um modelo baseado em equações diferenciais, neste trabalho tabelámos a posição, rotação e conformação flagelar dum espermatozóide de ouriço-do-mar da espécie Lytechinus pictus. Para validar o nosso método, tentámos detectar o espermatozóide tabelado usando apenas uma imagem (i.e. ajuste local) e ainda rastreá-lo ao longo do tempo (i.e. ajuste global). Tanto a detecção como o rastreamento foram eficazes. Para generalizar este modelo, usámos um filme de um espermatozóide de Strongylocentrotus purpuratus (i.e. outro ouriço-do-mar) e conseguimos detectar e rastrear essa mesma célula, tendo havido apenas uma pequena acumulação de erro nos últimos tempos de amostragem que poderá ser devido à diferença inter-espécie ou a este espermatozóide não ter uma dinâmica estacionária (i.e. a nadar em círculos com a frequência flagelar constante). Podemos iterar o processo global em todas as imagens e seleccionar as instâncias do modelo correspondentes ao mesmo espermatozóides, ou seja, a mesma célula mas fitado localmente em imagens/tempos diferentes, de forma a obter o melhor modelo do espermatozóide nesse filme. Este processo de ajuste local pode ser usado em imagens isoladas (i.e. independência espacial) e, consequentemente, para detectar os espermatozóides humanos usados na classificação, desde que o espermatozóide tabelado seja ajustado. Uma questão interessante é se o nosso modelo consegue aumentar a resolução temporal e espacial da microscopia. Analisando uma sub-amostra temporal conseguimos detectar e rastrear a célula correctamente, tendo o nosso modelo sido coerente com os tempos de amostragem não usados para ajustar os parâmetros. De modo semelhante, conseguimos ainda obter boas estimativas da posição do flagelo em imagens onde apenas a informação da cabeça estava disponível (i.e. os flagelos não eram visíveis). No entanto, das várias instâncias do modelo referentes a esse espermatozóide, não conseguimos escolher a que mais se aproximava à célula, pelo que é necessário um método de selecção diferente que inclua mais informação. Os métodos desenvolvidos podem ser integrados em modelos morfodinâmicos, onde forma, mecânica e sinalização são combinados, e revolucionar os sistemas CASA, que estão até à data por integrar motilidade e processos bioquímicos.Recent advances in microscopy, by allowing to visualize cells and tissues in their natural physiological context, expanded the research possibilities to unprecedented domains. However, progress is hindered by the virtual absence of automatic image analysis methods that extract quantitative information from images. At best, image analysis is based on semi-automatic methods that require human supervision which is subjective and biased. This is how spermatozoa research stands at the moment and here we address three major computational issues in sperm imaging research: classification, detection and tracking. Sperm capacitation, acrosomal reaction and motility play an important role in fertility, which is a subject of growing medical and economic importance. In sperm research, acrosomal reaction is commonly measured by image analysis but, since no automatic classifier exists, it is performed manually. We developed and compared a method based on Discriminant Analysis capable of distinguishing capacitated cells which have not undergone acrosomal reaction from cells which are reacting or have reacted with over 94% of efficiency. The major difficulty encountered was automatic spermatozoa detection and a method to detect and track was devised - detect while tracking. This method uses a model of a sperm cell as a priori knowledge and can define well the sperm flagella position. We showed it can also predict sperm cells and their flagella at higher temporal resolution than the image sequence under study. It also has the potential to estimate flagellar conformations when only the sperm head positions are available but more sources of information are required in order to get the right conformation. Our methods modules can be easily adapted to any experimental setting (i.e. different labelling or sperm cell model) and the methods themselves can be combined to each other or to other available methods in order to facilitate sperm research

Proteínas do espermatozoide como alvos para contraceção e biomarcadores de fertilidade

Doutoramento em BiomedicinaO elevado número de gravidezes indesejadas a nível mundial (~41%) reflete a necessidade premente de novos métodos contracetivos. Para já, os contracetivos masculinos estão limitados ao preservativo, ao coito interrompido e à vasectomia dado que ainda não existem métodos farmacológicos disponíveis. Por outro lado, nos países desenvolvidos, 15% dos casais são inférteis e, em metade dos casos, as causas estão relacionadas com fatores masculinos, sendo a infertilidade idiopática o tipo mais comum de infertilidade masculina. Os principais objetivos deste trabalho consistiram em (1) identificar, caracterizar e modular alvos não-hormonais para a contraceção masculina; e (2) estabelecer um conjunto de biomarcadores para avaliar a fertilidade masculina. No que toca à identificação de alvos para a contraceção masculina, foi dada especial atenção a duas proteínas e aos seus interactors: a fosfoproteína fosfatase 1 (PPP1) e a proteína percursora amilóide (APP). Caracterizámos o interactoma da subunidade catalítica gama 2 da PPP1 (PPP1CC2), uma isoforma específica do testículo e espermatozoide. Demonstrando, pela primeira vez, a interação entre a PPP1CC2 e a A-kinase anchor protein 4 (AKAP4), uma proteína expressa especificamente no testículo essencial para a motilidade do espermatozoide, e o potencial desse complexo como alvo contracetivo. A motilidade do espermatozoide foi, então, modulada eficazmente recorrendo a cell penetrating peptides (CPPs) como sistemas de transporte intracelular de sequências peptídicas direcionadas para padrões únicos de interações proteicas. Um outro interactor da PPP1CC2, a several ankyrin repeat protein variant 2 (SARP2), foi também caracterizado em testículo e espermatozoide. Descrevemos ainda, o interactoma da APP em testículo e espermatozoide humano sendo que a nossa abordagem permitiu a identificação de novos interactores e o reconhecimento de interactores-chave na fertilidade masculina, particularmente na interação espermatozoide-oócito, o que representa um potencial mecanismo alvo para a contraceção masculina. Identificámos diversas proteínas sinalizadoras cuja atividade se correlaciona com parâmetros seminais distintos, tendo o potencial para integrar uma plataforma de diagnóstico que poderá ter várias aplicações: explicar situações de infertilidade idiopática; explicar o insucesso de técnicas de procriação medicamente assistida (PMA) ou abortos de repetição; auxiliar a escolha da técnica de PMA mais apropriada; avaliar a eficácia de intervenções médicas; e clarificar os mecanismos responsáveis pela deterioração da qualidade dos espermatozoides associada com a idade. Para além do potencial para integrar um painel de biomarcadores, essas proteínas permitiram o reconhecimento de vias de sinalização responsáveis por regular funções específicas do espermatozoide que podem ser utilizadas com fins terapêuticos.The large number of unintended pregnancies worldwide (~41%) highlights the need for new contraceptive methods. Still, male contraceptive methods are limited to condoms, withdrawal or vasectomy as, currently, no pharmaceutical contraceptive agents exist for men. In contrast, in developed countries, infertility affects 15% of couples attempting to conceive and in half of these cases the cause is related to male reproductive issues. Moreover, idiopathic infertility remains the most common type of male infertility. The main goals of this work were to (1) identify, characterize and modulate non-hormonal targets for male contraception; and (2) establish a biomarker “fingerprint” to assess male fertility. Concerning the identification of targets for male contraception, particular attention was given to two distinct proteins and its interacting partners: phosphoprotein phosphatase 1 (PPP1) and amyloid precursor protein (APP). We characterized the interactome of PPP1 catalytic subunit gamma 2 (PPP1CC2), a testis-enriched/sperm-specific PPP1 isoform, in human testis/spermatozoa. We demonstrated for the first time the interaction between PPP1CC2 and A-kinase anchor protein 4 (AKAP4), a testis-specific protein essential for sperm motility, in human spermatozoa and the potential of the complex as a contraceptive target. Sperm motility was then successfully modulated by specific protein complex disruption using cell-penetrating peptides (CPPs) as a drug intracellular delivery system. Herein, we demonstrated for the first time the potential of CPPs to deliver peptide sequences that target unique protein-protein interactions in spermatozoa. Another PPP1CC2 interacting protein – several ankyrin repeat protein variant 2 (SARP2) – was also characterized in testis and spermatozoa. Moreover, we provided the first report on APP interactome in human testis/spermatozoa and our approach allowed the identification of novel interactions and the recognition of key APP interacting proteins for male reproduction, particularly in spermoocyte interaction, which represent a potential mechanism for male contraception modulation. We identified several signaling proteins that showed a high degree of differential activity in spermatozoa samples with distinct seminal parameters and have the potential to integrate a diagnostic array, which may have several applications: explain idiopathic infertility, failure in assisted reproductive techniques (ART) or repeated abortion; choice of the appropriate ART; assess the efficacy of medical interventions; and clarify the mechanisms responsible for age-dependent declines in spermatozoa quality. Besides the potential to integrate a biomarker "fingerprint" to assess sperm quality, those proteins allowed the recognition of the signaling pathways accountable for regulating specific spermatozoa functions that by future modulation could serve for therapeutic proposes

Psr1p interacts with SUN/sad1p and EB1/mal3p to establish the bipolar spindle

Regular Abstracts - Sunday Poster Presentations: no. 382During mitosis, interpolar microtubules from two spindle pole bodies (SPBs) interdigitate to create an antiparallel microtubule array for accommodating numerous regulatory proteins. Among these proteins, the kinesin-5 cut7p/Eg5 is the key player responsible for sliding apart antiparallel microtubules and thus helps in establishing the bipolar spindle. At the onset of mitosis, two SPBs are adjacent to one another with most microtubules running nearly parallel toward the nuclear envelope, creating an unfavorable microtubule configuration for the kinesin-5 kinesins. Therefore, how the cell organizes the antiparallel microtubule array in the first place at mitotic onset remains enigmatic. Here, we show that a novel protein psrp1p localizes to the SPB and plays a key role in organizing the antiparallel microtubule array. The absence of psr1+ leads to a transient monopolar spindle and massive chromosome loss. Further functional characterization demonstrates that psr1p is recruited to the SPB through interaction with the conserved SUN protein sad1p and that psr1p physically interacts with the conserved microtubule plus tip protein mal3p/EB1. These results suggest a model that psr1p serves as a linking protein between sad1p/SUN and mal3p/EB1 to allow microtubule plus ends to be coupled to the SPBs for organization of an antiparallel microtubule array. Thus, we conclude that psr1p is involved in organizing the antiparallel microtubule array in the first place at mitosis onset by interaction with SUN/sad1p and EB1/mal3p, thereby establishing the bipolar spindle.postprin

Removal of antagonistic spindle forces can rescue metaphase spindle length and reduce chromosome segregation defects

Regular Abstracts - Tuesday Poster Presentations: no. 1925Metaphase describes a phase of mitosis where chromosomes are attached and oriented on the bipolar spindle for subsequent segregation at anaphase. In diverse cell types, the metaphase spindle is maintained at a relatively constant length. Metaphase spindle length is proposed to be regulated by a balance of pushing and pulling forces generated by distinct sets of spindle microtubules and their interactions with motors and microtubule-associated proteins (MAPs). Spindle length appears important for chromosome segregation fidelity, as cells with shorter or longer than normal metaphase spindles, generated through deletion or inhibition of individual mitotic motors or MAPs, showed chromosome segregation defects. To test the force balance model of spindle length control and its effect on chromosome segregation, we applied fast microfluidic temperature-control with live-cell imaging to monitor the effect of switching off different combinations of antagonistic forces in the fission yeast metaphase spindle. We show that spindle midzone proteins kinesin-5 cut7p and microtubule bundler ase1p contribute to outward pushing forces, and spindle kinetochore proteins kinesin-8 klp5/6p and dam1p contribute to inward pulling forces. Removing these proteins individually led to aberrant metaphase spindle length and chromosome segregation defects. Removing these proteins in antagonistic combination rescued the defective spindle length and, in some combinations, also partially rescued chromosome segregation defects. Our results stress the importance of proper chromosome-to-microtubule attachment over spindle length regulation for proper chromosome segregation.postprin