8 research outputs found

    Development and validation of in silico tools for efficient library design and data analysis in high throughput screening campaigns

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    My PhD project findings have their major application in the early phase of the drug discovery process, in particular we have developed and validated two computational tools (Molecular Assembles and LiGen) to support the hit finding and the hit to lead phases. I have reported here novel methods to first design chemical libraries optimized for HTS and then profile them for a specific target receptor or enzyme. I also analyzed the generated bio-chemical data in order to obtain robust SARs and to select the most promising hits for the follow up. The described methods support the iterative process of validated hit series optimization up to the identification of a lead. In chapter 3, Ligand generator (LiGen), a de novo tool for structure based virtual screening, is presented. The development of LiGen is a project based on a collaboration among DompĂ© Farmaceutici SpA, CINECA and the University of Parma. In this multidisciplinary group, the integration of different skills has allowed the development, from scratch, of a virtual screening tool, able to compete in terms of performance with long standing, well-established molecular docking tools such as Glide, Autodock and PLANTS. LiGen, using a novel docking algorithm, is able to perform ligand flexible docking without performing a conformational sampling. LiGen also has other distinctive features with respect to other molecular docking programs: ‱ LiGen uses the inverse pharmacophore derived from the binding site to identify the putative bioactive conformation of the molecules, thus avoiding the evaluation of molecular conformations which do not match the key features of the binding site. ‱ LiGen implemenst a de novo molecule builder based on the accurate definition of chemical rules taking account of building block (reagents) reactivity. ‱ LiGen is natively a multi-platform C++ portable code designed for HPC applications and optimized for the most recent hardware architectures like the Xeon Phi Accelerators. Chapter 3 also reports the further development and optimization of the software starting from the results obtained in the first optimization step performed to validate the software and to derive the default parameters. In chapter 4, the application of LiGen in the discovery and optimization of novel inhibitors of the complement factor 5 receptor (C5aR) is reported. Briefly, the C5a anaphylatoxin acting on its cognate G protein-coupled receptor C5aR is a potent pronociceptive mediator in several models of inflammatory and neuropathic pain. Although there has long been interest in the identification of C5aR inhibitors, their development has been complicated, as is the case with many peptidomimetic drugs, mostly due to the poor drug-like properties of these molecules. Herein, we report the de novo design of a potent and selective C5aR noncompetitive allosteric inhibitor, DF2593A. DF2593A design was guided by the hypothesis that an allosteric site, the “minor pocket”, previously characterized in CXCR1 and CXCR2, could be functionally conserved in the GPCR class.DF2593A potently inhibited C5a-induced migration of human and rodent neutrophils in vitro. Moreover, oral administration of DF2593A effectively reduced mechanical hyperalgesia in several models of acute and chronic inflammatory and neuropathic pain in vivo, without any apparent side effects. Chapter 5 describes another tool: Molecular Assemblies (MA), a novel metrics based on a hierarchical representation of the molecule based on different representations of the scaffold of the molecule and pruning rules. The algorithm used by MA, defining a priori a metrics (a set of rules), creates a representation of the chemical structure through hierarchical decomposition of the scaffold in fragments, in a pathway invariant way (this feature is novel with respect to the other algorithms reported in literature). Such structure decomposition is applied to nine hierarchical representation of the scaffold of the reference molecule, differing for the content of structural information: atom typing and bond order (this feature is novel with respect to the other algorithms reported in literature) The algorithm (metrics) generates a multi-dimensional hierarchical representation of the molecule. This descriptor applied to a library of compounds is able to extract structural (molecule having the same scaffold, wireframe or framework) and sub structural (molecule having the same fragments in common) relations among all the molecules. At least, this method generates relations among molecules based on identities (scaffolds or fragments). Such an approach produces a unique representation of the reference chemical space not biased by the threshold used to define the similarity cut-off between two molecules. This is in contrast to other methods which generate representations based in similarities. MA procedure, retrieving all scaffold representation, fragments and fragmentation’s patterns (according to the predefined rules) from a molecule, creates a molecular descriptor useful for several cheminformatics applications: ‱ Visualization of the chemical space. The scaffold relations (Figure 7) and the fragmentation patterns can be plotted using a network representation. The obtained graphs are useful depictions of the chemical space highlighting the relations that occur among the molecule in a two dimensional space. ‱ Clustering of the chemical space. The relations among the molecules are based on identities. This means that the scaffold representations and their fragments can be used as a hierarchical clustering method. This descriptor produces clusters that are independent from the number and similarity among closest neighbors because belonging to a cluster is a property of the single molecule (Figure 8). This intrinsic feature makes the scaffold based clustering much faster than other methods in producing “stable” clusters in fact, adding and removing molecules increases and decreases the number of clusters while adding or removing relations among the clusters. However these changes do not affect the cluster number and the relation of the other molecules in dataset. ‱ Generate scaffold-based fingerprints. The descriptor can be used as a fingerprint of the molecule and to generate a similarity index able to compare single molecules or also to compare the diversity of two libraries as a whole. Chapter 6 reports an application of MA in the design of a diverse drug-like scaffold based library optimized for HTS campaigns. A well designed, sizeable and properly organized chemical library is a fundamental prerequisite for any HTS project. To build a collection of chemical compounds with high chemical diversity was the aim of the Italian Drug Discovery Network (IDDN) initiative. A structurally diverse collection of about 200,000 chemical molecules was designed and built taking into account practical aspects related to experimental HTS procedures. Algorithms and procedures were developed and implemented to address compound filtering, selection, clusterization and plating. Chapter 7 collects concluding remarks and plans for the further development of the tools

    Improved approaches to ligand growing through fragment docking and fragment-based library design

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    Die Fragment-basierte Wirkstoffforschung (“fragment-based drug discovery“ – FBDD) hat in den vergangenen zwei Jahrzehnten kontinuierlich an Beliebtheit gewonnen und sich zu einem dominanten Instrument der Erforschung neuer chemischer MolekĂŒle als potentielle bioaktive Modulatoren entwickelt. FBDD ist eng mit AnsĂ€tzen zur Fragment-Erweiterung, wie etwa dem Fragment-„growing“, „merging“ oder dem „linking“, verknĂŒpft. Diese EntwicklungsansĂ€tze können mit Hilfe von Computerprogrammen oder teilautomatischen Prozessen der „de novo“ Wirkstoffentwicklung beschleunigt werden. Obwohl Computer mĂŒhelos Millionen von VorschlĂ€gen generieren können, geschieht dies allerdings oft auf Kosten unsicherer synthetischer Realisierbarkeit der Verbindungen mit einer potentiellen Sackgasse im Optimierungsprozess. Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung zweier computerbasierter Instrumente, PINGUI und SCUBIDOO, mit dem Ziel den FBDD Ausarbeitungs-Zyklus zu fördern. PINGUI ist ein halbautomatischer Arbeitsablauf zur Fragment-Erweiterung basierend auf der Proteinstruktur unter BerĂŒcksichtigung der synthetischen Umsetzbarkeit. SCUBIDOO ist eine freizugĂ€ngliche Datenbank mit aktuell 21 Millionen verfĂŒgbaren virtuellen Produkten, entwickelt durch die Kombination kommerziell verfĂŒgbarer Bausteine („building blocks“) mit bewĂ€hrten organischen Reaktionen. Zu jedem erzeugten virtuellen Produkt wird somit eine Synthesevorschrift geliefert. Die entscheidenden Funktionen von PINGUI, wie die Erzeugung abgeleiteter Bibliotheken oder das Anwenden organischer Reaktionen, wurden daraufhin in die SCUBIDOO Webseite integriert. PINGUI als auch SCUBIDOO wurden des Weiteren zur Erforschung Fragment-basierter Liganden („fragment-based ligand discovery“) mit dem ÎČ-2 adrenergen Rezeptor (ÎČ-2-AR) und der PIM1 Kinase als Zielproteine („targets“) eingesetzt. Im Rahmen einer ersten Studie zum ÎČ-2-AR wurden mit PINGUI acht unterschiedliche Erweiterungen fĂŒr verschiedene Fragment-Treffer („hits“) vorhergesagt (ausgewĂ€hlt?). Alle acht Verbindungen konnten dabei erfolgreich synthetisiert werden und vier der acht Produkte zeigten im Vergleich zu den Ausgangsfragmenten eine erhöhte AffinitĂ€t zum target. Eine zweite Studie umfasste die Anwendung von SCUBIDOO zur schnellen Identifikation von Fragmenten und deren möglichen Erweiterungen mit potentieller BindungsaktivitĂ€t zur PIM-1 Kinase. Als Ergebnis ergab sich ein Fragment-Treffer mit der dazugehörigen Kristallstruktur. Weitere Folgeprodukte befinden sich derzeit in Synthese. Abschließend wurde SCUBIDOO an eine automatische Roboter- Synthese gekoppelt, wodurch hunderte von Verbindungen effizient parallel synthetisiert werden können. 127 der 240 vorhergesagten Produkte (53%) wurden mit dem Ziel an den ÎČ-2-AR zu binden bereits synthetisiert und werden in KĂŒrze weitergehend getestet. Die beiden vorgestellten Computer-Tools könnten zur Verbesserung im Anfangsstadium befindlicher Projekte zur Fragment-basierten Wirkstoffentwicklung, vor allem hinsichtlich der Strategien im Bereich der Fragment Erweiterung, eingesetzt werden. PINGUI zum Beispiel generiert VorschlĂ€ge zur Fragment- Erweiterung, die sich mit hoher Wahrscheinlichkeit an die Zielstruktur anlagern, und stellt somit ein nĂŒtzliches und kreatives Werkzeug zur Untersuchung von Struktur-Wirkungsbeziehungen („structure-activity relationship“ – SAR) dar. SCUBIDOO zeigte sich mit einem bisherigen 53-prozentigen Synthese-Erfolg als zugĂ€nglich fĂŒr die Integration an die effiziente automatisierte Roboter-Synthese. Jede zukĂŒnftige Synthese liefert neue Kenntnisse innerhalb der Datenbank und wird somit nach und nach den Synthese-Erfolg erhöhen. Des Weiteren stellen alle synthetisierten Produkte neuartige Verbindungen dar, was umso mehr den möglichen Einfluss SCUBIDOOs bei der Entdeckung neuer chemischer Strukturen hervorhebt

    Structural analysis of 20S Proteasome and Development of Structure-Based Virtual Screening Methods

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    Directed evolution of human dihydrofolate reductase: towards a better understanding of binding at the active site

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    La dihydrofolate rĂ©ductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle Ă  la prolifĂ©ration cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de diffĂ©rents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spĂ©cifiques de la DHFRh, les antifolates, ont Ă©tĂ© mis au point : le mĂ©thotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. MalgrĂ© l’efficacitĂ© clinique certaine de ces antifolates, le dĂ©veloppement de nouveaux traitements s’avĂšre nĂ©cessaire afin de rĂ©duire les effets secondaires liĂ©s Ă  leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthĂšse de nouveaux composĂ©s inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigĂ©e, il a Ă©tĂ© possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinitĂ© envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiĂ©e. La mutagenĂšse dite ÂŹÂŹde saturation a Ă©tĂ© utilisĂ©e afin de gĂ©nĂ©rer des banques de mutants prĂ©sentant une diversitĂ© gĂ©nĂ©tique au niveau des rĂ©sidus du site actif de l’enzyme d’intĂ©rĂȘt. De plus, une nouvelle mĂ©thode de criblage a Ă©tĂ© mise au point, laquelle s’est avĂ©rĂ©e efficace pour dĂ©partager les mutations ayant entrainĂ© une rĂ©sistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activitĂ© enzymatique envers son substrat natif, soient les phĂ©notypes d’activitĂ©. La mĂ©thode de criblage consiste dans un premier temps en une sĂ©lection bactĂ©rienne Ă  haut dĂ©bit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, rĂ©sistants aux antifolates, ont ainsi pu ĂȘtre identifiĂ©s et caractĂ©risĂ©s lors d’études de cinĂ©tique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces rĂ©sultats cinĂ©tiques, de la modĂ©lisation molĂ©culaire et des donnĂ©es structurales de la littĂ©rature, une Ă©tude structure-activitĂ© a Ă©tĂ© effectuĂ©e. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencĂ© Ă  construire un carte molĂ©culaire des contacts impliquĂ©s dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplĂ©mentaires sur les propriĂ©tĂ©s spĂ©cifiques de liaison ont put ĂȘtre acquises en variant l’inhibiteur testĂ©, permettant ainsi une meilleure comprĂ©hension du phĂ©nomĂšne de discrimination du ligand.Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination

    Modellierung von Metalloenzymen: 3D-QSAR-Untersuchungen an Carboanhydrase-Isoenzymen und virtuelles Screening nach Peptiddeformylase-Inhibitoren

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    In der modernen Arzneistoffentwicklung unterscheidet man die Phasen der Leitstrukturfindung und der Leitstrukturoptimierung. Die vorliegende Dissertationsschrift beinhaltet BeitrĂ€ge zu beiden Bereichen. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Evaluierung von Computermodellen zur Vorhersage von AffinitĂ€t und SelektivitĂ€t und entstammt daher dem Bereich der Leitstrukturoptimierung. SelektivitĂ€tsaspekte spielen eine wichtige Rolle, da sie das Risiko von Nebenwirkungen maßgeblich beeinflussen. Zur Modellierung und Vorhersage von AffinitĂ€ts- und SelektivitĂ€tsparametern wurden QSAR-Methoden angewendet. Das Modellsystem stellten Carboanhydrasen (CAs) dar; diese zinkhaltigen Hydrolasen katalysieren die reversible Hydratisierung von Kohlendioxid zu Bicarbonat und einem Proton. Sie sind daher in eine Vielzahl (patho)physiologischer Prozesse involviert und stellen interessante therapeutische Targets dar. Die zahlreichen Isoenzyme der CAs besitzen im Bereich der Bindetasche hohe Ähnlichkeiten in Bezug auf physikochemische Eigenschaften, so dass die Entwicklung selektiver Inhibitoren kein triviales Problem darstellt. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen insbesondere 3D-QSAR-Verfahren. Es wurden statistisch hochsignifikante und robuste Modelle abgeleitet, um AffinitĂ€t und SelektivitĂ€t von Sulfonamidinhibitoren bezĂŒglich der Isoenzyme CA I, II und IV vorherzusagen. Es zeigte sich, dass die geringen Unterschiede im strukturbasierten Alignment unter Verwendung der drei Bindetaschen nur geringen Einfluss auf die statistischen Parameter besitzen und dass bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn fĂŒr alle Isoenzyme das auf CA II basierende Alignment benutzt wird anstelle des Alignments in der jeweiligen Bindetasche. Ursache hierfĂŒr ist wahrscheinlich die Vielzahl an Kristallstrukturen, die fĂŒr CA II existieren und damit das Alignment verlĂ€sslicher machen. Die erhaltenen Isokonturkarten erlaubten eine Interpretation der Modelle im Hinblick auf die Bedeutung physikochemischer Eigenschaften fĂŒr die AffinitĂ€t/SelektivitĂ€t. Der Vergleich zu qualitativen proteinbasierten Isokonturkarten unterstreicht den komplementĂ€ren Charakter beider Methoden: WĂ€hrend die ligandbasierten QSAR-Verfahren implizit teilweise die Struktur der Bindetasche widerspiegeln, aber auch von den Eigenheiten des Trainingsdatensatzes abhĂ€ngen, vermögen die proteinbasierten Analysen auch Informationen ĂŒber Bereiche der Bindetasche zu geben, die keine Interaktionen mit Liganden des Trainingsdatensatzes ausbilden. Ein weiteres Ziel bestand darin, QSAR-Methoden fĂŒr das Screening grĂ¶ĂŸerer Datenbanken zu verwenden. Dies erlaubt die Identifizierung besonders interessanter (d.h. affiner/selektiver) Kandidaten zur Synthese im Sinne einer Leitstrukturoptimierung. FĂŒr 3D-QSAR-Methoden musste zunĂ€chst ein Protokoll zur Automatisierung des Alignments entwickelt und validiert werden. Es zeigte sich hierbei, dass ein ligandbasiertes Alignment vergleichbare Ergebnisse zu manuellen stukturbasierten Alignmentmethoden erzielt. Die 3D-Modelle erwiesen sich als ĂŒberlegen im Vergleich zu fragmentbasierten 2D-Methoden oder insbesondere zu den eigenschaftsbasierten 1D-Methoden. Als praktisches Anwendungsbeispiel der entwickelten Modelle wurde eine mehrere tausend EintrĂ€ge umfassende virtuelle Ligandbibliothek aufgebaut und mit den leistungsfĂ€higsten Modellen bewertet. Der zweite Teil der Arbeit beinhaltet ein virtuelles Screening nach neuartigen Inhibitoren der Peptiddeformylasen (PDFs) und gehört somit in den Bereich der Leitstrukturfindung. PDFs sind (meist) eisenhaltige Enzyme, die die Deformylierung von in Mitochondrien, Plastiden oder Bakterien synthetisierten Proteinen katalysieren. Ausgehend von Kristallstrukturen potenter PDF-Inhibitoren wurden 3D-Pharmakophormodelle entwickelt und validiert. Diese waren in der Lage, strukturell diverse, aus der Literatur bekannte Inhibitoren zu identifizieren (hinreichende SensitivitĂ€t) und gleichzeitig die zu durchsuchenden Datenbanken stark zu reduzieren (hinreichende SpezifitĂ€t). Die Pharmakophormodelle wurden zum Screening von Datenbanken kommerziell erhĂ€ltlicher MolekĂŒle mit wirkstoffartigen Eigenschaften benutzt. Durch Docking und Scoring wurden schließlich aus etwa zwei Millionen Verbindungen elf Substanzen identifiziert und erworben, die einer biologischen Testung unterzogen werden sollen. Erste vorliegende Messergebnisse zeigen, dass mindestens zwei der Substanzen mit einem IC50-Wert von 60 nM bzw. 190 nM potente Inhibitoren der PDF1B aus E. coli sind. Dies belegt die GĂŒte der Modelle und des angewendeten Screening-Protokolls. Inhibitoren der PDF könnten Anwendung als Herbizide, Antibiotika und Antimalaria-Therapeutika finden
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