Contribution of stromal cells to the formation and stabilisation of blood microvessels

Vasculogenesis, the creation of new blood vessels, occurs due to an inherent ability of endothelial cells (ECs) to self-assemble and form tubules. Additionally, many studies have shown that stromal cells, connective tissue cells of any organ, including fibroblasts (FBs), play a vital role in the formation and stabilisation of new vessels, mostly chemically by producing and secreting growth factors. However, still we lack ground understanding of the mechanical contribution of FBs to vasculogenesis. In this study, employing microfluidic platforms, we aimed to address the mechanical role of FBs in vascularisation. Applying a 7-channel microfluidic platform, we encapsulated ECs with 3 different conditions: mono-cultured (MC, embedding only ECs within a hydrogel), paracrine co-cultured (PCC, embedding ECs and FBs separately in two hydrogels) and juxtacrine co-cultured (JCC, embedding ECs mixed with FBs in a hydrogel) to investigate the impact of FB presence on formation of functional microvessels. Imaging techniques and dextran perfusion revealed that the cluster-like structures formed in the device seeded with MC and PCC conditions were not functional in terms of perfusability and permeability and deteriorated within a week while the microvessels developed in the device seeded with JCC condition were functional, well-interconnected and survived much longer (~3 weeks), indicating that the direct physical interaction between FBs and ECs is crucial for the formation of functional blood microvessels. Also, chemical perturbation of mechanotransduction genes, YAP, Src, Wnt/β-catenin, RhoA, and FAK, in both ECs and FBs, resulted in either the inhibition of microvessel formation or the development of microvessels which were significantly different in morphology, perfusability, vessel length, diameter, and coverage area compared to control microvessels, demonstrating that mechanotransduction pathways play key roles in vascularisation. Additionally, using siRNA approach, we inhibited the same genes only in FBs to examine the mechanical contribution of FBs to vascularisation. This revealed that ECs co-cultured with siRNA-inhibited FBs (excluding RhoA) retained their ability to form microvessels. However, further characterisations demonstrated that the microvessels did not resemble control microvessels in terms of permeability, perfusability, tissue stiffness, barrier function, morphology, and vessel topology. Together, these results highlight the mechanical contribution of FBs to the formation, morphogenesis and function of microvessels and suggests that FBs are intrinsic mechanical promoters and stabilisers of microvessels. Such knowledge on the mechanisms underlying the vascularisation, will be useful in further developing vascularisation strategies for organ-specific, disease-specific, and cancer-specific tissue engineering and regenerative medicine applications

Translational Oncogenomics and Human Cancer Interactome Networks

An overview of translational, human oncogenomics, transcriptomics and cancer interactomic networks is presented together with basic concepts and potential, new applications to Oncology and Integrative Cancer Biology. Novel translational oncogenomics research is rapidly expanding through the application of advanced technology, research findings and computational tools/models to both pharmaceutical and clinical problems. A self-contained presentation is adopted that covers both fundamental concepts and the most recent biomedical, as well as clinical, applications. Sample analyses in recent clinical studies have shown that gene expression data can be employed to distinguish between tumor types as well as to predict outcomes. Potentially important applications of such results are individualized human cancer therapies or, in general, ‘personalized medicine’. Several cancer detection techniques are currently under development both in the direction of improved detection sensitivity and increased time resolution of cellular events, with the limits of single molecule detection and picosecond time resolution already reached. The urgency for the complete mapping of a human cancer interactome with the help of such novel, high-efficiency / low-cost and ultra-sensitive techniques is also pointed out

Systems Biology Approaches For The Analysis Of High-Throughput Biological Data

The identification of biological processes involved with a certain phenotype, such as a disease or drug treatment, is the goal of the majority of life sciences experiments. Pathway analysis methods are used to interpret high-throughput biological data to identify such processes by incorporating information on biological systems to translate data into biological knowledge. Although widely used, current methods share a number of limitations. First, they do not take into account the individual contribution of each gene to the phenotype in analysis. Second, most of the methods include parameters of difficult interpretation, often arbitrarily set. Third, the results of all methods are affected by the fact that pathways are not independent entities, but communicate with each other by a phenomenon referred to as crosstalk. Crosstalk effects heavily influence the results of pathway analysis methods, adding a number of false positives and false negatives, making them difficult to interpret. We developed methods that address these limitations by i) allowing for the incorporation of individual gene contributions, ii) developing objective methods for the estimation of parameters of pathway analysis methods, and iii) developing an approach able to detect, quantify, and correct for crosstalk effects. We show on a number of real and simulated data that our approaches increase specificity and sensitivity of pathway analysis, allowing for a more effective identification of the processes and mechanisms underlying biological phenomena

Regulation of Tie2 Extracellular Complex Formation in Angiogenesis

Pathological angiogenesis is an essential component of tumor growth, development, and metastasis for which few effective therapeutic options exist. Though many cancer therapies target the function of cell surface receptors, mechanisms regulating membrane receptor crosstalk remain unclear. Two important families of receptors in angiogenesis, the Ties and Integrins, respond to the extracellular environment via outside-in and, in the case of Integrins, also inside- out signaling. Recent reports showed that the endothelial specific tyrosine kinase receptor, Tie2, forms complexes with two of the endothelial Integrin heterodimers, α5β1 and αVβ3, providing a convenient mechanism for the integration of extracellular stimuli. Our data confirm the interaction between Integrins and Tie2 and additionally indicate an interaction with the orphan co-receptor Tie1. To elucidate the biological role of these macromolecular complexes, biochemical and biophysical methods including co-immunoprecipitation, FRET microscopy, and cellular based assays were used to follow receptor/Integrin association in response to the Tie2 ligands Angiopoietin-1 and -2 as well as the Integrin ligand fibronectin. Furthermore, structural analysis by small angle x-ray scattering of Tie2-ligand complexes and specific Integrin and Tie complexes are being used to identify the basis for growth factor receptor and Integrin signal transduction

Copine III interacts with ERBB2 and promotes tumor cell migration

Breast cancer is the most prevalent form of cancer in females: one of nine women develops breast cancer during her lifetime and it is predicted that one in 27 women will die as a result of this disease. Moreover, it is anticipated that with almost 30 % of females affected, breast cancer will be the most frequently diagnosed cancer in 2009 (www.cancer.org). Given these facts, much time and resources have been provided to research in the breast cancer area. The ErbB2 receptor tyrosine kinase is one of the most-studied oncogenes in breast cancer as amplification and overexpression of the ERBB2 gene is known to occur in up to 25 % of all affected patients and is correlated with a highly aggressive disease and poor patient prognosis. Our study focused on signaling molecules interacting with the C-terminal regulatory region of the ErbB2 receptor. We used T47D breast cancer cells metabolically labeled with SILAC to identify binding partners of the pTyr1248 site of ErbB2. Using a peptide affinity pull-down approach followed by quantitative mass spectrometry, we identified Copine III as a novel interaction partner of ErbB2-pTyr1248. Copine III belongs to a family of Ca2+-dependent phospholipid binding proteins that is conserved from plants to humans. All copines carry two C2 domains followed by an A domain, similar to the von Willebrand A domain of integrins, in their C-terminus. Although Copine III is ubiquitously expressed, to date it has not been assigned a function downstream of ErbB2. In this study we first analyzed the biochemical properties of Copine III and its interaction with ErbB2. We show that Copine III is a cytoplasmic protein that localizes to the nucleus and the plasma membrane in a Ca2+-dependent manner and upon stimulation of the cells with the ErbB ligand heregulin (HRG). We used FRET acceptor photobleaching to show that Copine III and ErbB2 not only co-localize in HRG-stimulated breast cancer cells, but also interact at the plasma membrane. This co-localization is blocked when the cells are treated with the ErbB2 inhibitor AEE788, implying that Copine III only interacts with phosphorylated active ErbB2. The second goal of my studies was to place Copine III within a signaling pathway downstream of ErbB2. For this, we again used SILAC together with quantitative mass spectrometry and identified the scaffolding protein RACK1 as a binding partner of Copine III. We were able to show that Copine III, RACK1 and the adaptor molecule Shc form a complex with ErbB2 in HRG-stimulated cells. RACK1 has been implicated in focal-adhesion mediated cell migration and here we demonstrate that Copine III localizes to focal adhesions and is required for ErbB2-dependent cell migration. Moreover, knock-down of Copine III affects Src kinase activity and the subsequent phosphorylation of focal adhesion kinase, resulting in the observed defects in cellular migration. Thus Copine III is an important effector molecule in ErbB2-mediated cell migration. Finally, we analyzed Copine III expression in the broader context of cancer, looking at carcinomas of the breast, prostate and ovary. In a set of 49 breast cancer tumor samples, 10 of the 11 cases with ERBB2 amplification display elevated levels of Copine III. This connected well with the protein expression levels of Copine III in a panel of breast cancer cell lines that also correlated with ErbB2 amplification. In published ovarian and prostate transcriptome studies, Copine III mRNA levels are upregulated in cancer as compared to normal tissue. Based on these findings, we performed immunohistochemistry (IHC) stainings of Copine III on breast, prostate and ovarian tissue microarrays. While some Copine III staining was evident in normal breast, normal prostate and ovarian tissues have very low levels of Copine-III. Strikingly, tumors of all three types showed higher Copine III levels. To summarize, we present Copine III here for the first time as an interaction partner of the ErbB2 receptor. Copine III interacts with ErbB2 in a Ca2+- and HRG-dependent manner and is required for tumor cell migration. Furthermore, Copine III levels were found to be upregulated in tissue microarrays of breast, ovarian and prostate tumor tissue as compared to normal tissue. Together, these findings imply a biological function for Copine III in cancer progression and suggest that further studies into the functions of Copine III are merited

Reciprocal regulation of the Fibroblast Growth Factor Receptor 2 (FGFR2) and the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) through their direct interaction

Tyrosine Kinase Receptors (RTKs) regulate fundamental cellular processes including cell proliferation, survival and invasion and thus, dysregulation of their activation is implicated in human malignancies. The canonical mechanism of activation is initiated by receptor activation through ligand-induced dimerization, and autophosphorylation of key tyrosine residues along the C-terminal cytoplasmic domain. It has been demonstrated in the past that FGFR2, an RTK, can dimerise in the absence of ligand resulting in signal activation or inhibition depending on the equilibrium of C-terminal-binding proteins i.e. GRB2 and PLCγ1. This study provided the first indication of a novel direct interaction between FGFR2 and a non-selective cation channel, TRPA1, through the C-terminal domain of FGFR2 and the Ankyrin repeat domain of TRPA1. The interaction was studied by protein interaction techniques in an overexpression system. The FGFR2-TRPA1 complex was also detected in a human lung adenocarcinoma cell line suggesting a possible implication in cancer. The regulatory effect of TRPA1 on FGFR2 was also investigated. In basal conditions, the interaction with TRPA1 exhibits an inhibitory effect on FGFR2 autophosphorylation which results in downstream PLCγ1 pathway inhibition. Co-immunoprecipitation experiments revealed a decrease in PLCγ1 binding to FGFR2 in the presence of TRPA1 explaining the reduction in the PLCγ1 pathway activation. Upon stimulating conditions, TRPA1-mediated receptor inhibition is raised, as shown by increase in p-FGFR2 however, binding of PLCγ1 to the C-terminal of FGFR2 is still impeded. Finally, a model of TRPA1-mediated regulation of the FGFR2 signalling was proposed in which TRPA1 prevents aberrant basal stimulation of the receptor while maintaining PLCγ1 pathway inhibition even in the presence of ligand. These findings provided the first evidence of direct interaction between an RTK and a TRP channel as well as proposed a novel regulatory mechanism of FGFR2 signalling that can facilitate in the development of therapeutic strategies for FGFR2-related diseases

Unravelling cell migration: defining movement from the cell surface

Cell motility is essential for life and development. Unfortunately, cell migration is also linked to several pathological processes, such as cancer metastasis. Cells’ ability to migrate relies on many actors. Cells change their migratory strategy based on their phenotype and the properties of the surrounding microenvironment. Cell migration is, therefore, an extremely complex phenomenon. Researchers have investigated cell motility for more than a century. Recent discoveries have uncovered some of the mysteries associated with the mechanisms involved in cell migration, such as intracellular signaling and cell mechanics. These findings involve different players, including transmembrane receptors, adhesive complexes, cytoskeletal components , the nucleus, and the extracellular matrix. This review aims to give a global overview of our current understanding of cell migration

Role of the notch-delta signalling pathway on bone marrow-derived cells function during wound healing and tumor progression

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Bone marrow (BM)-derived cell populations participate in numerous physiological and pathological conditions in adult individuals, directly interacting with tissue specific cellular and extracellular matrix (ECM) components. In particular BM-derived endothelial progenitors (EPCs) contribute to physiological and pathological new vessel formation, a process termed posnatal-vasculogenesis. However the molecular mechanisms regulating their contribution are still lacking. In the present PhD thesis we adressed the role of two major pathways that regulate embryonic vasculogenesis: the Notch-Delta signalling pathway and Integrin-ECM pathway on EPC function during wound healing and tumor progression. To address the contribution of Integrin-ECM interactions to EPC function we tested the effect of the pro-angiogenic fibrin fragment E (FnE) on EPC vasculogenic properties. Our data shows that FnE potentiates the in vitro vasculogenic properties of EPCs, increasing their adhesion (via integrin α5β1), endothelial differentiation and paracrine factor production thus leading to increased in vivo wound vascularization and healing. Concerning the contribution of the Notch-Delta signalling pathway we defined that this pathway mediates bidirectional interactions between BM-derived cells and tissue resident cells during wound healing and tumor progression. In detail we observed that activation of the Notch pathway on EPCs increases integrin α3β1 expression, improving EPC adhesion and endothelial differentiation as well as their pro-angiogenic and wound healing potential in vitro and in vivo. In a tumor setting we observed that EPC-mediated activation of the Notch signaling on ECs regulates vessel stability by increasing the expression of basement membrane components as well as endothelial cell-cell junction proteins, thus being essential for neo-vessel normalization during tumor growth. Further characterization of BMderived cells recruited to tumor tissues lead us to the identification of BM-derived tumor associated macrophages (TAMs) that can activate Notch signaling on colon carcinoma cells inducing tumor epithelial to mesenchymal transition (EMT) thus contributing to tumor progression and metastisation. Taken together our results suggests that both Integrin-ECM and Notch-Delta pathways modulate the properties of BM-derived populations, being essential for the vasculogenic properties of EPCs and for the tumor promoting functions of TAMs, thus making these pathways valid targets in both wound healing and tumor progression.O sistema cardiovascular constitui o primeiro sistema de órgãos que se forma durante o desenvolvimento embrionário dos vertebrados, tendo como principais funções oxigenação e nutrição de todos os tecidos assim como a remoção de produtos secundários do metabolismo e regulação térmica via vasoconstrição e dilatação. Os principais componentes do sistema cardiovascular são o coração, o sangue e os vasos sanguíneos. Por sua vez os vasos sanguíneos têm como unidade funcional e estrutural a célula endotelial (CE) ao nível da qual são feitas as trocas celulares, metabólicas e gasosas entre as células de todos os tecidos e o sangue. A formação de vasos sanguíneos ocorre durante o desenvolvimento embrionário sendo um processo extremamente complexo que envolve essencialmente dois mecanismos celulares distintos mas interligados: vasculogénese e angiogénese. A vasculogénese é o processo através do qual células precursoras endoteliais, denominadas angioblastos, migram, agregam-se e coalescem formando uma rede primitiva de tubos endoteliais. O subsequente crescimento, expansão e estabilização dessa rede vascular primitiva ocorre através da proliferação, migração e consequente ramificação de CE activadas, num processo denominado angiogénese. Num organismo adulto as CE, assim como os vasos sanguíneos que elas constituem encontramse num estado não proliferativo, denominado quiescência. No entanto, na presença de estímulos específicos nomeadamente em situações fisiológicas (cicatrização de feridas, revascularização de tecidos isquemicos, ovulação, menstruação ou gravidez) ou patológicas (cancro, psoriase, artrite, retinopatias, aterosclerose ou em feridas com cicatrização atrasada) as CE podem tornar-se activas e por angiogénese geram novos vasos sanguíneos. No entanto dados recolhidos na ultima década sugerem que à semelhança do que acontece durante o desenvolvimento embrionário, também no adulto novos vasos sanguíneos se podem formar por vasculogénese. Efectivamente foram identificados em indivíduos adultos células denominadas progenitores endoteliais (PE), que partilham semelhanças com angioblastos embrionários, e que em situações fisiológicas e patológicas são recrutados e diferenciam-se em CE, que por sua vez incorporam os novos vasos formados, num processo denominado vasculogénese pós-natal. PE são definidos como células com origem na medula óssea e que são caracterizados pela expressão de marcadores moleculares específicos de células estaminais como o CD133, CD34 ou o Sca-1 (em ratinho) assim como marcadores endoteliais como o VEGFR-2 (receptor 2 do factor de crescimento vascular). Em resposta a estímulos específicos provenientes de tecidos em remodelação vascular os PE são mobilizados da medula óssea para a circulação, onde são transportados até atingirem os locais de remodelação vascular onde abandonam a circulação por extravasão, invadem os tecidos adjacentes e eventualmente diferenciam-se em CE incorporando os novos vasos formados. O processo de diferenciação endotelial dos PE pode ser dividido em 3 fases essenciais: adesão, mediada por integrinas, dos PE aos componentes da matriz extracelular, sobrevivência e proliferação dos PE aderentes em resposta a factores de crescimento e a sinais da matriz extracelular e finalmente aquisição de marcadores e propriedades endoteliais. Apesar de já ser conhecida e descrita a contribuição dos PE em diversas condições fisiológicas e patológicas os mecanismos que regulam a sua diferenciação em CE ainda são desconhecidos. Assim sendo os objectivos desta tese de doutoramento são a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na diferenciação endotelial, em contexto de cicatrização de feridas e de progressão tumoral, com especial foco em vias que são essenciais para a vasculogénese embrionária: via de interacção entre integrinas e proteínas da matriz extracelular e via de sinalização Notch-Delta. Além da compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a diferenciação endotelial em PE também foi feita investigação relativa ao papel da via de sinalização Notch-Delta na comunicação entre outras populações celulares derivadas da medula óssea (além dos PE) e células tumorais, durante a progressão tumoral. No capítulo 3 desta tese de doutoramento abordámos o papel da matriz extracelular provisória composta essencialmente por fibrina e pelos seus fragmentos de degradação, que se forma durante a cicatrização de feridas, na função dos PE. Em particular caracterizámos in vitro o papel do fragmento de degradação da fibrina E (FnE), que tem potentes propriedades pró-angiogénicas, na diferenciação e nas propriedades vasculogénicas dos PE. De acordo com os nossos resultados FnE potencia a adesão dos PE, via integrina α5β1, assim como a sua diferenciação endotelial comparativamente a outros componentes da matriz extracelular. Surpreendentemente observámos que PE cultivados em FnE produzem níveis mais elevados de factores paracrinos, nomeadamente de factores pró-angiogénicos e de inúmeras citoquinas. Utilização de meios condicionados de PE cultivados em diferentes componentes da matriz revelou que os meios condicionados dos PE na presença de FnE têm propriedades pró angiogénicas assim como propriedades quimiatractoras de monócitos sanguíneos extremamente elevados comparativamente às restantes condições. Para validarmos o papel pró-vasculogénico do FnE em PE in vivo, utilizámos uma matriz sintética enriquecida com FnE (denominada Smart Matrix – SM) em modelos murinos de cicatrização de feridas. De acordo com os nossos resultados a adição de SM conjuntamente com PE potenciou significativamente o fecho das feridas, estando associado a uma maior vascularização da ferida comparativamente com as restantes condições. Em conclusão os resultados apresentados no capítulo 3 sugerem que FnE tem grandes propriedades vasculogénicas, pelo que a sua administração sob a forma de uma matriz sintética conjuntamente com PE representa uma possível abordagem terapêutica para potenciar a cicatrização de feridas quer resultantes de trauma, queimadura ou ulceração crónica resultante de diabetes, pressão ou estase venosa. No capítulo 4 investigámos o papel da via de sinalização Notch-Delta na diferenciação endotelial e nas propriedades vasculogénicas dos PE, num contexto de cicatrização de feridas. De acordo com os nossos resultados os PE expressam ligandos e receptores da via Notch-Delta e durante a diferenciação endotelial destas células observámos um aumento na activação da via Notch-Delta. Curiosamente a inibição farmacológica da via Notch-Delta levou a uma redução drástica na adesão dos PE a diversos componentes das matriz extracelular assim como a uma redução significativa do número de CE obtidas no final do ensaio de diferenciação endotelial in vitro. Mecanisticamente observámos que inibição da via Notch-Delta nos PE conduzia a uma redução da expressão da integrina α3β1, razão pela qual observámos redução na adesão e consequentemente na diferenciação dos PE. Adicionalmente verificámos que inibição farmacológica da via Notch-Delta nos PE reduzia a capacidade destas células induzirem angiogénese e migração endotelial em ensaios in vitro, sugerindo que a via Notch-Delta é essencial não so para a adesão e diferenciação endotelial dos PE mas também para as suas propriedades pró-angiogenicas. Após constatarmos o papel essencial da via Notch-Delta nos PE, testámos o efeito da inibição desta via em PE em modelos murinos de cicatrização de feridas. Em confirmação dos resultados in vitro observámos que ratinhos injectados com PE normais têm um aumento da taxa de cicatrização associado a um aumento do numero de vasos sanguíneos presentes na ferida. Por outro lado o efeito dos PE na cicatrização e vascularização perde-se quando a via Notch-Delta é inibida, curiosamente PE com a via Notch-Delta inibida estão presentes na ferida em frequências menores que os PE normais. Estes dados demonstram que a activação da via Notch-Delta em PE potencia as suas propriedades vasculogénicas e próangogénicas, sendo essencial para a sua capacidade de acelerar a cicatrização de feridas em modelos murinos. No capitulo 5 abordámos o papel de um dos ligandos da via Notch-Delta expresso em PE, o Dll4 (Delta-like ligand 4) na angiogénese tumoral. De acordo com os nossos resultados a expressão de Dll4 em PE é regulada directamente por 2 factores mobilizadores de PE: VEGF (factor de crescimento vascular) e SDF-1 (factor derivado do estroma de medula óssea). Para testar o efeito de Dll4 na activação da via Notch-Delta em CE, co-cultivámo PE com diferentes níveis de expressão de Dll4 conjuntamente com CE e posteriormente analisámos os genes expressos diferencialmente nas CE consoante os níveis de Dll4 dos PE. De acordo com a nossa análise a activação da via Notch-Delta nas CE via Dll4 expresso pelos PE conduziu ao aumento da expressão de componentes da matriz extracelular (nomeadamente fibronectina) e de componentes das adesões endoteliais (ICAM2 e VE-Caderina). In vivo observámos que em ratinhos transplantados com PE heterozigóticos para Dll4 (Dll4+/-) o crescimento tumoral era reduzido relativamente a ratinhos transplantados com PE normais, no entanto analise do tecido tumoral revelou que os tumores dos ratinhos transplantados com PE Dll4+/- tinham maior densidade vascular, mas menor proliferação, maior frequência de células apoptóticas e áreas de hipoxia mais extensas relativamente aos tumores crescidos em ratinhos transplantados com PE normais. Esta observação sugeriu que os vasos tumorais desenvolvidos em ratinhos transplantados com PE Dll4+/- eram mais instáveis embora existissem em maior numero. De facto análise histológica revelou que estes vasos apresentam menor expressão de fibronectina e menor cobertura com pericitos (células vasculares musculares), confirmando que a activação da via Notch-Delta em CE via Dll4 expresso por PE é essencial para a estabilização da vasculatura tumoral nascente e consequentemente para o crescimento tumoral. Finalmente para validar o efeito de Dll4 expresso nos PE na estabilização da vasculatura tumoral transplantámos ratinhos com PE com sobre-expressão de Dll4 e analisámos a vasculatura tumoral. De facto observámos que embora o crescimento tumoral não tenha sido alterado, assim como o numero total de vasos formados, a quantidade de fibronectina assim como o calibre dos vasos tumorais era superior nos ratinhos transplantados com PE com sobre-expressão de Dll4 do que nos ratinhos transplantados com PE normais, confirmando que a activação da via Notch-Delta em CE via Dll4 expresso em PE conduz à estabilização vascular. Concluindo, os dados apresentados no capitulo 5 descrevem o papel essencial de Dll4 expresso por PE na activação da via Notch-Delta em CE, conduzindo ao aumento de proteínas da matriz extracelular assim como de componentes das junções celulares entre células endoteliais essenciais para a estabilização e funcionalidade da vasculatura tumoral. Finalmente no capítulo 6 investigámos a contribuição de outras populações celulares derivadas da medula óssea para a progressão tumoral. Para este efeito utilizámos ratinhos nos quais transplantámos medula óssea proveniente de ratinhos actina-GFP, pelo que obtivemos ratinhos nos quais todas as células na medula expressavam GFP. Posteriormente inoculámos estes ratinhos com tumores derivados de linhas celulares isoladas de carcinoma de cólon (HCT15) e procedemos à analise histológica dos tumores, após estes crescerem durante 1 ou 4 semanas (tumores precoces e tardios). Análise histológica revelou que em tumores tardios há uma contribuição significativa de células derivadas da medula óssea (GFP+) e que estas células expressam essencialmente marcadores mielóides (CD11b). Inesperadamente constatámos que nas regiões tumorais onde as células derivadas da medula óssea se acumulavam, as células tumorais perdiam a expressão de marcadores epiteliais (nomeadamente a E-Caderina), adquirindo a expressão de marcadores mesenquimatosos (nomeadamente Vimentina) sugerindo que estas células tumorais estavam em transição epitelial-mesenquimal (TEM). Para confirmar a suspeita que células derivadas da medula óssea poderiam estar a induzir TEM em células tumorais de carcinoma do cólon, procedemos a co-culturas in vitro com células derivadas da medula associadas ao tumor com células do carcinoma do cólon. Surpreendentemente verificámos que células derivadas da medula óssea associadas ao tumor tinham a capacidade de induzir TEM em células tumorais e ainda que essa capacidade dependia da activação da via Notch-Delta nas células tumorais. Após uma caracterização detalhada da população de células derivadas da medula associadas ao tumor capazes de induzir TEM nas células tumorais, definimos esta população como sendo constituída por macrófagos associados a tumor ou MAT (CD11b+ F4/80+) que expressava o ligando da via Notch Jagged-2. Experiências de co-cultura in vitro desta população com células tumorais confirmaram que esta população consegue via Jagged-2 induzir a activação da via Notch-Delta promovendo TEM nas células tumorais sendo essencial para a progressão tumoral. Em conjunto os dados apresentados no capitulo 6 sugerem que durante a progressão tumoral, populações de células derivadas da medula podem de facto modular propriedades das células tumorais induzindo TEM e consequentemente induzindo um fenotipo mais invasivo e potencialmente mais metastático nos tumores primários. Em conclusão, o trabalho realizado neste projecto de doutoramento permitiu atribuir à via Notch- Delta e também as interacções entre integrinas e proteínas da matrix extracelular um papel essencial na comunicação entre populações celulares derivadas da medula óssea, em particular PE e MAT, e componentes celulares e da matrix extracelular presentes durante a cicatrização de feridas ou durante a progressão tumoral, sugerindo assim o uso destas vias e destas populações como potenciais alvos terapêuticos.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH / BD / 31381 / 2006