Ligand-induced DNA conformational changes in proflavine minor groove-bound complexes studied by molecular dynamics simulation

Background: Minor groove binding is a rate-limiting step in proflavine-DNA intercalation reaction. This step is believed also to be responsible for the sequence-dependent kinetics of proflavine binding to DNA. At the same time, most studies are focused on the final stage of the reaction – the intercalation complex, and there is a lack of data concerning the structure and stability of proflavine-DNA minor groove-bound complexes. Objectives: The objective of this study was to investigate the stability of proflavine minor groove-bound complexes with DNA oligonucleotides of different sequence by molecular dynamics simulation and to analyze the DNA conformational changes caused by the proflavine binding. Materials and methods: The molecular dynamics simulations of proflavine minor groove-bound complexes with poly(dA)·poly(dT) and poly(dCG)·poly(dCG) oligonucleotides of 30 bp length were done in program package AMBER12 with explicit water (SPC/E) and ions (NaCl 0.15 M) using force fields FF14SB for DNA and GAFF for ligand. The starting configurations of complexes were obtained by docking method in AutoDock 3.05. After multi-stage equilibration protocol, each system was simulated at T=300 K and p=1 bar for a 50 ns production phase. Then trajectories were post-processed in AMBERTools17 and VMD-1.9.3 packages. Results: Our simulations confirm that proflavine-DNA minor groove-bound complexes are stable in the 50 ns time range but there are some structural rearrangements in them with respect to the initial structures. The narrowing of the DNA minor groove is observed in the proflavine binding site. In proflavine-poly(dCG)·poly(dCG) complex it is more pronounced and is accompanied by the BI/BII transitions in DNA and the reorientation of ligand. In proflavine-poly(dA)·poly(dT) complex the specific intermolecular hydrogen bonds are formed, which are optimized by the changes in opening and propeller twisting of involved AT-base pairs. Complexes are stabilized by the van der Waals and hydrophobic interactions, which are more favorable in the proflavine-poly(dA)·poly(dT) complex. Conclusions: Our results show that the binding of proflavine to a minor groove of DNA induces the conformational changes in the DNA that are important for the resulting complex stability

Nucleic acid assembly, polymerization, and ligand binding

In the past 30 years, the discovery of capabilities of nucleic acids far beyond their well-known information-bearing capacity has profoundly influenced our understanding of these polymers. The discovery by the Cech and Altman labs that nucleic acids could perform catalytic functions, coupled with the Gold and Szostak groups’ demonstration of the de novo evolution of nucleic acids that bind arbitrary ligands, has resulted in a proliferation of newfound roles for these molecules. Nucleic acids have found utility in both engineered systems, such as aptamer therapeutics, as well as in newly appreciated roles in extant organisms, such as riboswitches. As a result of these discoveries, many have pondered the potential importance of the dual (catalytic and informational) roles of nucleic acids in early evolution. A high-yielding synthetic route for the nonenzymatic polymerization of nucleic acids, based on the aqueous self-assembly of their components, would provide a powerful tool in nucleic acid chemistry, with potential utility in prebiotic and contemporary nucleic acid systems alike – however, such a route remains elusive. In this thesis, I describe several steps towards such a synthetic route. In these systems, a nucleic-acid binding ligand drives the assembly of short DNA and RNA duplexes, promoting the production of long nucleic acid polymers, while suppressing the production of short, cyclic species. Additionally, the use of a reversible covalent linkage allows for the production of long polymers, as well as the incorporation of previously cyclized products into these polymers. I also report several explorations of novel base pairings, nucleic acid-ligand interactions, and nucleic acid-ion interactions that have informed our studies of self-assembling nucleic acid systems.PhDCommittee Chair: Hud, Nicholas; Committee Member: France, Stefan; Committee Member: Lynn, David; Committee Member: Wartell, Roger; Committee Member: Williams, Lore

Synthesis of novel dienes and cyclic compounds via olefin metathesis reactions catalyzed by the second generation Grubbs catalyst

Transition metal-catalyzed olefin metathesis reactions play a significant role in chemical synthesis. These reactions are currently applied across several disciplines, and their full potential has not yet been reached. This project details the synthesis of spiro[3-cyclopentene-1,9’-[9H]fluorene], 1-(1-amino-2-methylpropyl)-3-cyclopentenol, and the eugenol dimer via olefin metathesis reactions catalyzed by the second generation Grubbs catalyst. The unique structural properties of each compound help demonstrate the widespread abilities of these reactions. Also reported are the novel three-dimensional crystal structures of both spiro[3-cyclopentene-1,9’-[9H]fluorene] and the eugenol dimer. These structures were determined via X-ray diffraction crystallography methods using a Bruker SMART X2S Single Crystal Diffractometer. Both of these structures have R-values within the accepted publication range of 0.00 – 5.00

Pi-pi to full ci: cation dimers and substituent effects in noncovalent interactions

The following thesis focuses on two areas of chemistry, pi-pi interactions and radical cation dimers. Approximations to the exact solution to the Schrodinger equation are investigated for these types of chemical systems with a variety of theoretical methods. The first chapter provides an introduction to the various quatum mechanical methods used in this research. The second chapter focuses specifically on pi-pi interaction. In this chapter, high quality quantum mechanical methods are used to examine how substituents tune pi-pi interactions between monosubstituted benzene dimers in parallel-displaced geometries. In addition, the role of dispersion and coulombic interactions in these systems is investigated to determine the nature of the substituent effect. In the third chapter radical cation dimers are investigated. Benchmark results with full configuration interaction (FCI) and equation-of-motion coupled-cluster for ionized systems (EOM-IP-CCSD) are presented for prototypical charge transfer species. Conclusions regarding chapters 2 and 3 are presented in the final chapter. This work may form the basis for improved approaches to rational drug design, organic optical materials, and molecular electronics.M.S.Committee Chair: Sherrill, C. David; Committee Member: Bredas, Jean-Luc; Committee Member: Hud, Nicholas; Committee Member: Perry, Josep

Computational insights into the molecular basis for the replication of flexible tobacco-derived DNA lesions

DNA is damaged by many agents in the environment and this affects many cellular processes, including DNA replication. The present thesis uses a multiscale computational modeling approach to study the intrinsic conformational and base-pairing preferences of flexible O6-G and O2-T alkyl DNA lesions, and the corresponding properties within DNA duplexes and polymerase active sites. Specifically, the replication of O6-benzylguanine (Bz-G) by a prototypical DNA polymerase, DNA polymerase IV, as well as the replication of the tobacco-derived carcinogens, O6-[4-oxo-4-(3-pyridyl)butyl]guanine (POB-G), O6-[4-hydroxy-4-(3-pyridyl)butyl]guanine (PHB-G), and O2-[4-oxo-4-(3-pyridyl)butyl] thymine (POB-T), by human DNA polymerases η and κ, were investigated. This work uncovers structural bases for the reported lesion mutagenicity and biological processing. Additionally, a consistent theoretical framework was used to provide insight into the previously unidentified general base for the nucleotidyl transfer reaction catalyzed by polymerase η. Overall, this thesis emphasizes the complex interplay between many factors that are required to replicate damaged DNA

Implementation and applications of density-fitted symmetry-adapted perturbation theory

Noncovalent interactions play a vital role throughout much of chemistry. The understanding and characterization of these interactions is an area where theoretical chemistry can provide unique insight. While many methods have been developed to study noncovalent interactions, symmetry-adapted perturbation theory (SAPT) stands out as one of the most robust. In addition to providing energetic information about an interaction, it provides insight into the underlying physics of the interaction by decomposing the energy into electrostatics, exchange, induction and dispersion. Therefore, SAPT is capable of not only answering questions about how strongly a complex is bound, but also why it is bound. This proves to be an invaluable tool for the understanding of noncovalent interactions in complex systems. The wavefunction-based formulation of SAPT can provide qualitative results for large systems as well as quantitative results for smaller systems. In order to extend the applicability of this method, approximations to the two-electron integrals must be introduced. At low-order, the introduction of density fitting approximations allows SAPT computations to be performed on systems with up to 220 atoms and 2850 basis functions. Higher-orders of SAPT, which boasts accuracy rivaling the best theoretical methods, can be applied to systems with over 40 atoms. Higher-order SAPT also benefits from approximations that attempt to truncate unneccesary unoccupied orbitals.PhDCommittee Chair: Sherrill, C. David; Committee Member: Bongiorno, Angelo; Committee Member: Brown, Kenneth R.; Committee Member: Harvey, Stephen C.; Committee Member: Liotta, Charles L.; Committee Member: Whetten, Robert L

„Konstrukcja i zastosowanie sitodrukowanych czujników elektrochemicznych w badaniach oddziaływań DNA z błękitem metylenowym, antracyklinami i ich formamidynowymi pochodnymi”

Dokonana w drugiej połowie XIX wieku przez Lelanda C. Clarka modyfikacja powierzchni gazowej elektrody tlenowej poprzez osadzenie na niej oksydazy glukozowej otworzyła drogę do konstrukcji zupełnie nowych, umożliwiających wykonywanie badań z pogranicza chemii i biologii, narzędzi analitycznych, jakimi były wówczas bioczujniki elektrochemiczne. Obecnie cieszą się one dużą popularnością i są wciąż udoskonalane zarówno przez stosowanie różnorodnych rodzajów biologicznego materiału receptorowego, jak i przez liczne modyfikacje w konstrukcji urządzenia oraz w procedurze pomiarowej. Na szczególną uwagę zasługują biosensory, w których biologiczny element receptorowy stanowi warstwa kwasu deoksyrybonukleinowego, który jako nośnik informacji genetycznej odgrywa ważną rolę w procesach biologicznych. Bioczujniki DNA mogą dostarczać wielu istotnych informacji na temat oddziaływań molekuł kwasu deoksyrybonukleinowego z różnymi indywiduami chemicznymi (farmaceutykami, substancjami toksycznymi, białkami), mutacji występujących w łańcuchach DNA oraz chorób genetycznych. Wprowadzając różne modyfikacje w ich konstrukcji, dąży się do uzyskania tanich, skutecznych i prostych w obsłudze narzędzi, które w przyszłości mogłyby być dostępne komercyjnie i stosowane nawet przez niewykwalifikowane osoby w oznaczeniach medycznych, farmakologicznych oraz środowiskowych. Badania eksperymentalne opisane w mojej rozprawie doktorskiej dotyczyły zastosowania trójelektrodowych układów sitodrukowanych do konstrukcji elektrochemicznych bioczujników DNA. Przeprowadziłam szereg eksperymentów, mających na celu optymalizację procedury przygotowywania powierzchni sitodrukowanej elektrody pracującej oraz polepszenie parametrów pomiarowych układów na drodze modyfikacji nanorurkami węglowymi. Zoptymalizowane czujniki wykorzystałam do analizy oddziaływań różnych rodzajów DNA z błękitem metylenowym oraz daunorubicyną, doksorubicyną i ich formamidynowymi pochodnymi, wykazującymi podobnie jak związki macierzyste właściwości antynowotworowe. W mojej pracy prezentacja wyników badań własnych poprzedzona została dość obszerną częścią literaturową, która przybliża zagadnienia istotne z punktu widzenia podjętej tematyki. Objęła ona omówienie budowy i właściwości kwasu deoksyrybonukleinowego oraz substancji z nim oddziałujących, konstrukcji i zasady działania elektrochemicznych bioczujników DNA, techniki sitodruku, budowy i właściwości nanorurek węglowych oraz metod analitycznych, stosowanych w mojej pracy, takich jak woltamperometria i spektrofotometria UV-Vis. W części mojej rozprawy dotyczącej badań własnych, jako pierwsze zaprezentowane zostały wyniki testowania czterech metod przygotowania powierzchni sitodrukowanej elektrody pracującej: oczyszczania elektrochemicznego, oczyszczania elektrochemicznego poprzedzonego działaniem NaOH, oczyszczania elektrochemicznego poprzedzonego działaniem H2O2 oraz oczyszczania elektrochemicznego poprzedzonego mechanicznym szlifowaniem. Na elektrodach przygotowanych według poszczególnych procedur osadzałam DNA i monitorowałam woltamperometrycznie sygnały elektroutlenienia zawartej w nim guaniny i adeniny. Uzyskane wyniki oraz charakteryzujące je parametry pokazały, iż najwłaściwszym sposobem przygotowania elektrod sitodrukowanych do konstrukcji bioczujników DNA jest czyszczenie elektrochemiczne, obejmujące kondycjonowanie elektrody przy stałym dodatnim potencjale oraz cykliczne utlenianie i redukcja jej powierzchni w szerokim zakresie potencjałów. Podjęłam również próbę poprawy parametrów pomiarowych, zwiększenia czułości i powtarzalności, stosowanych układów sitodrukowanych poprzez ich modyfikację wielościennymi nanorurkami węglowymi. Na wstępie przeprowadziłam serie prób, mających na celu dobór rozpuszczalnika właściwego do sporządzenia zawiesiny nanorurek węglowych i następnie użycia jej do modyfikacji elektrod sitodrukowanych. Stabilne, jednorodne zawiesiny nanorurek węglowych uzyskałam jedynie w DMF, jego mieszaninie z wodą w stosunku 1:1 oraz cellosolwie butylowym. Jednak ostatecznie do modyfikacji elektrod sitodrukowanych użyłam jedynie zawiesin sporządzonych w dwóch ostatnich rozpuszczalnikach, gdyż DMF powodował zniekształcenia woltamperogramów, uniemożliwiające monitorowanie sygnałów utlenienia zasad azotowych DNA. Modyfikację nanorurkami prowadziłam dwoma sposobami: poprzez nakroplenie ich zawiesiny na powierzchnię elektrody pracującej oraz poprzez wzbogacenie nimi grafitowej pasty sitodrukowej używanej do nadruku układów elektrodowych. Pierwsza metoda okazała się skuteczna jedynie w przypadku zastosowania zawiesiny wielościennych nanorurek węglowych w mieszaninie DMF-H2O do modyfikacji sitodrukowanych elektrod produkcji włoskiej, powodując podwyższenie rejestrowanych na nich sygnałów utlenienia DNA, podczas gdy na elektrodach polskich modyfikowanych w analogiczny sposób ulegały one obniżeniu. Jednak mimo wzrostu wysokości pików rejestrowanych na elektrodach włoskich w obecności nanorurek, pozostawały one niższe i mniej powtarzalne niż rejestrowane na niemodyfikowanych elektrodach polskich. Alternatywna metoda modyfikacji elektrod sitodrukowanych nanorurkami węglowymi stosowana była tylko dla układów polskich i polegała na dodatku 1% wielościennych nanorurek węglowych do grafitowej pasty sitodrukowej. W tym przypadku wpływ nanorurek węglowych na sygnały utlenienia zasad azotowych był zależny od sposobu osadzania DNA – gdy było ono nakraplane, ich obecność nie powodowała wzrostu pików, gdy zaś było ono adsorbowane z roztworu przy stałym potencjale, ulegały one niewielkiemu podwyższeniu z jednoczesną poprawą powtarzalności. Takie efekty świadczą o pozytywnym wpływie nanorurek węglowych na przepływ elektronów, towarzyszących procesom elektrolitycznym zachodzącym podczas adsorpcji DNA, a nie o ich katalitycznym działaniu na samą reakcję redoks. Do dalszych eksperymentów wybrałam ostatecznie elektrody produkcji polskiej bez modyfikacji ze względu na dość duży koszt zakupu nanorurek węglowych, nieprzekładający się na znaczącą poprawę parametrów pomiarowych elektrod modyfikowanych. W dalszej części mojej rozprawy przedstawiłam wyniki badań własnych nad wykorzystaniem zoptymalizowanych bioczujników DNA do analizy oddziaływań kwasu deoksyrybonukleinowego z różnymi substancjami chemicznymi. Pierwszym przebadanym przeze mnie związkiem był popularny interkalator – błękit metylenowy. Analiza przeprowadzona w mieszaninie MB i poszczególnych rodzajów DNA ujawniła, że wchodzi on w silniejsze interakcje z DNA plazmidowym niż chromosomalnym, a jako miejsce oddziaływania z helisą preferuje sekwencje zawierające guaninę i cytozynę. Niestety blokowanie powierzchni czujników sitodrukowanych przez utlenione molekuły kwasu nukleinowego uniemożliwiło użycie ich do badania procesów akumulacji i elektroaktywności różnych rodzajów DNA plazmidowego, a następnie ich oddziaływania z błękitem metylenowym. Dlatego w tych badaniach zastosowałam klasyczny układ elektrod, z elektrodą z węgla szklistego jako pracującą. Jak pokazują otrzymane wyniki, adsorpcja plazmidów na niej jest dużo silniejsza niż DNA chromosomalnego, a procesy elektrodowe, którym ulegają, zależą od trójwymiarowej struktury tych molekuł, determinującej sposób ich ułożenia na powierzchni przetwornika. Rozróżnienie form plazmidów na podstawie ich sygnałów utlenienia nie jest zadaniem łatwym, dlatego też wiedząc na podstawie eksperymentów wykonanych za pomocą układów sitodrukowanych, że oddziaływanie MB z DNA zależy od struktury trzeciorzędowej kwasu, z powodzeniem użyłam tego ligandu jako narzędzia do odróżnienia form plazmidów o różnej wielkości i strukturze przestrzennej. Ważną częścią prowadzonych przeze mnie badań była analiza oddziaływań występujących pomiędzy DNA a daunorubicyną, doksorubicyną i ich pochodnymi, w których grupa aminowa w części daunozaminowej zastąpiona została ugrupowaniem formamidynowym zawierającym resztę aminy cyklicznej. W tym celu przeprowadziłam eksperymenty spektrofotometryczne oraz woltamperometryczne przy użyciu sitodrukowanych bioczujników DNA. Wyniki jednych i drugich wskazują na powinowactwo wszystkich antracyklin do kwasu nukleinowego, które zależy od struktury i stężenia antracyklin oraz sekwencji i stężenia łańcuchów DNA. Pomiary elektrochemiczne dostarczyły jednak pełniejszych informacji na temat interakcji występujących pomiędzy tymi substancjami, ujawniając różnorodność ich mechanizmów. Na podstawie wywołanych obecnością poszczególnych antracyklin zmian sygnałów utlenienia guaniny i adeniny różnych rodzajów DNA (chromosomalnych i oligonukleotydowych) stwierdzono, iż wśród sposobów ich oddziaływania wymienić można: interkalację, połączoną z tworzeniem wiązań wodorowych i kowalencyjnych, elektrostatyczne przyciąganie molekuł antracyklin przez szkielet cukrowo-fosforanowy helisy oraz jej rozplatanie połączone ze zrywaniem wiązań wodorowych pomiędzy komplementarnymi zasadami. Bez względu na mechanizm interakcji w porównaniu ze związkami macierzystymi formamidynowe pochodne wykazywały zwykle silniejsze powinowactwo do DNA oraz większy wpływ na zmianę sygnałów utlenienia zasad azotowych w zakresie niższych stężeń. W odniesieniu do zastosowania chemioterapeutycznego pokazuje to, że obrana droga poszukiwania nowych antracyklin o podwyższonej aktywności antynowotworowej i obniżonej toksyczności jest właściwa. W ramach pracy doktorskiej wykazałam, że elektrochemiczne bioczujniki DNA skonstruowane na elektrodach sitodrukowanych stanowią użyteczne narzędzie analityczne do badania oddziaływań kwasu deoksyrybonukleinowego z różnymi substancjami chemicznymi. Mogą pozwolić one na prowadzenie przy ich użyciu badań przesiewowych, pozwalających z grupy wielu substancji (np. analogów leków antynowotworowych) wyłonić tylko te, które charakteryzują się najsilniejszym powinowactwem do DNA, i w przypadku związków o właściwościach terapeutycznych zakwalifikować je następnie do kosztownych i czasochłonnych testów biologicznych. Wyniki badań eksperymentalnych wykonanych w ramach mojej pracy doktorskiej zostały dotychczas przedstawione w 3 publikacjach naukowych o zasięgu międzynarodowym (w tym 2 w czasopismach z tzw. listy filadelfijskiej, IF = 2,82 oraz IF = 3,95) oraz zaprezentowane podczas 14 wystąpień na międzynarodowych konferencjach naukowych organizowanych w kraju i zagranicą

The structure of drug-deoxydinucleoside phosphate complex; generalized conformational behavior of intercalation complexes with RNA and DNA fragments.

A 2:2 complex of proflavine and deoxycytidylyl-3', 5'-guanosine has been crystallized and its structure determined by x-ray crystallography. The two dinucleoside phosphate strands form self complementary duplexes with Watson Crick hydrogen bonds. One proflavin is asymmetrically intercalated between the base pairs and the other is stacked above them. The conformations of the nucleotides are unusual in that one strand has C3',C2'endomixed sugar puckering and the other has C3',C3' endo deoxyribose sugars. These results show that the conformation of the 3'sugar is of secondary importance to the intercalated geometry